本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種套葉蘭離體培養快繁方法。

背景技術：

“竹有節而嗇花。梅有花而嗇葉，松有葉而嗇香。惟蘭獨并有之。”，這是人們對有“君子花”之稱的蘭花人格化評價。蘭花不僅有自然美的欣賞上達到了至高無上的境界，而且涵蓋了所有花卉的優秀品格而成為最瑧完美的“人格花”，但近年來，由于人們的無度采挖，導致其數量銳減，包括套葉蘭(hippeophyllumsinicum)在內多種蘭花植物已處于瀕危狀態。套葉蘭為蘭科(orchidaceae)套葉蘭屬(hippeophyschltr.)的一種附生蘭。套葉蘭屬約有6種，分布于馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、新幾內亞島、所羅門群島以及我國亞熱帶地區，我國產有2種，分別為套葉蘭(h.sinicum)和寶島套葉蘭(h.pumilum)，分別分布于甘肅南部白龍江流域和臺灣中部。

套葉蘭與春蘭等國蘭屬于長苞組，均為附生草本，具長的橫走根狀莖，根莖上以一定的距離著生葉簇，莖較短，包于葉基之內。花期11月，花形與春蘭相似，呈黃金色，其香味幽遠，開花時節十里飄香，深受人們喜愛，具有有較高的園藝觀賞價值。目前套葉蘭以分株繁殖為主，繁殖效率低，種苗匱乏，導致其未得到廣泛開發應用，絕大部分套葉蘭處于野生狀態，但常被無度采挖和交易，加之生境地的惡化，數量銳減，處于近瀕危狀態，因此很有必要建立套葉蘭的離體培養快繁體系。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種套葉蘭離體培養快繁方法，本發明選擇套葉蘭新生營養芽為外植體，經誘導培養、增殖培養、分化培養、壯苗培養、煉苗和移栽等步驟，其誘導率達到了68％以上，成活率達到了94％以上，實現了套葉蘭的組培快繁，從而實現了本發明的目的。

本發明提供的技術方案為：一種套葉蘭離體培養快繁方法，包括依次進行的如下步驟：獲取套葉蘭植株的外植體、外植體誘導培養、根狀莖的增殖培養、根狀莖的分化培養、壯苗培養、煉苗和移栽；

所述的外植體誘導培養操作的外植體誘導培養基包括：kc培養基、0.5～1.0mg/l6-ba、0.01～0.05mg/lzt、0.1～1.0mg/liba、15～25g/l蔗糖、3.5～5.0g/l瓊脂、30～50ml/l椰子汁，ph為5.4～5.8。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的外植體誘導培養操作的方法為：將采集得到的作為外植體的葉蘭植株消毒后縱向切成0.3～0.5cm的芽點，接種到誘導培養基中暗培養90～120天即可誘導形成長度為2～3cm的根狀莖。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的根狀莖的增殖培養操作所用到的增殖培養基包括：ms、0.1～0.5mg/l6-ba、0.05～0.1mg/lnaa、0.01～0.05mg/lkt、15～25g/l蔗糖、3.5～4.5g/l瓊脂、0.1～0.2g/l活性炭、10～20ml/l椰子汁，ph為5.4～5.8。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的根狀莖的增殖培養操作具體為：將外植體誘導培養操作得到的根狀莖切成長0.5～1.0的莖段并接種到增殖培養基中培養40～50天即可獲得長度為4～6cm的根狀莖。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的根狀莖的分化培養操作所用到的分化培養基包括：ms、0.5～2.0mg/lnaa、0.1～0.5mg/l6-ba、30～35g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂、0.05～0.1g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的根狀莖的分化培養操作的方法為：從根狀莖的增殖培養得到增殖后的根狀莖切成長度為1.5～2.0cm的莖段并接種到分化培養基中培養50～60天即能分化出試管小苗。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的壯苗培養所用到的壯苗培養基包括：1/2ms、0.5～1.0mg/lnaa、0.1～0.5mg/lggr-6、15～20g/l蔗糖、3.5～4.0g/l瓊脂，ph為5.4～5.8。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的壯苗培養操作的方法為：將經過根狀莖的分化培養操作得到的試管小苗根部粘連的根狀莖切除并將小苗轉接至壯苗培養基中培養30～45天即可獲得高3～5cm的套葉蘭試管苗。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，所述的煉苗和移栽的具體操作為：將經壯苗培養操作所得的套葉蘭試管苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗1～2天，洗凈根部的培養基后在溫室自然晾干至根系發白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質中栽培成苗即為套葉蘭種苗。

在上述的套葉蘭離體培養快繁方法中，根狀莖的增殖培養操作、根狀莖的分化培養操作、壯苗培養操作中培養條件均為：培養溫度為25～28℃，光照強度為1500～2000lx，光照時間為12～15小時/天；

外植體誘導培養操作中培養溫度為25～28℃。

有益效果：

本發明采用植物組織培養技術建立了套葉蘭的組培快繁，本發明具有周期短、成本低廉、成活率高等特點，可直接用于套葉蘭種苗的工廠化生產，對于促進套葉蘭的植物資源開發具有重要的現實意義。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。

實施例一

(1)外植體采集：2013年春季，當新芽萌動時，在野外選擇無明顯病害的健壯套葉蘭植株，用解剖刀從基部切取葉鞘未打開的新生營養芽，進行簡單的保水保濕處理后及時帶回實驗室進行消毒處理。

(2)根狀莖的誘導：將外植體在自來水下沖洗過夜，剝去外面的葉鞘至僅剩下兩層葉鞘并置于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒5分鐘，無菌水沖洗2次后剝去一層葉鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒1分鐘。用無菌水漂洗3次后剝去最后一層葉鞘并用無菌水漂洗5次后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無菌解剖刀將外植體縱向切成0.3～0.5cm左右的芽點，接種到誘導培養基中暗培養90天即可誘導形成長度約為2～3cm的根狀莖，污染率低于15％，誘導率達到71.9％。所述的誘導培養基為：kc培養基+1.0mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)+0.05mg/lzt(zeatin)+1.0mg/liba(3-indolebutyricacid)+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+30ml/l椰子汁，ph為5.4。

(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)獲得的根狀莖用無菌解剖刀切成長度約為0.5～1.0cm的莖段并接種到增殖培養基中培養40天即可獲得長度為4～6cm、粗壯的根狀莖，增殖系數為4.7。根據需要，可將新獲得的根狀莖再次切成后0.5～1.0cm的莖段作為增殖材料，并在增殖培養基中進行材料的增殖培養，所述的增殖培養基為：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.05mg/lkt(kinetin)+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭+10ml/l椰子汁，ph為5.4。

(4)分化培養：將步驟(3)獲得的根狀莖切成長度為1.5～2.0cm的莖段并接種到分化培養基中培養50天即能分化出試管小苗，分化率達到79.6％。所述的分化培養基為：ms+2.0mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.05g/l活性炭，ph為5.4。

(5)壯苗培養：切除與步驟(4)所得的試管小苗根部粘連的根狀莖并將小苗轉接至壯苗培養基中培養30天即可獲得高約3～5cm的套葉蘭試管苗，所述的壯苗培養基為：1/2ms+1.0mg/lnaa+0.5mg/lggr-6(中國林業科學研究院研制的雙吉爾ggr-6)+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂，ph為5.4。

(6)煉苗和移栽：將步驟(5)所得健壯的、高約5～7cm的組培苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗1天，洗凈根部的培養基后在溫室自然晾干至根系發白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質中栽培成苗即為套葉蘭種苗，移栽種植30天后成活率達到94.5％。

上述步驟(2)的培養條件為：培養溫度為25℃；

上述步驟(3)～(5)的培養條件為：培養溫度為25℃，光照強度為1500lx，光照時間為12小時/天。

實施例二

(1)外植體采集：2014年春季，當套葉蘭新芽萌動時，在野外選擇無明顯病害的健壯植株，用解剖刀從基部切取葉鞘未打開的新生營養芽，進行保水保濕處理后及時帶回實驗室進行消毒處理。

(2)根狀莖的誘導：將外植體在自來水下沖洗過夜，剝去外面的葉鞘至僅剩下兩層葉鞘并置于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒8分鐘，無菌水沖洗2次后剝去一層葉鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒2分鐘。用無菌水漂洗4次后剝去最后一層葉鞘并用無菌水漂洗6次后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無菌解剖刀將外植體縱向切成0.3～0.5cm左右的芽點，接種到誘導培養基中暗培養105天即可誘導形成長度約為2～3cm的根狀莖，污染率低于10％，誘導率達到79.8％。所述的誘導培養基為：kc培養基+0.7mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)+0.03mg/lzt(zeatin)+0.5mg/liba(3-indolebutyricacid)+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+40ml/l椰子汁，ph為56。

(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)獲得的根狀莖用無菌解剖刀切成長度約為0.5～1.0cm的莖段并接種到增殖培養基中培養45天即可獲得長度為4～6cm、粗壯的根狀莖，增殖系數為4.71。根據需要，可將新獲得的根狀莖再次切成后0.5～1.0cm的莖段作為增殖材料，并在增殖培養基中進行材料擴繁，所述的增殖培養基為：ms+0.3mg/l6-ba+0.07mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.03mg/lkt(kinetin)+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.15g/l活性炭+15ml/l椰子汁，ph為5.6。

(4)分化培養：將步驟(3)獲得的根狀莖切成長度為1.5～2.0cm的莖段并接種到分化培養基中培養56天即能分化出試管小苗，分化率達到81.9％。所述的分化培養基為：ms+1.3mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.3mg/l6-ba+33g/l蔗糖+3.7g/l瓊脂+0.07g/l活性炭，ph為5.6。

(5)壯苗培養：切除與步驟(4)所得的試管小苗根部粘連的根狀莖并將小苗轉接至壯苗培養基中培養37天即可獲得高約3～5cm的套葉蘭試管苗，所述的壯苗培養基為：1/2ms+0.7mg/lnaa+0.3mg/lggr-6(中國林業科學研究院研制的雙吉爾ggr-6)+17g/l蔗糖+3.70g/l瓊脂，ph為5.6。

(6)煉苗和移栽：將步驟(5)所得健壯的、高約5～7cm的組培苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗1天，洗凈根部的培養基后在溫室自然晾干至根系發白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質中栽培成苗即為套葉蘭種苗，移栽30后成活率達到95％以上。

上述步驟(2)的培養條件為：培養溫度為27℃；

上述步驟(3)～(5)的培養條件為：培養溫度為27℃，光照強度為1700lx，光照時間為14小時/天。

實施例三

(1)外植體采集：2015年春季，當套葉蘭新芽萌動時，在野外選擇無明顯病害的健壯植株，用解剖刀從基部切取葉鞘未打開的新生營養芽，進行保水保濕處理后及時帶回實驗室進行消毒處理。

(2)根狀莖的誘導：將外植體在自來水下沖洗過夜，剝去外面的葉鞘至僅剩下兩層葉鞘并置于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘，無菌水沖洗3次后剝去一層葉鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘。用無菌水漂洗5次后剝去最后一層葉鞘并用無菌水漂洗7次后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，用無菌解剖刀將外植體縱向切成0.3～0.5cm左右的芽點，接種到誘導培養基中暗培養120天即可誘導形成長度約為2～3cm的根狀莖，污染率低于5％以下，誘導率為68.5％。所述的誘導培養基為：kc培養基+1.0mg/l6-ba(6-benzylaminopurine)+0.05mg/lzt(zeatin)+1.0mg/liba(3-indolebutyricacid)+25g/l蔗糖+5.0g/l瓊脂+50ml/l椰子汁，ph為5.8。

(3)根狀莖的增殖：將步驟(2)獲得的根狀莖用無菌解剖刀切成長度約為0.5～1.0cm的莖段并接種到增殖培養基中培養50天即可獲得長度為4～6cm、粗壯的根狀莖，增殖系數為4.73。根據需要，可將新獲得的根狀莖再次切成后0.5～1.0cm的莖段作為增殖材料，并在增殖培養基中進行材料擴繁，所述的增殖培養基為：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.05mg/lkt(kinetin)+25g/l蔗糖+4.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭+20ml/l椰子汁，ph為5.8。

(4)分化培養：將步驟(3)獲得的根狀莖切成長度為1.5～2.0cm的莖段并接種到分化培養基中培養60天即能分化出試管小苗，分化率為80.5％。所述的分化培養基為：ms+2.0mg/lnaa(1-naphthylaceticacid)+0.5mg/l6-ba+35g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.8。

(5)壯苗培養：切除與步驟(4)所得的試管小苗根部粘連的根狀莖并將小苗轉接至壯苗培養基中培養45天即可獲得高約3～5cm的套葉蘭試管苗，所述的壯苗培養基為：1/2ms+1.0mg/lnaa+0.5mg/lggr-6(中國林業科學研究院研制的雙吉爾ggr-6)+20g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂，ph為5.8。

(6)煉苗和移栽：將步驟(5)所得健壯的、高約5～7cm的組培苗在溫室的自然光下打開組培瓶蓋子煉苗2天，洗凈根部的培養基后在溫室自然晾干至根系發白，在體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質中栽培成苗即為套葉蘭種苗，移栽30后成活率達100％。

上述步驟(2)的培養條件為：培養溫度為28℃；

上述步驟(3)～(5)的培養條件為：培養溫度為28℃，光照強度為2000lx，光照時間為15小時/天。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。