專利名稱：抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗、其制備方法及其應用。
DNA疫苗技術是將含有編碼外源蛋白基因的真核表達質粒DNA直接導入機體，以激發機體產生特異性免疫應答的一種新型的免疫策略，它具有易于構建、制備簡單及穩定性好等優點，同時能誘發機體持久的特異性細胞及體液免疫應答，可兼作預防和治療性疫苗。在Nature,1992,356:152-154中，Tang DC等人公開了DNA疫苗技術。1993年Davis等人把含HBV表面抗原(HBsAg)編碼基因的表達質粒經肌肉免疫小鼠，成功地誘發了針對HBsAg的細胞與體液免疫(Davis HL et al,Vaccine,1996,14:910-915)。之后基因疫苗治療乙型肝炎成為人們爭相研究的熱點。Mancini M等人在Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:12496-12501.中，公開了將HBV DNA疫苗免疫有HBV復制的轉基因小鼠發現，小鼠對HBV的免疫耐受狀態得以逆轉，產生了HBsAg抗體，清除了血液中游離的病毒顆粒，肝內HBV的復制也得以抑制，進一步表明DNA疫苗有可能成為乙型肝炎防治的新手段。
Major ME等人在Viral,1995,69:5798-5805,Davis HL等人在Vaccine,1994；12,1503-1509中，分別公開了將編碼不同病原基因的表達載體接種于動物體內，均誘發特異性的體液免疫及細胞免疫應答。Chow YH，等人構建了HBV preS2.S和IL-2的雙順反子載體，有效增強了免疫效果，且可克服與MHC相關的針對HBsAg免疫無反應性(見J Viral,1997,71:169-178)。Geissler M等人檢測到的HBsAg特異性CD4+淋巴細胞主要為可分泌干擾素的Th1型淋巴細胞(見Gastroenterology,1997,112:1307-1320)。
DNA疫苗之所以成為治療性疫苗的重要基礎就是它能通過不同的途徑誘導細胞毒性T細胞(CTL)的活化，從而有效控制病毒感染，打破機體免疫耐受狀態。因而如何有效提高DNA疫苗的免疫效率，增強其誘導機體CTL反應，及其作用機制與安全性研究是使DNA疫苗由動物實驗進入臨床使用首先要探討的課題。
我國是全球乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發區，大約有三分之一的HBV感染者在長期的病毒攜帶過程中轉變為慢性肝炎、肝硬化或肝癌。如何打破機體慢性感染所形成的免疫耐受狀態，是抗HBV治療研究的重要課題之一。基因疫苗以其獨特的體內細胞轉染、抗原表達修飾及分泌呈送方式，在誘導機體體液免疫應答的同時，能有效地增強細胞免疫功能，打破某些病毒慢性感染所形成的免疫耐受，有希望成為抗HBV治療新的有效手段。
本發明的目的在于構建含GM-CSF信號序列的HBV Pre-S2.S基因真核表達載體，以增強DNA疫苗的蛋白表達及免疫原性；同時構建IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達載體，作為HBV DNA疫苗的免疫佐劑；通過利用雙質粒的協同作用，激活抗原遞呈細胞，增強CTL特異性免疫反應，以便深入探討DNA疫苗治療乙型肝炎病毒感染的可能性。
本發明的另一個目的在于公開上述雙質粒基因疫苗的制備方法。
本發明的再一個目的在于探討上述雙質粒基因疫苗在治療和預防病毒性乙型肝炎方面的用途。
為了實現上述目的，本發明構建了二類真核表達基因疫苗；一種是含GM-CSF信號序列的HBV preS2.S基因的真核表達質粒，轉染COS細胞能較高水平地表達HBsAg，另外一種是協同免疫載體IL-2/IFN-r融合蛋白基因質粒，在COS細胞中也表達了相應的產物。用所構建的質粒聯合免疫接種小鼠，成功地誘發了小鼠抗人HBsAg特異的體液免疫應答。
本發明采用的技術方案為分別以含HBV基因的pHBVα1及人類細胞基因組DNA為模板，PCR擴增獲得目的基因，即HBV中蛋白preS2+S抗原及人白細胞介素IL-2/INF-γ融合蛋白(FP)編碼基因，并將其定向克隆于已預先用EcoRⅠ消化的真核表達載體pcDNA3.1(+)中CMV(巨細胞病毒)啟動子下游，并分別在目的基因5’、3’端插入分泌性GM-SF及終止性PolyA信號序列，以構建HBV基因疫苗及具有佐劑效果的真核表達質粒，分別命名為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK，簡稱為pS2·S及pFP。質粒的大量提取，PEG法純化，按常規方法進行。
DNA疫苗對乙型肝炎的治療性研究在正常動物及HBV轉基因小鼠體內雖取得了可喜的成就，但要真正進入臨床應用，尚有許多工作要做，其中最重要的研究課題應為如何增強DNA疫苗的免疫效果。針對上述問題，本發明從以下幾方面進行了探討。(1)選擇合適的目的基因。HBV基因組含有多種抗原蛋白編碼基因，其中p-S1蛋白，p-S2蛋白及S蛋白均含有特定的抗原決定簇，可分別誘導機體產生相應的特異性抗體，其中抗-HBs具有較強的保護力，p-S2抗體可能與病毒清除密切相關，而p-S1則含有HBV與肝細胞膜受體的結合位點。因而我們選擇了HBV p-S2與S基因來構建載體，同時，在p-S2基因片段前插入一段GM-CSF的信號序列，使DNA疫苗在體內更高地表達HBS p-S2.S中分子蛋白。(2)質粒載體的選擇。本發明所用真核表達質粒pcDNA3.1(+/-)帶有pCMV啟動子及ployA序列，可保證插入的目的基因用自身起始密碼在哺乳細胞內高效表達。(3)構建IL-2/IFN-r融合基因質粒作為免疫佐劑。近年研究表明多種細胞因子對DNA疫苗均具有較好的佐劑效應，能有效增強基因疫苗的免疫原性。Davis等以pRSV-GM-CSF與pCMV-S共注射小鼠，發現抗HBs抗體明顯增高，我們構建的IL-2/IFN-r融合基因質粒與HBV pS2.S基因疫苗協同免疫小鼠，抗HBs抗體水平比單獨用HBV DNA疫苗免疫提高約3倍。IFN-r可能增強抗原遞呈細胞表面MHCⅡ類分子表達，從而激發抗原遞呈過程，IL-2可通過增強抗原特異性T淋巴細胞增殖起作用，二者主要激活的均為細胞免疫應答，因而該融合蛋白質粒作為免疫佐劑，有可能調控機體對HBV DNA疫苗的免疫應答類型。
DNA疫苗作為近年發展起來的一種全新疫苗，不僅可誘發抗體保護性抗體，更重要的是可誘導針對病毒抗原的細胞免疫，從而有效打破宿主對病毒的免疫耐受狀態。與肽類疫苗不同，DNA疫苗將編碼抗原蛋白的質粒DNA注入肌肉或皮內，由宿主合成抗原蛋白，因此它能誘發機體產生抗原特異性CD8+細胞毒性T細胞(CTL)為標志的細胞免疫。Davis等[8]給小鼠肌注編碼HBsAg的重組質粒，檢測到高水平的抗-HBs抗體和HBsAg特異性的CTL，研究表明，DNA疫苗誘導細胞免疫的機制在于它模擬了病毒的自然感染過程。質粒DNA被肌細胞攝取后，合成的蛋白質被降解為含抗原表位的肽段，進入內質網與MHCⅠ類分子結合，再轉運至細胞膜，激活受MHCⅠ類分子限制的CD8+CTL。部分分泌入血的抗原，誘導體液免疫，或被樹突狀細胞等抗原遞呈細胞俘獲，經加工并與MHCⅡ分子結合，激活CD4+Th細胞，分泌IFN-r,IL-2等細胞因子，參與免疫調節作用。DNA疫苗的出現為人類完全征服乙型肝炎及其它病毒性疾病帶來了希望，其應用和研究前景將極為廣闊。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發明。


圖1為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK的構建圖；圖2 HBV中蛋白及細胞介素融合蛋白真核表達載體結構示意簡圖；圖3為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK兩重組質粒的基因序列；圖4為融合蛋白IL-2/IFN-r表達產物的SDS-PAGE電泳分析；1．標記物；2．pcDNA-FCK；3．pcDNA3.1圖5 IL-2/IFN-r的Western印跡；A．IL-2 McAbs探針； 1．標記物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1B．IFN-r McAbs探針；1．標記物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1圖6不同劑量的基因疫苗誘導血清抗體量及陽性率(％)的產生；圖7 pFP對基因疫苗誘導健康鼠抗體產生的影響；Δ血清抗-HBS陽性率(≥10mIu.ml-1)*pS2.S+pcDNA3.1組比較，P＜0.01圖8各組質粒接種后不同時間(周)HBV Tg小鼠血清HbsAg及抗-HBs水平變化。
下面是本發明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發明，而不是限制本發明。
實施例中采用的質粒、菌種及試劑如下質粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)、PUC19(含HBV Pre-S1、Pre-S2與S基因)及COS-7細胞由美國哈佛大學Fusion生物醫藥公司惠贈，菌株DH5α購于GibcoBRL公司，COS-1與L-6TG細胞株引自上海細胞所。
限制性內切酶、T4DNA連接酶、RNA抽提試劑盒、QIAprep及EndofreePlasmid Mega Kit質粒制備純化試劑盒，QIAquick凝膠提取試劑盒、LipofectAMINE細胞轉染試劑盒，以及其他工具酶與試劑分別購于Promega、Gibco BRL、Boehringer、Amersham及QIAgene公司等，HBsAg與HBsAb檢測試劑盒購于華美生物公司，IL-2及IFN-r檢測試劑盒購于深圳晶美生物技術公司，衛生部檢驗中心質檢室提供抗-HBs標準品。
實施例11．HBV pS2.S基因真核表達載體的構建以含HBV基因的原核表達質粒PUC19為模板，PCR擴增獲得目的基因。正引物內設計含有54mer的GM-CSF信號序列，引物序列為正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTgcaTCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，擴增片段長度為888bp。參照Sambrook等的方法將目的基因定向克隆于已預先用EcoRⅠ消化的真核表達載體pcDNA3.1(+)中CMV啟動子下游，稱之為pcDNA-HBV或p-S2.S。
2．IL-2/IFN-r人細胞介素融合蛋白基因真核表達質粒的構建細胞基因組DNA的提取按Sambrook等的方法進行。為不影響表達的細胞因子各自的空間構象，在二類細胞因子基因片段之間插入24mer的無關序列，擴增IL-2基因的引物序列為正引物P1 5'-ATGTACAGGA TGCAACTCCTA-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACAcg aacccccgcc tcctgaccca gcAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；擴增IFN-r基因引物序列為正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTgc tgggtcagga ggcgggggtt cgTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’。取1μg基因組DNA進行PCR擴增，P1+P2與P3+P4的PCR產物經純化后混合作為融合蛋白基因擴增的模板，用引物P1+P4行PCR擴增，產物為924bP的含中間序列的融合細胞因子基因片段，將其定向克隆于經EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)載體中，命名為pcDNA-FCK或pFP。
3．重組質粒的制備與純化重組載體pcDNA-HBV,pcDNA-FCK分別轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經LB培養基擴增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit，按操作說明書制備和純化質粒，溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存備用。
真核表達質粒pcDNA3.1(+/-)內含巨細胞病毒啟動子(pCMV)與polyA序列，可保證插入基因用自身起始密碼在多種哺乳動物細胞內高效表達。經PCR、酶切、基因重組等技術分別構建了帶有粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF信號序列的HBV preS2.S基因及IL-2/IFN-r融合蛋白基因的重組載體pcDNA-HBV與pcDNA-FCK見
圖1，結構示意簡圖見圖2。兩重組質粒經PCR擴增鑒定，結果均獲得特異性目的基因片段，測序結果表明目的基因序列正確并已正向插入到pcDNA3.1中pCMV的下游，二重組質粒分別經xhoⅠ,xbaⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ等酶切，結果表明質粒構建正確(圖3)。
實施例2重組質粒在細胞內的表達在LipofectAMINE介導下，將已純化的重組載體pcDNA-HBV,pcDNA-FCK按操作說明書分別轉染COS-1,COS-7與L-6TG細胞。轉染前24小時將細胞按106/皿接種于35mm培養皿中，轉染前4小時換液，每皿加入5μg質粒DNA,G418篩選抗性克隆。培養48小時和72小時分別收集培養上清，采用ELISA方法檢測表達產物。
質粒DNA轉染細胞后培養48h和72h，收集培養上清液，ELISA方法測定HBsAg,IL-2及IFN-r表達，取平行兩皿測定均值。由表1可見表達的產物在COS-1與COS7細胞內表達水平相似，均明顯高于在L-6GT細胞中的表達水平(P＜0.01)，細胞培養48h的產物表達水平略高于72h的表達水平，但無顯著性差異。
表1*P＜0.01，與cos-1和COS-7細胞比較。
實施例3
融合蛋白IL-2/IFN-r基因表達產物Western印跡鑒定融合蛋白經SDS-PAGE電泳后，進行電轉移轉膜(500mA,3小時)，轉移后的硝酸纖維素膜，分別用IL-2單抗及IFN-r單抗進行顯色鑒定。重組載體pcDNA-FCK轉染真核細胞COS-7及COS-1，培養48h后取培養上清液，濃縮后SDS-PAGE電泳，可見在30kD左右有一產物帶(圖4)。表達產物IL-2/IFN-r可與IL-2單抗及IFN-r單抗發生反應，說明該融合蛋白中既有IL-2存在，又有IFN-r存在，結果見圖5。
實驗例1雙質粒HBV DNA疫苗誘導健康及HBV轉基因小鼠體液免疫的實驗研究實驗動物健康C57BL/6小鼠購自中山醫科大學動物實驗中心，雌性，6-8周齡，屬Ⅱ級動物并具合格證書。HBV轉基因(Tg)小鼠由第二軍醫大學實驗動物中心提供，品系為C57BL/6小鼠，清潔級，由HBV全基因(adr型)隨機轉染，傳至9-10代，經剪尾，組織DNA提取，PCR檢測HBV DNA呈陽性，再以ELISA方法篩選血清HBsAg陽性小鼠9只，實驗備用。
免疫接種與實驗分組；基因疫苗接種方法采用小鼠雙側脛前肌(TA)直接注射法。用0.5％鹽酸布比卡于小鼠雙側TA各注射50μ1，第5日用劑量為75mg.kg的戌巴比鈉麻醉小鼠，于雙側TA同一部位各注射總容量為50μ1的PBS質粒溶液。健康C57BL/6小鼠共28只，分為6組(1)pS2.S大劑量(100μg/只)組5只；(2)pS2.S中劑量(50μg/只)組5只；(3)pS2.S小劑量(10μg/只)組5只；(4)pcDNA3.1(100μg/只)對照組3只；(5)pS2.S+pFP(10μg+10μg/只)組5只及(6)pS2.S+pcDNA3.1(10μg+10μg/只)組5只。HBV Tg小鼠共9只，分為4小組，A組pS2.S大劑量(100μg/只)組2只；B組pS2.S+pFP(50μg+50μg)組3只；C組pFP(10μg/只)組2只及D組pcDNA3.1(100μg/只)組2只。采用眼球后靜脈叢穿刺法于免疫接種后第2、4、6、8、14周定期采血，分高血清標本，置一20℃貯存，待分批一次性進行血清HBsAg及抗-HBs ELISA法檢測。
統計處理采血兩樣本均數比較的t檢驗。結果如下1．基因疫苗誘導健康動物體液免疫應答的動態觀察血清抗-HBs≥10mIu/ml被認為機體保護性有效濃度。圖6結果顯示pcDNA3.1接種正常小鼠后于2、4、8、14周血清抗-HBS濃度均小于10mIu.ml-1。與之相比，pS2.S高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)，三組劑量一次性免疫小鼠均能在2周誘導抗-HBS產生(＞10mIu.ml-1)，抗體效價隨時間延長而增長。三組間比較，抗體濃度及陽性率亦有差別高、中劑量組二周抗體陽性率均為100％，高于低劑量組(60％)；血清抗體濃度比較，高劑量組(82.9±30.010mIu.ml-1)較中(42.2±25.610mIu.ml-1)、低(24.6±7.5)劑量組分別具顯著(P＜0.05)及非常顯著(P＜0.01)性差異。以后的4、8、14周高、中劑量組間差別縮小，但二者較低劑量組均具非常顯著性差異(P＜0.01)。
2．pFP對基因疫苗誘導正常動物抗體產生的影響圖7結果顯示，低劑量(10μg/只)的pS2.S與pFP聯合免疫，于2、4周誘導組內全部(100％)健康小鼠抗體產生，而相同劑量的pS2.S+pcDNA3.1組僅分別為60％及80％。pFP聯合免疫組誘導抗體產生水平于2、4周分別為115.4±21.9mIu.ml-1,121.9±35.0mIu.ml-1，較pS2.S+pcDNA3.1組(24.6±27.5mIu.ml-1,33.1±8.9mIu.ml-1)均具非常顯著性差異。而于第8、14周，聯合pFP免疫組抗-HBS水平明顯下降，與聯合空白載體組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
3．基因疫苗誘導HBV轉基因(Tg)小鼠抗-HBS產生結果。
高劑量的pS2.S組與中劑量pS2.S聯合pFP(50μg/只)組各有一只Tg小鼠發生HBSAg血清轉換，其中聯合免疫組于2周誘導抗-HBS產生，單獨高劑量組產生抗體時間為第4周，且水平(20mIu.ml-1)低于聯合免疫組(45mIu.ml-1)；而第8周pS2.S組該只小鼠血清抗體水平升高(400.0mIu.ml-1)，高于同期的pS2.S+pFP組(275.6mIu.ml-1)。四組共9只HBV Tg小鼠于接種前血清HBSAg ELISA檢測均為陽性(P/N值≥2.1)，不同質粒免疫后，各只鼠OD值均有下降，第4周pcDNA3.1有一只小鼠反跳性升高。比較第8周血清HBSAg檢測結果pS2.S組與pS2.S+pFP組P/N值分別為1.88±0.25、1.50±0.38均明顯較pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)組低，見圖8。
HBV基因疫苗是將病毒蛋白性抗原編碼的S或C區基因通過分子克隆技術構建的真核細胞表達質粒，經肌注等途徑轉染至縮主細胞進行復制、轉錄，并表達和分泌病毒抗原，分別通過局部組織抗原遞呈細胞(APC)或宿主細胞膜MHCⅡ及Ⅰ類分子進行抗原呈遞，整個過程模擬了病毒感染的自然過程，因此基因疫苗免疫在誘導機體體液免疫應答的同時，能更有效地誘導特異性細胞免疫應答，達到抗HBV慢性感染的免疫預防反治療目的。
與疫苗構建插入的空白載體pcDNA3.1比較，本發明構建的HBV基因疫苗pS2.S具有較強的誘導健康小鼠體液免疫應答效果，并呈一定的劑量依賴關系，為治療型基因疫苗的進一步研制、質粒構建及篩選提供了可靠的實驗依據。本研究一次性免疫接種后動態持續性觀察，結果血清抗體水平隨時間而不斷升高，與國外學者觀察結果基本一致。推測與局部淋巴濾泡中的濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cells)攝取疫苗DNA并長期保存和表達抗原有關。這樣，使B-細胞不斷將抗原加工后送呈給T細胞，保證了免疫應答的記憶性，基因疫苗在宿主細胞持續表達的抗原成為再次增強免疫原，誘導血清抗-HBS水平的持續升高。
通過現有的直接注射途徑，質粒DNA轉染到宿主細胞的成功率并不高。如何提高基因疫苗效果，降低質粒劑量，是該項新技術推廣應用前必須解決的技術難題之一。白細胞介素-2(IL-2)及γ-干擾素(IFN-γ)均為Th1細胞分泌的重要細胞因子，并能促進T細胞向Th1亞群分化。已有實驗證明IFN-γ能促進DC細胞(APC)膜表面MHCⅡ類抗原分子及CD86分子的表達，并增強DC抗原的呈遞功能。本發明構建的IL-2與IFN-γ融蛋白編碼基因的表達質粒(pFP)，聯合基因疫苗免疫，在取得相同的體液免疫效果的同時，可將基因疫苗質粒劑量降到原來的1/10，并能減少同組動物個體問抗體水平差異，提高同組效果的均一性，表明pFP具有較強的佐劑效應。然而，聯合疫苗接種第8周血清抗-HBs水平明顯降低，至14周低于對照組(pS2.S+pcDNA3.1)。分析其原因，可能與pFP表達的IL-2及INF-γ有關，一方面通過增強局部CTL功能致轉染基因疫苗的肌細胞壞死；另方面直接抑制pS2.S在肌細胞抗原表達，從而降低HBSAg的分泌及其免疫原性。
比較相同高劑量pS2.S單獨及聯合佐劑質粒免疫正常小鼠誘導體液免疫應答結果，pS2.S pS2.S+pFP免疫HBV轉基因(Tg)小鼠的二組中僅各有一只Tg小鼠血清抗-HBs陽性，表明Tg小鼠對HBSAg已形成免疫耐受。其中聯合佐劑免疫組的一只抗-HBs產生時間(2周)較單獨基因疫苗接種組早，而第8周抗體定量檢測結果后者較前者高，與健康動物實驗結果相符。4組質粒接種后Tg，小鼠血清HBSAg ELISA檢測值均降至試劑盒指示的陰性范圍，pFP與pcDNA3.1組血清HBsAg的下降可能分別與各自表達細胞介素及載體結構中含氮個抗性基因致細胞免疫功能增強有關。但該二組HBSAg檢測結果在第8周明顯較pS2.S及pS2.S+PFP組高，且pcDNA3.1組中一只小鼠血清HBsAg于4周有波動并呈陽性。提示基因疫苗及其聯合佐劑免疫能誘導針對HBsAg特異性的細胞免疫應答，通過CTL功能的增強及IL-2、INF-γ等細胞介素的釋放，更有效地抑制HBV的復制及其蛋白性抗原的表達，使HBsAg發生血清學轉換。
目前，國內HBV轉基因小鼠品系的建立均采用顯微注射隨機插入HBV全基因組的方法，故在傳代后基因整合的穩定性、基因編碼產物的表達及水平等方面存在諸多問題。本研究所用9只HBV Tg小鼠是90只組織HBV DNA陽性Tg小鼠中篩選HBSAg血清陽性者所得。因HBsAg ELISA檢測OD值較低，給治療性基因疫苗效果的評價帶來一定困難。但作為初步的實驗摸索，結果仍不失一定參考意義。有特fmV轉基因動物的成熟建立，我們才能更好地評價基因疫苗誘導細胞免疫、打破免疫耐受、治療HBy慢性感染的確切療效。
實驗例2DNA疫苗誘導健康小鼠細胞免疫應答及HBV轉基因小鼠抗-HBs的產生目的在HBV DNA疫苗成功誘導健康小鼠體液免疫應答的基礎上，深入探討其作為抗-HBV治療的可行性及作用機理。方法應用基因重組技術，我們構建編碼HBV中蛋白(preS2+S)及人白細胞介素融合蛋白基因的真核表達質粒pS2.S及pFP，繼經肌注免疫健康Balb/C及HBV轉基因(Tg)小鼠并分為三個實驗系列1．HBsAg特異性T細胞增殖實驗不同質粒接種后2周，取健康Balb/C小鼠脾臟并分離淋巴細胞在體外與不同濃度的HBsAg孵育，分別在培養72小時(hr)及96hr，檢測培養液上清細胞因子的釋放及T細胞增殖指數；2．樹突狀細胞(DCs)誘導HBsAg致敏的T細胞增殖實驗第2次質粒接種后的第2天，取小鼠局部引流淋巴結(LN)分離提取DCs并分別計數，在體外與HBsAg致敏的同品系小鼠T細胞培養96hr，檢測細胞增殖指數；3．HBV轉基因(Tg)小鼠血清誘生抗-HBs實驗篩選9只血清HBsAg陽性的HBV Tg小鼠(第二軍醫大學實驗動物中心提供)，分為4組pS2.S免疫組2只，100μg/只；pS2.S+pFP組3只，(50+50)μg/只；pFP組2只，100μg/只；空白載體pcDNA3.1組2只，100μg/只。免疫前及免疫后2、4、6、8周分別采血，一次性檢測血清HBsAg及抗-HBs水平。結果1．HBV DNA疫苗誘導HBsAg特異性T細胞增殖實驗體外HBsAg對DNA疫苗免疫后的T細胞的刺激呈濃度相關，HBsAg30ug.ml-1時刺激pS2.S免疫小鼠脾細胞增殖指數(5.6±0.9)明顯較pcDNA3.1組(2.0±0.5)高(表1)。細胞培養上清液細胞因子水平檢測結果高劑量(100μg/只)pS2.S免疫組IL-2(226.3±4.1pg.ml-1)及IFN-γ(51.1±7.7pg.ml-1)的分泌水平明顯較pcDNA3.1組(69.0±22.1/0.9±0.7pg.ml-1)高；中劑量(50μg/只)pS2.S聯合pFP(50μg/只)免疫組IL-2/IFN-γ水平(266.2±61.0/39.6±16.3pg.ml-1)，亦較中劑量pS2.S聯合空載質粒pcDNA3.1組(150.1±26.2/10.6±5.6pg.ml-1)高；IL-4水平于各組質粒免疫影響不明顯。2．DCs誘導HBsAg致敏的T-細胞增殖實驗pS2.S免疫小鼠局部LN DCs誘導HBsAg致敏的T-細胞增殖指數(4.20)較pcDNA3.1組(2.55)高(表2)，同時細胞計數結果表明pS2.S組及pS2.S聯合pFP免疫組DCs數目及其占局部引流LN的百分比均明顯升高。3．HBV DNA疫苗誘導HBV Tg小鼠抗-HBs產生高劑量的pS2.S組與中劑量pS2.S聯合pFP組各有一只Tg小鼠分別于2、4周開始發生HBsAg血清轉換，且其抗體水平隨時間而增長。4組9只Tg小鼠于接種前血清HBsAg均陽性(ELISA P/N≥2.1)，不同質粒免疫后，各只P/N值均有下降，第4周pcDNA3.1組有一只小鼠反跳性升高，比較第8周血清HBsAg檢測結果pS2.S組與pS2.S+pFP組P/N值分別為1.88±0.25,1.50±0.38，均明顯較pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)組低(圖2)。結論本研究結果表明HBV DNA疫苗能有效誘導HBsAg特異性的細胞免疫應答，提示可能的作用機理是局部引流LN的DCs攝取質粒表達的抗原或質粒本身，通過MHC-Ⅱ或MHC-Ⅰ類抗原遞呈途徑誘導T細胞增殖并向Th1亞群分化，提高了IL-2/IFN-γ的分泌水平，有效地增強細胞免疫應答以達到抗-HBV的治療目的；HBV-Tg小鼠的初步實驗結果為治療型HBV DNA疫苗的深入研制提供了實驗依據。
權利要求
1．抗乙型肝炎病毒(HBV)雙質粒基因疫苗，其特征在于由含粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)信號序列的HBV包膜中蛋白基因真核表達質粒pS2.S，和含無關中間序列的人IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達載體pFP組成。
2．根據權利要求1所述的抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗，其特征在于含GM-CSF信號序列真核表達質粒pS2.S的真核表達載體為pcDNA3.1(+)，目的基因為HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因片段，并在此基因片斷上游插入54mer的GM-CSF信號序列，所得整體目的基因片段長度為888bp，定向克隆于pcDNA3.1(+)載體的CMV啟動子下游。
3．根據權利要求1所述的抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗，其特征在于IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達質粒pFP的真核表達載體為pcDNA3.1(-)，目的基因為人或其它種屬的IL-2及INF-γ融合蛋白基因，為不影響所表達的二類細胞因子各自空間構成及生物活性，在二者之間插入24MER的天關基因序列，所得整體目的基因長度為924bp，定向克隆于pcDNA3.1(-)載體的CMV啟動子下游。
4．抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗的制備方法，其特征在于制備方法包括a．以含HBV基因的原核表達質粒PUC19為模板，PCR擴增獲得目的基因，正引物內設計含有54mer的GM-CSF信號序列，引物序列為正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTGCATCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，擴增片段長度為888bp；參照Sambrook等的方法將目的基因定向克隆于已預先用EcoRⅠ消化的真核表達載體pcDNA3.1(+)中CMV啟動子下游；b．細胞基因組DNA的提取按Sambrook等的方法進行，為不影響表達的細胞因子各自的空間構象，在二類細胞因子基因片段之間插入24mer的無關序列，擴增IL-2基因的引物序列為正引物P1 5’-ATGTACAGGA TGCAACTCCT A-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACACG AACCCCCGCC TCCTGACCCAGCAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；擴增IFN-r基因引物序列為正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTGC TGGGTCAGGA GGCGGGGGTT CGTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’；取1μg基因組DNA進行PCR擴增，P1+P2與P3+P4的PCR產物經純化后混合作為融合蛋白基因擴增的模板，用引物P1+P4行PCR擴增，產物為924bP的含中間序列的融合細胞因子基因片段，將其定向克隆于經EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)載體中；c．重組載體pcDNA-S2.S,pcDNA-ⅡF分別轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經LB培養基擴增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit按操作說明書制備和純化質粒，溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存備；
5．抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗的用途，其特征在于用于治療和預防乙型病毒性肝炎或其它病毒性疾病。
全文摘要
本發明公開了一種抗乙型肝炎病毒雙質粒基因疫苗、其制備方法及其應用，雙質粒基因疫苗由含粒細胞或巨噬細胞集落刺激因子GM－CSF信號序列的分子蛋白基因真核表達質粒HBV pS
文檔編號C12N15/79GK1316518SQ0010785
公開日2001年10月10日 申請日期2000年6月19日 優先權日1999年6月18日
發明者陳光明, 謝宗法, 楊富強, 何曉嬙, 黃英, 吳樂園 申請人:中國人民解放軍第四五八醫院