本發明屬于植物篩選育種領域，具體涉及一種油亮型抗病砧用南瓜材料的篩選方法。

背景技術：

南瓜資源豐富多樣，但我國對很多優秀的南瓜種質資源沒有作出系統完善的鑒定和評價，材料的利用率不高。

近年來隨著嫁接技術的推廣和公眾的認可，嫁接黃瓜的種植面積也在不斷擴大，同時規模化種植和連作加重導致的嫁接病害也日趨嚴重。而南瓜的主要病害如病毒病、枯萎病、白粉病等的抗病性研究滯后于生產。

上世紀80年代以來，國內一些育種單位開始砧用南瓜方面的育種研究，目前我國南瓜品種選育主要是利用雜種優勢，而有關南瓜雜種優勢、性狀遺傳規律等基礎研究報道較少，因此很多目標性狀的遺傳與穩定規律不為人知，導致目前砧用南瓜選育處于比較混亂的狀態，利用傳統的雜種優勢育種最常用的篩選方法是通過農家、市場和購買等方式搜集南瓜材料及品種，進行多代定向選育成為性狀穩定的自交系，株系f5代性狀穩定后再進行嫁接試驗，進行親和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目標性狀的篩選。

其中抗病性的篩選方法目前有兩種：(1)以采取病圃地塊種植鑒定為主要手段，劃定常年實驗地，在嫁接品種主栽區采集病害嚴重的土壤樣本，以每季栽培定向穴施混拌病土定植，在栽培過程中創造利于發病的條件(高溫、高濕等)，觀察目標材料的發病情況。(2)從種子發芽期開始到整個生長期依據病害的發病時間與要求的環境特點實時接種病原微生物，依據其發病指數篩選材料。

親和力和油亮性篩選方法為：將純合材料與接穗嫁接，觀察其成活率，定植后能完成正常的成活、伸蔓、開花、結果的生長過程且在行業標準以上，即為親和力合格；黃瓜嫁接后，以黃瓜實生苗(品種不脫蠟粉)為空白對照，黃瓜瓜條脫去蠟粉，依據其油亮程度比較篩選。

現有的篩選方法存在以下四個問題：

一是選育時間長，管理成本高。傳統的材料純化與創造是將資源收集后按類型整理歸類，進行種植評價，自交留種，結合育種目標進行優劣評價篩選，目標性狀穩定得到種子后再嫁接進行親和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目標性狀的篩選。整個流程下來大約需要五年左右的時間。

二是育種目標性狀明確，但篩選過程中極易丟失。現有的材料純化與創造是將資源收集后按類型整理歸類，進行種植評價，自交留種，結合育種目標進行優劣評價篩選，目標性狀穩定后再嫁接進行親和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目標性狀的篩選。這種篩選方式只能將南瓜實生苗性狀表現好的篩選出來，可能選丟了用作砧木時某些性狀表現突出的好材料。

三是砧木材料自交純合篩選過程中，每個世代種植數量、入選數量、選擇手段不規范。現有技術在砧木材料篩選過程中，篩選方向(1)要求種子肉薄、果腔大、種子多且仁厚，(2)抗性、耐高溫、高濕或耐低溫，(3)長勢、根系發達、植株旺盛，(4)抗病性。根據這幾項選育目標篩選出一定數量的材料加代至株系穩定，在篩選過程中工作量大，入選數量多(一般需要選近100株左右)，在篩選完成后進行嫁接試驗，親和力和共生力測定時，需要每個株系的每份材料都進行大量的試驗，數據才能具有一定的說服力，這種不規范的篩選方式會隨著自交系的加代弊端越來越多。

四是黃瓜育種綜合抗性水平有待提高。目前威脅黃瓜設施生產的病害主要有地上病害和地下病害兩部分，地下病害主要指各種土傳病害，如枯萎病、疫病、根腐病等等，地上部分病害主要指黃瓜的葉部病害如白粉病、病毒病，霜霉病，灰霉病等等，近年來隨著嫁接苗應用的普及，地下各種土傳病害得到重視，但砧木的抗葉部病害被忽視，有關研究表明嫁接有一定誘導作用，來自砧木的遺傳信號物質能通過胞間連絲和維管束轉移到接穗中并調控接穗的生長發育模式，砧木的抗葉部病害能力能傳導到接穗當中，選育對接穗葉部抗病性影響強的砧木材料，可有效提高黃瓜育種的綜合抗病水平。在南瓜材料和黃瓜嫁接共同生長的一個時期內，同時鑒定南瓜葉部病害抗病能力和黃瓜植株的葉部抗病能力，選出對黃瓜接穗葉部抗病能力影響大的南瓜材料，不僅能夠提高農戶栽培種植黃瓜植株的綜合抗病水平，且可大大縮短育種時間。

技術實現要素：

針對現有技術中南瓜砧木篩選的問題，本發明的目的是要提供一種育種年限短、效率高、手段規范、且能同時保留南瓜實生苗及砧木優良性狀的油亮型抗病砧用南瓜材料的篩選方法。

一種油亮型抗病砧用南瓜材料的篩選方法，步驟如下：

(1)嫁接：收集不同種類的南瓜種質材料，并將南瓜種子播種，每個品種播種15-25株，待南瓜苗長至兩葉一心時嫁接黃瓜接穗，嫁接前將砧木南瓜的真葉掐掉，留住生長點；嫁接苗定植10-15株，并保留兩條蔓，一條黃瓜蔓，一條南瓜蔓；

(2)黃瓜油亮性篩選：以不脫蠟粉的黃瓜實生苗為空白對照，嫁接苗之間進行比較篩選，選出黃瓜脫蠟粉最明顯、亮度最好的材料，在黃瓜結瓜2-3條后及時將黃瓜蔓去除，只保留南瓜蔓以待鑒定篩選抗病性狀或留種；

(3)南瓜砧木抗病性篩選：對嫁接苗進行抗枯萎病、抗白粉病、抗cgmmv的篩選，抗病且黃瓜油亮性材料自交并保留f1代南瓜種子；南瓜砧木抗枯萎病篩選在嫁接苗定植時開始，抗白粉病和cgmmv篩選在嫁接苗定植后開始，或在去掉黃瓜蔓后開始；

(4)穩定性狀的篩選：將f1代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟(1)-(3)篩選出f2代南瓜種子；將f2代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟(1)-(3)篩選出f3代南瓜種子；將f3代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟(1)-(3)篩選出f4代南瓜種子；將f4代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟(1)-(3)篩選出f5代南瓜種子，即為穩定遺傳材料。

進一步地，步驟(1)中在嫁接前，將砧木、接穗、嫁接針、嫁接刀和手都用普力克溶液殺菌，防止嫁接傷口感染。

進一步地，步驟(1)中采用插接方法嫁接，操作方便，成活率高，接口位置高，防病效果好。

進一步地，步驟(1)中嫁接完后用地膜遮陰保濕3-4天，之后掀開地膜，一般剛掀開地膜，苗子比較脆弱，為防止閃苗，地膜不宜長時間掀開，以嫁接苗不萎蔫為前提，合理覆蓋地膜，嫁接5-7天后嫁接苗基本完全愈合，可撤去地膜，若光照不強，10天后可撤去遮陰網，以嫁接苗不萎蔫為前提。

進一步地，步驟(1)中嫁接苗愈合期間，南瓜比接穗的生長速度要快，掀開地膜后去掉1-2片南瓜真葉，防止遮光導致接穗愈合慢同時與接穗爭奪養分。

進一步地，步驟(3)中抗枯萎病的篩選采用浸根接種法：準備濃度為10⁶-10⁷個孢子/ml的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，將2片真葉期的嫁接苗從營養土中取出，水洗沖掉根系表面的營養土，剪掉嫁接苗1/5-1/3的根系造成侵染傷口，將剩下的根系全部沒于孢子懸浮液中，8-12分鐘后取出，然后定植于試驗地中；每份材料須接種至少10株嫁接苗作為重復；定植后創造利于致病菌發病的條件(溫度21-30℃)，觀察目標材料的發病情況，接種后18-25天，植株發病情況穩定，即可評價出品種的抗病性。

更進一步地，所述尖孢鐮刀菌孢子懸浮液的制備方法為：取枯萎病發病嚴重(4級)的南瓜植株，從發病部位采集枯萎莖稈，在無菌條件下，放入pda(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)平板上在28℃的培養箱中培養2天后觀察菌落情況，挑取菌絲進行純化和培養，培養8-10天，待純化的菌絲長滿平板然后打菌餅于pdb(馬鈴薯液體培養基)中，25℃，180rpm，在恒溫搖床內搖菌24-36小時，鏡檢分生孢子，并用血球計數板測定孢子濃度。然后用滅菌水制成所需濃度的懸浮液。

進一步地，步驟(3)中抗白粉病的篩選采用噴霧接種法接種，用噴霧器將濃度為10⁵-10⁶個孢子/ml的白粉病菌孢子懸浮液均勻的噴施在南瓜老葉的正反兩面，噴施至菌液布滿葉片但不下滴，接種后保持溫度20～25℃，濕度為70-80％，黑暗培養20-30小時，然后轉入晝溫22-28℃，夜溫15-20℃的溫室內正常管理，接種7天開始觀察，20天內病情基本穩定。白粉病屬于高溫低濕型，在溫度過高或過低的環境不適合其病原孢子發病，因此在抗性篩選時溫度和濕度都需嚴格控制。

更進一步地，所述白粉病菌孢子懸浮液的制備方法為：直接在田間采集新鮮葉子上粉末狀分生孢子，加入蒸餾水，離心3～5分鐘，鏡檢并用血球計數板計數，用無菌水配制成濃度為10⁵-10⁶個孢子/ml的懸浮液。從懸浮液配制好到接種不能超過2小時。

進一步地，抗黃瓜綠斑駁花葉病毒(cgmmv)的篩選采用摩擦接種法接種，選擇生長健康的南瓜葉，在葉片上均勻地撒少量金剛砂，用紗布蘸取病毒接種液，在葉面朝一個方向輕輕摩擦3-5次；7天后開始觀察癥狀，每隔7天調查1次，一個月即能穩定發病癥狀得到鑒定結果。

更進一步地，所述病毒接種液的制備方法為：將cgmmv在南瓜葉上擴繁，取發病明顯(7級以上)的新鮮葉片，按照質量體積比1:10加入磷酸緩沖液，并在研缽中充分研磨，紗布過濾，現配現用。

進一步地，在材料株系篩選到第5代性狀基本穩定后，開始用盆栽驗證試驗地鑒定結果，在保證包含花盆、盆栽用土、嫁接苗在內的試驗用品不攜帶任何致病菌的條件下進行致病菌的接種，從而驗證篩選的準確性。

本發明在一個嫁接栽培世代中解決育種目標選育和抗病力篩選的主要內容，包括：南瓜砧木的抗cgmmv、白粉病、枯萎病鑒定篩選；砧木南瓜的嫁接親和力，籽粒飽滿度等指標的鑒定篩選；黃瓜嫁接后的瓜條油亮性狀的鑒定篩選。每一代自交系都進行嫁接試驗，能在每一代都淘汰一部分親和力或者共生力差、抗病性差的材料，材料優中選優，從而事半功倍。相比于現有篩選南瓜砧木材料的方法，本發明的方法具備以下有益效果：

(1)縮短選育年限，提高篩選準確性。傳統篩選方法是對砧用南瓜材料抗病性篩選并得到種子后，再進行嫁接試驗，鑒定這一材料的砧用表現，如嫁接親和力及長勢，本發明方法在砧木材料篩選或加代過程中就進行嫁接試驗，利用嫁接技術，直接以砧用目標性狀為出發點，將處在fn代的材料嫁接，同時留住自身的南瓜生長點，這樣在整個生長期既能觀察黃瓜嫁接后油亮性表現，又能進行實生苗抗病性等一系列目標性狀的評價篩選，根據材料的田間表現結合目標性狀，優勢突出的材料留住南瓜蔓自交進行下一步選育工作，從而縮短一半的選育時間。

(2)每個世代種植數量，入選數量，選擇手段規范且評價方法科學，每一代自交系都進行嫁接試驗，能在每一代都淘汰一部分親和力或者共生力差的材料，材料優中選優。

(3)篩選出的材料更加準確，有效。在抗枯萎病篩選過程中，用培養基培養的病原微生物制成孢子懸浮液接種到砧木根部的方法代替傳統直接定植后在根部撒病土的方式。通過人工對病原菌濃度進行調控，可縮短材料的發病周期，提高篩選效率，對淘汰的材料及時拔除，降低管理成本；也保證了每株嫁接苗接種的病原菌數量相同，控制變量，保證了其篩選結果的準確性。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明實施例中所用到的材料如下：

pda(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)：200g土豆，20g葡萄糖，10g瓊脂，1l水，121℃高壓滅菌20min。

pdb(馬鈴薯液體培養基)：200g土豆，20g葡萄糖，1l水，121℃高壓滅菌20min。

枯萎病病情分級標準：0級：莖基部無褐色；1級：莖基部褐變；2級：莖基部1/2褐變；3級：莖基部2/3以上褐變；4級：莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死。

白粉病病情分級標準：0級：無病癥；1級：葉正面的病斑面積小于30％，葉背面無病斑；3級：葉正面的病斑面積大于30％，葉背面的病斑面積小于10％；5級：葉正面的病斑面積大于30％，葉背面的病斑面積大于10％，葉柄上出現少量病斑；7級：葉正面覆蓋霉層，葉背面的病斑面積大于10％，葉柄上有較多病斑，主莖上出現少量病斑；9級：葉正面覆蓋霉層，葉背面的病斑面積大于10％，葉柄上有較多病斑，主莖上覆蓋霉層。

黃瓜綠斑駁花葉病毒(cgmmv)病情分級標準：0級：無任何癥狀；1級：心葉明脈，輕微花葉；3級：心葉及少數葉片花葉；5級：心葉及多數葉片花葉，少數葉片皺縮、畸形，或明脈、葉柄有褐色壞死斑點，植株輕微矮化；7級：重花葉，多數葉片皺縮，變細呈畸形或莖部有褐長條斑，植株矮化；9級：重花葉，病葉嚴重畸形，植株嚴重矮化，或成叢枝狀，甚至枯死。

發病率％＝(發病株數/調查總株數)*100％。

按照本發明方法篩選油亮型抗病砧用南瓜材料，具體步驟如下：

第一步，嫁接。

收集不同種類的南瓜種質材料，將南瓜種子播種，每種種質材料種植20株，待南瓜苗長至兩葉一心時嫁接黃瓜接穗，嫁接前將砧木南瓜的真葉掐掉，留住生長點。砧木、接穗、嫁接針、嫁接刀和手在嫁接前都用普力克溶液殺菌，防止嫁接傷口感染。采用插接方法嫁接，操作方便，成活率高，接口位置高，防病效果好。

嫁接完后用地膜遮陰保濕3天，之后掀開地膜，嫁接6天后嫁接苗基本完全愈合，撤去地膜。掀開地膜后適當去掉1-2片南瓜真葉。

第二步，嫁接苗抗枯萎病的篩選。

尖孢鐮刀菌孢子懸浮液的制備方法：取枯萎病發病嚴重的南瓜植株，從發病部位采集枯萎莖稈，在無菌條件下，放入pda平板上在28℃的培養箱中培養2天后觀察菌落情況，挑取菌絲進行純化和培養，培養9天，待純化的菌絲長滿平板然后打菌餅于pdb中，25℃，180rpm，在恒溫搖床內搖菌30小時，鏡檢分生孢子，并用血球計數板測定孢子濃度。然后用滅菌水制成濃度為10⁷個孢子/ml的懸浮液。

采用浸根接種法篩選：將2片真葉期的嫁接苗從營養土中取出，水洗沖掉根系表面的營養土，剪掉嫁接苗1/4的根系造成侵染傷口，將剩下的根系全部沒于孢子懸浮液中，10分鐘后取出，然后定植于試驗地中；每份材料接種10株嫁接苗作為重復；定植后創造利于致病菌發病的條件(溫度25℃)，觀察目標材料的發病情況，期間將發病植株(2級及以上)及時拔除，接種后20天，植株發病情況穩定，即可評價出品種的抗病性。剩余的抗枯萎病嫁接苗繼續用于其他性狀的篩選。

第三步，嫁接苗抗白粉病的篩選。

白粉病菌孢子懸浮液的制備：直接在田間采集新鮮葉子上粉末狀分生孢子，加入蒸餾水，離心3～5分鐘，鏡檢并用血球計數板計數，用蒸餾水配制成濃度為10⁶個孢子/ml的懸浮液。從懸浮液配制好到接種不能超過2小時。

采用刷葉接種法篩選：第二步剩余嫁接苗用噴霧器將濃度為10⁶個孢子/ml的白粉病菌孢子懸浮液均勻的噴施在南瓜老葉的正反兩面，噴施至菌液布滿葉片但不下滴，接種后保持溫度22℃，濕度為75％，黑暗培養24小時，然后轉入晝溫25℃，夜溫16℃左右的溫室內正常管理，接種7天開始觀察，期間將發病植株(3級及以上)及時拔除，20天內病情基本穩定，作出抗病性評價。

第四步，黃瓜油亮性篩選。

定植30天左右時黃瓜瓜條長成，此時正處在抗白粉病性狀篩選期，兩種性狀篩選同時進行。以黃瓜實生苗(品種為不脫蠟粉)為空白對照，嫁接苗之間進行比較篩選，選出脫蠟粉最明顯、亮度最好的材料。在黃瓜結瓜2-3條可鑒定出油亮性后及時將黃瓜蔓去除，只保留南瓜蔓以待鑒定篩選抗cgmmv性狀并留種。期間將脫蠟粉差的植株及時拔除，剩余的抗枯萎病、抗白粉病、油亮性嫁接苗繼續用于其他性狀的篩選。

第五步，南瓜砧木抗cgmmv性篩選。

將從商業渠道購買的cgmmv病毒在南瓜葉上擴繁，取發病明顯的新鮮葉片，按照質量體積比1:10加入磷酸緩沖液，并在研缽中充分研磨，紗布過濾，現配現用。

采用摩擦接種法篩選：選擇生長健康的南瓜葉，在葉片上均勻地撒少量金剛砂，用紗布蘸取病毒接種液，在葉面朝一個方向輕輕摩擦4次；7天后開始觀察癥狀，期間將發病植株(3級及以上)及時拔除，每隔7天調查1次，一個月即能穩定發病癥狀得到鑒定結果。剩余的抗cgmmv、抗枯萎病、抗白粉病、油亮性嫁接苗，單株自交得到f1代南瓜種子。

第六步，穩定性狀的篩選。

將f1代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復第一至五步得到f2代南瓜種子；將f2代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟第一至五步得到f3代南瓜種子；將f3代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟第一至五步得到f4代南瓜種子；將f4代南瓜種子播種得到南瓜苗，重復步驟第一至五步得到f5代南瓜種子，為穩定遺傳材料。

第七步，篩選準確性驗證。

在材料株系篩選到第5代性狀基本穩定后，開始用盆栽驗證試驗地鑒定結果，在保證包含花盆、盆栽用土、嫁接苗在內的試驗用品不攜帶任何致病菌的條件下進行致病菌的接種，從而驗證篩選的準確性。

表1本發明篩選到的南瓜砧木性狀

本發明可用五個生長周期選育出油亮型抗病砧用南瓜，育種時間相比于傳統方法縮短一半。

應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。