本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種用于樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞凍存液。
背景技術(shù)：
：臨床常需大量成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞(dcs)，但機(jī)體內(nèi)天然dcs含量少，難以滿足臨床應(yīng)用的需要，只能通過(guò)體外培養(yǎng)大量獲得。成熟dcs需要大量細(xì)胞因子維持，花費(fèi)高、易污染，不利于dcs的臨床應(yīng)用，因此可將制備出的dcs冷凍保存，需要時(shí)復(fù)蘇即可。為了保持凍存dcs的復(fù)蘇率和免疫活性，選擇合適的冷凍保存方法極其重要。目前，dcs的凍存方法是采用含有10％二甲基亞砜(dmso)、20％胎牛血清(fcs)的凍存液二步降溫。這種方法存在兩個(gè)明顯的不足：第一，fcs成分復(fù)雜，會(huì)向dcs中引入污染物和致病原，安全性不易把控；目前有進(jìn)口凍存液不含fcs(如日本zenoaq公司生產(chǎn)的cellbanker細(xì)胞凍存液)，但是價(jià)格昂貴，應(yīng)用成本過(guò)高，限制了其在臨床中的使用，尤其是發(fā)展中國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家；第二，雖然dmso是常用的凍存保護(hù)劑，但這不代表其不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成凍存損傷(深低溫時(shí)dmso的細(xì)胞毒性受到抑制，復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快，盡快洗掉二甲基亞砜，否則會(huì)造成對(duì)細(xì)胞嚴(yán)重的毒；但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，速度再快，細(xì)胞毒不可避免)，這種損傷限制了復(fù)蘇率的進(jìn)一步提高；除非開(kāi)發(fā)新的可以替代dmso的試劑或降低dmso的比例。為了降低dcs的凍存成本，打破進(jìn)口凍存液的壟斷，申請(qǐng)人致力于開(kāi)發(fā)擁有自主產(chǎn)權(quán)的dcs凍存液，在保證dcs凍存復(fù)蘇率和免疫活性的前提下降低成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在降低dcs的凍存成本，打破進(jìn)口凍存液的壟斷，提供一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、高效的dcs凍存液，在保證dcs凍存復(fù)蘇率和免疫活性的前提下降低成本。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：一種基于rpmi-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞凍存液，在rpmi-1640培養(yǎng)液中添加有效量的凍存保護(hù)劑、細(xì)胞穩(wěn)定劑和防沉劑均勻混合而成，凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜，所述細(xì)胞穩(wěn)定劑為人γ球蛋白；所述防沉劑為多聚-l-賴氨酸，多聚-l-賴氨酸的分子量范圍為3-7萬(wàn)；所述二甲基亞砜的體積百分濃度為1-3％。優(yōu)選地，人γ球蛋白的質(zhì)量濃度為8-12μg/ml。優(yōu)選地，所述多聚-l-賴氨酸在細(xì)胞凍存液中的質(zhì)量濃度為20-30μg/ml。優(yōu)選地，該細(xì)胞凍存液中還含有抗生素。優(yōu)選地，抗生素為慶大霉素，濃度為50u/ml。上述細(xì)胞凍存液在樹(shù)突狀細(xì)胞凍存方面的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液用于凍存dcs時(shí)可以保證dcs的凍存復(fù)蘇率和免疫活性，凍存1年內(nèi)凍存復(fù)蘇率和免疫活性無(wú)明顯降低；本發(fā)明細(xì)胞凍存液中，二甲基亞砜為凍存保護(hù)劑，減少低溫對(duì)dcs造成的損傷；人γ球蛋白為細(xì)胞穩(wěn)定劑，可以維持dcs的免疫活性；多聚-l-賴氨酸為防沉劑，避免儲(chǔ)存過(guò)程人γ球蛋白向凍存液底部沉降，同時(shí)，多聚-l-賴氨酸具有部分凍存保護(hù)劑的作用，多聚-l-賴氨酸的存在使得dmso的體積濃度從現(xiàn)有技術(shù)的10-20％可以降低到本發(fā)明的1-3％而依然能避免低溫對(duì)dcs造成的損傷；另外，多聚-l-賴氨酸還有助于維持dcs的免疫活性。本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液對(duì)dcs凍存效果與日本zenoaq公司生產(chǎn)的cellbanker細(xì)胞凍存液基本一致，但是成本僅有該進(jìn)口凍存液的約1/10。附圖說(shuō)明圖1為dcs在3、6、9和12月后的凍存復(fù)蘇率(％)；圖2為dc-cik對(duì)k562的殺傷率(％)。具體實(shí)施方式為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步介紹。實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。實(shí)施例1：細(xì)胞凍存液的制備試劑來(lái)源：rpmi-1640培養(yǎng)液，gibco；二甲基亞砜，百靈威科技有限公司；人γ球蛋白(cas號(hào)：9007-83-4)，上海士鋒生物科技有限公司；多聚-l-賴氨酸(mw3-7萬(wàn)，a0057-250mg)，上海士鋒生物科技有限公司。細(xì)胞凍存液的制備：以100mlrpmi-1640培養(yǎng)液為溶劑，以二甲基亞砜、人γ球蛋白、多聚-l-賴氨酸為溶質(zhì)，將溶劑和溶質(zhì)混合而成。具體為：先將98mlrpmi-1640培養(yǎng)液和2ml二甲基亞砜混合，再加入人γ球蛋白、多聚-l-賴氨酸，人γ球蛋白、多聚-l-賴氨酸終濃度分別為10、25μg/ml。配制好后，置于4℃冰箱中保存。其中，多聚-l-賴氨酸可以起到防止人γ球蛋白沉降的作用。發(fā)明人在一個(gè)具體實(shí)施方案中，采用不添加多聚-l-賴氨酸的細(xì)胞凍存液作為對(duì)比，也置于4℃冰箱中保存，30天后從液面至瓶底按照高度均勻取3個(gè)樣品測(cè)定其中γ球蛋白的濃度，結(jié)果中間高度樣品中γ球蛋白的濃度約為液面處濃度的5倍，瓶底處樣品中γ球蛋白的濃度約為液面處濃度的11倍。而添加多聚-l-賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)液不存在沉降，4℃靜置6個(gè)月后三個(gè)高度處的濃度無(wú)顯著差異。當(dāng)然，為了避免污染，也可以在細(xì)胞培養(yǎng)中添加適量抗生素，如50u/ml慶大霉素。另配制對(duì)比凍存液備用，該對(duì)比凍存液與上述細(xì)胞凍存液相比僅不添加多聚-l-賴氨酸。實(shí)施例2：dcs增殖培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、復(fù)蘇率和免疫活性檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)材料和方法1、dcs和cik的制備單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)：取肝素抗凝的健康志愿者外周血20ml，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心(2400×g，20min)，輕輕吸取灰白色層的單個(gè)核細(xì)胞，置于15ml離心管中，用rpmi-1640(gibco)培養(yǎng)液離心洗滌3次(2000×g，5min)。用無(wú)血清培養(yǎng)基ultraculturetm(北京惠特比科技)懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)2h后，輕搖細(xì)胞瓶。cik細(xì)胞的誘導(dǎo)：將上述細(xì)胞瓶中的懸浮的細(xì)胞吸到另一培養(yǎng)瓶中，調(diào)整密度為1×106/ml，用含有il-21000u/ml、cd3-mcab100ng/ml的ultraculturetm誘導(dǎo)cik細(xì)胞，每2-3d半量換液，第12天時(shí)收集cik備用。dcs細(xì)胞的誘導(dǎo)：將上述細(xì)胞瓶中的貼壁細(xì)胞用含有100ng/mlhgm-csf和1000u/mlil-4的ultraculturetm繼續(xù)培養(yǎng)，2-3d半量換液，到第12天時(shí)收集誘導(dǎo)的dcs細(xì)胞。用錐蟲(chóng)藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。將一部分細(xì)胞做殺傷活性測(cè)定，另一部分細(xì)胞凍存。2、dcs的凍存和復(fù)蘇將dcs分別用實(shí)施例1制備的本發(fā)明凍存液和對(duì)比凍存液(臨用現(xiàn)配)稀釋成3.5×105/ml，各分裝出4管先置于-80℃低溫冰箱降溫12小時(shí)，再置于-196℃液氮中保存。分別于3、6、9和12月各從液氮中各取出1支，迅速放入40℃水浴復(fù)溫，待細(xì)胞融化后立即吸出細(xì)胞懸液，用rpmi-1640(gibco)培養(yǎng)液離心洗滌，并用錐蟲(chóng)藍(lán)染色檢測(cè)dcs復(fù)蘇率。dcs復(fù)蘇后用含有100ng/mlhgm-csf和1000u/mlil-4的ultraculturetm無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d，收集dcs備用。3、mtt法檢測(cè)dc-cik的殺傷活性培養(yǎng)第12天的cik和復(fù)蘇后再培養(yǎng)2d的dcs按6:1比例相混合，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，用含有il-2(1000u/ml)、hgm-csf(100ng/ml)的ultraculturetm培養(yǎng)4d，即共培養(yǎng)的dc-cik，調(diào)整密度為4×105/ml，加入含有k562細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(效靶比20:1)，以此作為實(shí)驗(yàn)組。另外單獨(dú)加入dc-cik和單獨(dú)加入k562細(xì)胞，每組5復(fù)孔，作為對(duì)照組。置37℃、5％co2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，離心棄上清，每孔加20μlmtt(5mg/ml)，放置37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)4h，離心棄上清，每孔加二甲基亞砜100μl，振蕩溶解。15min后酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)d值。按照下式計(jì)算dc-cik的殺傷率：殺傷率(％)＝【1-(實(shí)驗(yàn)組d-單獨(dú)dc-cik組d)/單獨(dú)k562細(xì)胞d】×100％。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、dcs復(fù)蘇率以實(shí)施例1制備的本發(fā)明凍存液和對(duì)比凍存液為凍存保護(hù)劑分別對(duì)dcs凍存3、6、9和12月復(fù)蘇率如表1和圖1所示。與對(duì)比凍存液比，本發(fā)明凍存液復(fù)蘇率更高，凍存保護(hù)效果更好，這說(shuō)明在沒(méi)有多聚-l-賴氨酸存在時(shí)，2％濃度的dmso不足以有效避免細(xì)胞凍存損傷。表1dcs在3、6、9和12月后的凍存復(fù)蘇率(％)3月6月9月12月本發(fā)明凍存液97.6±2.396.8±2.596.1±2.995.2±2.6對(duì)比凍存液91.5±3.785.7±4.379.4±3.870.9±4.12、dc-cik對(duì)k562的殺傷活性培養(yǎng)第12天的cik和凍存3、6、9和12月復(fù)蘇后再培養(yǎng)2d的dcs共培養(yǎng)的dc-cik對(duì)k562細(xì)胞的殺傷率如表2和圖2所示。與對(duì)比凍存液比，本發(fā)明凍存液對(duì)k562細(xì)胞的殺傷率更高，dcs免疫活性維持更優(yōu)，這說(shuō)明多聚-l-賴氨酸還有助于維持凍存dcs的免疫活性。表2dc-cik對(duì)k562的殺傷率(％)3月6月9月12月本發(fā)明凍存液30.9±3.529.3±3.929.5±3.628.9±3.8對(duì)比凍存液31.7±3.928.8±4.123.2±3.618.5±4.2上述實(shí)施例可以證明，本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液用于凍存dcs時(shí)可以保證dcs的凍存復(fù)蘇率和免疫活性，凍存1年內(nèi)凍存復(fù)蘇率和免疫活性無(wú)明顯降低；本發(fā)明細(xì)胞凍存液中，二甲基亞砜為凍存保護(hù)劑，減少低溫對(duì)dcs造成的損傷；人γ球蛋白為細(xì)胞穩(wěn)定劑，可以維持dcs的免疫活性；多聚-l-賴氨酸為防沉劑，避免儲(chǔ)存過(guò)程人γ球蛋白向凍存液底部沉降，同時(shí)，多聚-l-賴氨酸具有部分凍存保護(hù)劑的作用，多聚-l-賴氨酸的存在使得dmso的體積濃度從現(xiàn)有技術(shù)的10-20％可以降低到本發(fā)明的1-3％而依然能避免低溫對(duì)dcs造成的損傷；另外，多聚-l-賴氨酸還有助于維持dcs的免疫活性。上述實(shí)施例僅用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何簡(jiǎn)單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于上述具體實(shí)施例。當(dāng)前第1頁(yè)12