本發明涉及農業種植技術領域，具體涉及一種柳樹幼胚成苗組織培養方法。
背景技術：
柳樹自然雜交的種子很細小，千粒重也就在0.4克左右，而在室內雜交的柳樹種子千粒重就更低。利用室內雜交的柳樹種子在后期播種成苗過程中，由于柳樹種子本身的營養成份不足，在生長過程中抵御外界不利環境因素的能力差，進而導致成苗率低，成苗的比率約為30％。
技術實現要素：
為克服現有技術所存在的缺陷，現提供一種柳樹幼胚成苗組織培養方法，以解決在利用室內雜交的柳樹種子播種，成苗率低的問題。
為實現上述目的，提供一種柳樹幼胚成苗組織培養方法，包括：
采集未成熟的柳樹種子；
將所述柳樹種子消毒處理并從所述柳樹種子中取得幼胚；
將所述幼胚經由誘導培養形成胚性愈傷組織；
將所述胚性愈傷組織經由芽分化培養形成叢生芽；
將所述叢生芽經由生根培養形成柳樹苗。
進一步的，所述采集未成熟的柳樹種子的步驟包括于柳樹蒴果的果皮開裂前且所述果皮呈黃色時，從所述柳樹蒴果中采集所述柳樹種子。
進一步的，所述將所述幼胚經由誘導培養形成胚性愈傷組織步驟包括將所述幼胚無菌接種到誘導培養基中，使所述幼胚形成所述胚性愈傷組織。
進一步的，所述將所述胚性愈傷組織經由芽分化培養形成叢生芽步驟包括將所述胚性愈傷組織轉接到芽分化培養基中，使所述胚性愈傷組織形成所述叢生芽。
進一步的，所述將所述叢生芽經由生根培養形成柳樹苗步驟包括將所述叢生芽轉接到生根培養基中，使所述叢生芽生根形成所述柳樹苗。
進一步的，所述誘導培養基、所述芽分化培養基及所述生根培養基均以改良型wpm培養基為基礎培養基，所述改良型wpm培養基包括濃度為270mg/l～290mg/l的nh4no3、濃度為760mg/l～770mg/l的k2so4、濃度為90mg/l～110mg/l的kh2po4、濃度為145mg/l～155mg/l的mgso4·7h2o以及濃度為390mg/l～400mg/l的ca(no3)2·4h2o。
進一步的，所述誘導培養基為每升所述改良型wpm培養基添加0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸、2mg～2.4mg的6-芐氨基腺嘌呤、195mg～205mg鹽酸硫素。
進一步的，所述芽分化培養基為每升所述改良型wpm培養基添加0.5mg～0.7mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸、290mg～310mg的赤霉素。
進一步的，所述生根培養基為每升所述改良型wpm培養基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。
本發明的有益效果在于，本發明柳樹幼胚成苗組織培養方法尤為適用于室內雜交柳樹的種子幼胚成苗，在適宜的時機采集未成熟的室內雜交柳樹種子，進而獲得柳樹幼胚并通過組織培養成柳樹樹苗，能有效提高室內雜交柳樹的種子成苗率。
具體實施方式
以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。
本發明柳樹幼胚成苗組織培養方法適用于柳樹種子。柳樹是植物界被子植物門雙子葉植物綱原始花被亞綱楊柳目楊柳科柳屬，主要產自北半球溫帶地區，寒帶次之，熱帶和南半球極少，原產地為中國大陸南方。柳樹是一類植物的總稱，柳樹的品種包括旱柳、腺柳、垂柳等品種。柳屬多為灌木，稀喬木，無頂芽，合軸分枝，雄蕊數目較少，蟲媒花等特征表明，較楊屬與鉆天柳屬進化。
柳屬的形態特征如下：喬木或匍匐狀、墊狀、直立灌木。枝圓柱形，髓心近圓形。無頂芽，側芽通常緊貼枝上，芽鱗單一。葉互生，稀對生，通常狹而長，多為披針形，羽狀脈，有鋸齒或全緣；葉柄短；具托葉，多有鋸齒，常早落，稀宿存。葇荑花序直立或斜展，先葉開放，或與葉同時開放，稀后葉開放；苞片全緣，有毛或無毛，宿存，稀早落；雄蕊2-多數，花絲離生或部分或全部合；腺體1-2(位于花序軸與花絲之間者為腹腺，近苞片者為背腺)；雌蕊由2心皮組成，子房無柄或有柄，花柱長短不一，或缺，單1或分裂，柱頭1-2，分裂或不裂。柳樹的果實為蒴果，成熟后2瓣裂，內藏種子多枚，種子上具有一叢綿毛，柳樹種子小。在成熟的過程中，蒴果由黃色向暗褐色慢慢轉變并干燥開裂。
柳樹自然雜交的種子很細小，千粒重約為0.4克，而在室內雜交的柳樹種子千粒重更小。直接利用室內雜交的柳樹種子播種成苗，后期的成苗率極低。本發明柳樹幼胚成苗組織培養方法尤為適用于室內雜交柳樹的種子幼胚成苗，能有效提高室內雜交柳樹的種子成苗率，柳樹試管苗成活率達70％，比采用播種成苗的成活率提高30％左右。
本發明提供了一種柳樹幼胚成苗組織培養方法，包括以下步驟：
s1：采集未成熟的柳樹種子。
在室內柳樹雜交授粉后的25天～26天時，采集呈黃色快成熟且還末開裂的柳樹蒴果，并從上述柳樹蒴果中取出柳樹種子。
s2：將未成熟的柳樹種子消毒處理并于消毒后的柳樹種子中取得幼胚。
具體的，包括以下步驟：
將采集的柳樹種子，先用無菌水沖洗10分種后，移至超凈工作臺上。
繼續用75％的酒精對超凈工作臺內的柳樹種子進行表面消毒30秒。
將已用75％的酒精消毒的柳樹種子置于0.1％的升汞溶液中滅菌10分鐘。
從升汞溶液中取出柳樹種子并用無菌水沖洗3次～4次，再用濾紙吸干柳樹種子的表面的水分。
將表面的水分已吸干的柳樹種子的種皮切開，挑出柳樹種子的幼胚。
s3：將幼胚無菌接種到以改良型wpm培養基為基本培養基的誘導培養基中，使幼胚形成胚性愈傷組織。
具體的，包括以下步驟：
誘導培養基的制備。
準備改良型的wpm培養基。
本發明針對傳統wpm培養基配方進行了改進，形成改良型wpm培養基。
傳統的wpm培養基配方如下：
本發明的改良型wpm培養基的配方如下：
作為一種較佳的實施方式，本發明的改良型wpm培養基的配方如下：
誘導培養基是以改良型wpm培養基為基礎培養基。
具體的，誘導培養基為每升改良型wpm培養基中添加0.8mg～1.2mg的二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2mg～2.4mg的6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、195mg～205mg鹽酸硫素。
作為一種較佳的實施方式，誘導培養基為每升所述改良型wpm培養基添加1.0mg的二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2.2mg的6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、200mg鹽酸硫素。
將幼胚無菌接種到誘導培養基中，使幼胚形成胚性愈傷組織。
將接種到誘導培養基中的幼胚先暗培養2周后，再光照培養約26天形成胚性愈傷組織后。
s4：將胚性愈傷組織轉接到以改良型wpm培養基為基本培養基的芽分化培養基中，使胚性愈傷組織形成叢生芽。
具體的，包括以下步驟：
芽分化培養基的制備。
芽分化培養基是以上述改良型wpm培養基為基本培養基。芽分化培養基為每升改良型的wpm培養基在添加0.5mg～0.7mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.15mg～0.25mg的萘乙酸(naa)、290mg～310mg的赤霉素(ga3)。
作為一種較佳的實施方式，芽分化培養基為每升改良型的wpm培養基添加0.6mg的6-芐氨基腺嘌呤、0.2mg的萘乙酸(naa)、300mgd赤霉素(ga3)。
再將胚性愈傷組織轉接到芽分化培養基中約35天，使胚性愈傷組織形成高達4cm～5cm叢生芽。
s5：將叢生芽轉接到以改良型wpm培養基為基本培養基的生根培養基中，使叢生芽生根形成柳樹苗。
具體的，包括以下步驟：
s51：制備生根培養基。
生根培養基以上述改良型wpm培養基為基本培養基。生根培養基為每升所述改良型的wpm培養基添加0.75mg～0.85mg的萘乙酸、950mg～1050mg的活性炭。
作為一種較佳的實施方式，生根培養基為每升改良型的wpm培養基中添加0.8mg的萘乙酸、1000mg的活性炭。
s52：將高達4cm～5cm的叢生芽切接成單芽。
s53：將單芽轉接在生根培養基中，培養32天后即可生根成柳樹試管苗。柳樹試管苗成苗培養期間，外部環境以普通日光燈為光源，光照強度為1500-2000lx，每天光照時間為20小時，溫度25±2℃，相對濕度在65％～70％。
s54：煉苗、栽培。
將柳樹試管苗在常溫下開瓶進行煉苗2天。
取出并洗凈柳樹試管苗，將洗凈的柳樹試管苗移栽到基質(質量比為石炭土：蛭石＝1：2)保持溫度24℃左右，相對濕度75％左右，培養兩個星期可適應存活，柳樹試管苗成活率達70％，比采用播種成苗的成活率提高30％左右。
柳樹自然雜交的種子很細小，千粒重約為0.4克，而在室內雜交的柳樹種子千粒重更小。直接利用室內雜交的柳樹種子播種成苗，后期的成苗率極低。本發明柳樹幼胚成苗組織培養方法尤為適用于室內雜交柳樹的種子幼胚成苗，在適宜的時機采集未成熟的室內雜交柳樹種子，進而獲得柳樹幼胚并通過組織培養成柳樹樹苗，能有效提高室內雜交柳樹的種子成苗率。在采用以改良型的wpm培養基為基本培養基的誘導培養基、芽分化培養基以及生根培養基，能使得柳樹幼胚組培成苗率達到90％以上。
需要說明的是，本說明書所示的結構、比例、大小等，均僅用以配合說明書所揭示的內容，以供熟悉此技術的人士了解與閱讀，并非用以限定本發明可實施的限定條件，故不具技術上的實質意義，任何結構的修飾、比例關系的改變或大小的調整，在不影響本發明所能產生的功效及所能達成的目的下，均應仍落在本發明所揭示的技術內容得能涵蓋的范圍內。同時，本說明書中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中間”及“一”等的用語，亦僅為便于敘述的明了，而非用以限定本發明可實施的范圍，其相對關系的改變或調整，在無實質變更技術內容下，當亦視為本發明可實施的范疇。
以上結合實施例對本發明進行了詳細說明，本領域中普通技術人員可根據上述說明對本發明做出種種變化例。因而，實施例中的某些細節不應構成對本發明的限定，本發明將以所附權利要求書界定的范圍作為保護范圍。