專利名稱：：用于評估hiv病毒適應度的方法、質粒載體和引物的制作方法用于評估HIV病毒適應度的方法、質粒栽體和引物發明領域本發明涉及在給定環境中評價HIV病毒復制能力的方法和裝置。特別地，本發明提供了生長竟爭分析，其可以利用經重組標簽化的HIV-1病毒系統來測定相對病毒適應度(fitness)。所述方法依靠質粒栽體、擴增子、引物和探針以及能復制的病毒的由此生成。所迷方法和材料可以用于多個領域，包括診斷、藥物篩選、藥物遺傳學和藥物開發。
背景技術：
：抗逆轉錄病毒治療的最終目標是盡可能多和盡可能久地抑制HIV-1復制。維持低至不可檢測的HIV-1RNA水平將防止向獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的發展，并能使得抗逆轉錄病毒抗性的出現最小化(Hirschetal.,1998)。然而，即使高效的抗逆轉錄病毒治療學(HAART)也不能在所有組織區室中完全地抑制HIV-1復制。所有抗逆轉錄病毒藥物的有效性都受到藥物抗性變體的出現的限制，經常顯示出在每類藥物種類內部的廣泛的交叉抗性(Miller，2001;Deeks，2001;Loveday，2001)。在沒有抗逆轉錄病毒治療(ART)時，這些藥物抗性毒抹與準種(quasispecies)內的野生型(WT)克隆相比具有降低的適應度(Coffin,1995)。適應性是描述有機體對其環境的復制適應性(adaptability)的復雜參數(在DomingoandHolland,1997;Domingoetal.1999中綜述)。通常，適應度的初始的降低與賦予直接藥物抗性的初級替代物的出現一致。持續的藥物壓力容許病毒選擇次級突變，其補償了初級突變，并恢復了藥物目標酶[蛋白酶(PR)或逆轉錄酶(RT)]的酶活性。這種持續的進化將使得適應度恢復到有時比WT病毒更低、類似或甚至更高的水平(Hirschetal.,1998;Nijhuisetal.，2001;Berkhout，1999a;Claveletal.,2000;Doyonetal.，1996;Quifiones-MateuandArts,2001)。因而，"群集(swarm)"或準種中的每個克隆受到各種選擇壓力，并且具有反映出在特定環境下的性質如活性和穩定性的組合的適應度。在準種周轉(turnover)或復制期間，不同的基因組快速地產生，并經歷連續的竟爭和選擇過程(Domingoetal.，1999)。更高適應度的新近出現的變體通常竟爭超過更低適應度的克隆，因而，準種可以快速地適應改變中的環境。相當大的注意已經集中于藥物抗性和病毒適應度之間的關系上。與WT分離抹相比，賦予對抗逆轉錄病毒試劑的抗性的若干突變與降低了HIV-1分離抹的復制能力和相對適應度(Croteauetal.JVirol1997;71:1089-96;Larderetal.Science1995;269:696-9;Harriganetal.JVirol1998;72:3773-8;Kosalaraksaetal.JVirol1999;73:5356-63;Wrinetal.ConferenceonRetrovirusesandOpportunisticInfections,SanFrancisco,January30-February2，2000)。HIV-1的高度藥物抗性變體的降低的復制能力可能對在被認為是"失敗中的"抗逆轉錄病毒治療的患者中的持續免疫效益有貢獻(Deeksetal.NEnglJMed2001;344:472-80)。在治療中斷時藥物抗性病毒被WT病毒相對快速替代提供了證椐證明在不存在藥物壓力時，WT病毒相對于藥物抗性變體而言，具有顯著的適應度優勢(Devereuxetal.AIDS1999;13(Suppl):F123-7;Verhofstedeetal.AIDS1999;13:2541-6;Milleretal.AIDS2000;14:2857-67)。因而，在HIV-1PR和RT中的藥物抗性突變體的積累顯著地損害病毒適應度(Luetal.,J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.27:7-13;Martinez-Picadoetal.,J.Virol.73:3744-3752)。盡管存在高水平的藥物抗性，但降低的病毒適應度仍能促進抗逆轉錄病毒治療的持續效益，(Deeksetal.，N.Engl.J.Med,344:472-480)。然而，在不存在藥物的情況下，并非所有的抗性突變體一定能降低病毒適應度。例如，在使用含有蛋白酶抑制物(PI)的方案進行治療期間選擇的某些突變體可以改進病毒復制，產生比初始的WT分離抹更適應的突變(Nijhuisetal.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA89:10537-10541)。已經報道了用于估計體外相對病毒適應度的多種分析。這些方法中的大多數依靠點突變分析、直接群體測序，或取決于大量的分子克隆的測序來估計群體中WT和突變等位基因的頻率(Martinez-Picadoetal.JVirol1999;73:3744-52;Nijhuisetal.AIDS1999;13:2349-59)。或者，通過從測序層析語分析相對峰高度來估計等位基因頻率(Kosalaraksaetal.JVirol1999)。然而，克隆分析和點突變分析很可能是耗時的和費力的。此外，對于通過點突變分析研究的每個等位基因需要設計和驗證獨特的引物。雖然直接群體測試是更為直接的，但是，在測序層析譜上比較相對峰高度是估計混合群體中等位基因頻率的不精確的手段(Harriganetal.JVirol1998;72:3773-8)。重組病毒分析已經提供了從血漿分離HIV的相對快速和可重現的方法(Kellametal.J.Virol.38(1994)，pp.23-30;Mascheraetal.J.Virol.69(1995),pp.5431-5436;Hertogsetal.Antimicrob.AgentsChemother.42(1998),pp.269-276;andRobinsonetal.AIDSRes.Hum.Retr.16(2000)，pp.1149-1156)。通過產生cDNA然后聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增藥物目標基因PR和/或RT,并與在相應于擴增區域的區域中具有特異性刪除的克隆的原病毒DNA共同轉染。在共轉染的DNA片段中的重疊區域重新組合產生復制型病毒。Robinsonetal.,JournalofVirologicalMethods,104(2002)147-160描述了培養HIV-1的方法；其中除了整條PR和RT序列之外，包含Gag-Pol裂解位點的所有Gag基因也來自感興趣的分離抹。經改良的單循環重組病毒檢驗已經被用于測定不同HIV-1分離林的復制能力，但其不能提供關于比較適應度的實際數據，因為這種分析沒有測量不同病毒物種的竟爭性生長(Wrinetal.)。此外，單循環的重組病毒分析限于含有源自受試者的基因或特定突變的HIV-1克隆，此外測試的病毒沒有完成完整的復制周期(Quifiones-Mateuetal.,2002)。利用化學發光檢測的基于PCR的差示探針雜交分析精確地定量了混合物中WT和突變序列的比例，但是必須針對每個感興趣的等位基因設計特定的探針(Eastmanetal.JClinMicrobiol1995;33:2777-80)。測序足夠大數量的克隆以估計等位基因頻率是費力的，而峰高度比較是用于定量病毒準物種混合物的相對不精確的方法。生長竟爭實驗涉及用兩種不同的HIV-1分離株進行的雙感染。可以在混合的感染物中直接比較兩種病毒毒林的相對適應度，其中每種毒林被精確地定量，并且可從遺傳上和/或表型上與另一種相區分。一種分離株相對于另一種的生長優勢是相對適應度的衡量(Hollandetal.,1991)。盡管是更費力的，通過允許突變和WT毒抹的直接比較，但生長竟爭分析提供了對病毒適應度的精確估計。利用這種病毒竟爭概念，已經開發出了不同的技術，來定量兩種病毒在體外感染集中的最終比例，從而測量相對病毒適應度。許多這些方法比較了相差單個氨基酸取代的HIV-1克隆的適應度，必須依靠大量克隆的測序(SharmaandCrumpacker，1997;Harriganetal.,1998;Martinez畫Picadoetal.,1999,2000;Imamichietal.，2000)。近來的研究采用了更快速的技術來估計群體中兩種病毒的相對頻率(Quifiones-MateuandArts,2001)。例如，不同版本的雜雙鏈體跟蹤分析(HTA)已經被用于對竟爭中的兩種HIV-1變體進行精確地檢測和定量(Quifiones-Mateuetal.,2000;Nelsonetal.，2000;Reschetal.,2001)。新的技術例如實時PCR也被用于雙病毒檢測(DeRondeetal.,2001)。Quifiones-Mateu等人(2002)近來開發了新的實時PCR/TaqMan分析，其通過直接與非亞型BHIV-1對照竟爭來測量HIV-l亞型B毒抹的相對產量。Lu和Kuritzkes(JAIDS,27:7-13，May2001)開發了新的重組標記物病毒分析(RMVA)，來檢測生長竟爭分析后的兩種HIV-1克隆。在刪除RT的原病毒克隆中用兩種不同的標記基因(hisD或PLAP)替代nef基因。在生長竟爭實驗之后，經由對相應標記物的實時PCR來定量含不同的RT編碼區的兩種RMV克隆(pHIVdeltaenvBSTEIIdeltanef-hisD和pHIVdeltaenvBSTEIIdeltanef-PLAP)的比例。然而，由于包膜(env)區域是HIV基因組最為可變的區域，即，提供了對藥物或中和抗體的很多逃避突變的最高頻率的突變，因此，外來基因對nef基因的消除或替代將不可避免地影響原始病毒的性質。因而，這種方法仍不能提供可以模擬目標病毒的體內效果的體外模型。因而存在著對經過標準化的用于測試病毒適應度的方法的需求，所述方法能模擬體內環境、易于使用并易于以精確和精密的方式定量。還需要容許在單個分析試管中進行對多種病毒的多路分析的方法。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其可以測量在環境中病毒的復制能力。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其可以測量不同病毒物種的竟爭生長。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其不需要采用為被研究的每個等位基因設計并驗證的引物或探針。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其對完全完整的復制循環加以測試。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其對于在病毒準物種中測定混合物來說是精確的。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的方法，其在估計病毒適應度方面是精確的。本發明的一個目的是提供評估病毒適應度的模型，其可以模擬體內條件。WO03/020878提供了對擴增和檢測測試樣品中的HIV-l目標序列有用的寡核苷酸引物集、探針和其組合。TibotecPharmaceuticalsLtd.的EP1283272涉及評估HIV治療的方法和產品。特別是，測定了HIV包膜蛋白的分子事件和它們對藥物的治療效力的影響。這些方法依靠通過基因分型或表型分型來提供HIV包膜核酸材料并評估治療。WO03/0U334公開了HIVTat蛋白或多核苷酸；或HIVNef蛋白或多核苷酸；或與HIVNef蛋白或多核苷酸連接的HIVTat蛋白或多核苷酸；以及HIVgp120蛋白或多核苷酸在疫苗生產中的用途，所述疫苗適合于針對HIV的人類預防性或治療性免疫的初次-強化遞送，其中所述遞送經由轟擊方法實現。WO00/29611涉及對樣品中的HIV進行亞型和/或物種全面性沖企測的方法，其中使用至少一種寡核苷酸，其含有來自以下的至少10個連續核苷酸(i)HIV的gaggene或pol基因的LTR區域的高度保守區域，(ii)另一種HIV分離物的相應區域的高度保守區域；(iii)源自多種HIV分離物的共有序列的相應區域的、或與之互補的序列的高度保守區域。FR2869045提供了對可能含有HIV病毒的樣品進行分析的方法，所述方法包括以下步驟(a)提取病毒RNA;(b)對步驟(a)獲得的RNA進行逆轉錄，并用第一對引物擴增從而允許產生包含HIV基因組的至少兩個連續基因的全部或部分的、擴增的逆轉錄產物；(d)使用一組第二對引物對步驟(b)中獲得的擴增的逆轉錄產物進行擴增；(e)與步驟(d)制備的上述擴增產物的栽體進行同源重組；(f)對上述至少兩個基因的全部或部分編碼的病毒蛋白質進行功能分析；(g)測量步驟(e)獲得的重組病毒的復制能力。TibotecPharmaceuticalsLtd.的EP1285971涉及評價HIV治療的方法和產品。該方法基于評價引起所研究化合物的改變的治療效力的、在HIV整合酶(int)上的分子事件來實現。這些方法依靠提供整合酶基因并通過基因分型或表型分型所述整合酶基因來評價。US2005/244818公開了單個細胞水平的表型分析，其可以同時分析HIV-1藥物易感性和內在的復制能力。這容許對抗逆轉錄病毒藥物在抑制病毒復制和選擇具有降低的復制能力的抗性病毒方面的功能進行定量剖析。所公開的分析提供了對抗逆轉錄病毒治療失敗的患者合理評價治療決定的工具。WeberJanetal.,TheJournalofGeneralVirology,Aug2003，vol.84，no,Pt8公開了下述TaqMan實時PCR分析，以離體估計在多目標(pol和env)抗逆轉錄病毒治療階段中人類免疫缺陷病毒1型適應度。WO05/108588涉及基于HIV的重組病毒克隆，其是以下基因操作的結果HIV片段的刪除(例如，Nef基因)而不損失傳染能力；摻入不在人類細胞中表達的基因；插入LacZ基因；導入限制性位點以從基礎原病毒提取DNA片段和用來自被評估患者的基因取代基因。此外，本發明涉及所述克隆在與AIDS相關的分析方法中的應用。VanMaarseveenetal.，JournalofVirologicalmethods,vol.133,2006,pages185-194,公開了下述實時PCR分析，以測定HIV-l蛋白酶變體和/或逆轉錄酶變體的相對復制能力。
發明內容本發明涉及用于測定兩種HIV病毒在環境中的復制能力的體外或離體方法，所述方法包括下述步驟a)產生標簽化的重組傳染性病毒，其包含標簽化的HIVDNA栽體和來自第一目標HIV病毒的第一擴增子；其中通過在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導入一個或多個沉默突變來產生所述標簽化的HIVDNA栽體；其中所述標簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于(correspondsatmost)或重疊于來自所述第一目標HIV病毒的所述第一擴增子的側翼區域；其中所述一個或多個沉默突變被導入下述基因中，所述基因不被來自所述第一目標HIV病毒的所述第一擴增子包括；以及其中所述第一擴增子包含來自所述第一目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；b)產生未標簽化的重組傳染性病毒，其包含未標簽化的HIVDNA載體和來自第二目標HIV病毒的第二擴增子；其中所述未標簽化的HIVDNA栽體不包含在步驟a)的標簽化的HIVDNA載體中導入的一個或多個沉默突變；其中所述未標簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于(correspondsatmost)或重疊于來自所述第二目標HIV病毒的所述第二擴增子的側翼區域；以及其中所述第二擴增子包含來自第二目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；c)在給定環境中在細胞培養物中混合步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及d)通過檢測所述標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中的一個或多個沉默突變，和通過檢測未標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中一個或多個沉默突變的缺乏，通過定量擴增測定總病毒群體內標簽化的重組傳染性病毒的比例和未標簽化的重組傳染性病毒的比例。特別地，所述第一目標病毒可以是WT病毒，所述第二目標病毒可以是突變病毒毒林，或者反過來。備選地，所述第一目標病毒可以是突變病毒毒林，所述第二目標病毒可以是不同的突變病毒毒林。在一個實施方式中，本發明涉及上文提及的方法，其中針對環境中三種或更多種目標HIV病毒來測定復制能力，所述方法包括下述步驟a)產生上文提及的方法的步驟a)的標簽化的重組傳染性病毒；b)產生上文提及的方法的步驟b)的未標簽化的重組傳染性病毒；c)產生其它一種或多種標簽化的重組傳染性病毒，每種包含標簽化的HIVDNA栽體和來自其它一種或多種目標HIV病毒的第三種或后續的擴增子；其中通過在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導入一個或多個沉默突變來產生所述標簽化的HIVDNA載體，所述一個或多個沉默突變不同于這種方法的步驟a)的所述第一標簽化的HIVDNA載體的一個或多個沉默突變；其中每種所述標簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于(correspondsatmost)或重疊于來自所述第三或后續的目標HIV病毒的所述第三或后續的擴增子的側翼區域；其中所迷一個或多個沉默突變被導入下述基因中，所述基因不被來自所述第三或后續的目標HIV病毒的所述第三或后續的擴增子包括；以及其中所述第三或后續的擴增子包含來自所述第三或后續的目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；d)在給定的環境中在細胞培養物中混合步驟c)的重組傳染性病毒和步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及e)通過檢測每種所述標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中的一個或多個沉默突變，和通過檢測未標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中一個或多個沉默突變的缺乏，通過定量擴增測定總病毒群體內每種標簽化的重組傳染性病毒的比例和未標簽化的重組傳染性病毒的比例。本發明提供了重組病毒標記物病毒系統，其中每種所述標簽化的的主干(backbone)。重組病毒標記物病毒系統進一步提供了被設計來恢復、制備和分析幾種和各種HIV遺傳材料的原病毒DNA、質粒構建體、引物和探針。在一個實施方式中，標簽化的HIVDNA載體或未標簽化的HIVDNA栽體是原病毒HIVDNA或質粒DNA。因為對一個或多個栽體進行了標簽化，所以可以通過用定量的擴增來定量每種標簽化的基因的頻率，來容易地測定攜帶每種標簽化的序列的混合培養物中的病毒的比例。從而避免了為每種等位基因設計獨特的引物的需要。此外，與原始分離株相比，使用重組病毒消除了感興趣的編碼區外部的多態性或突變對相對適應度的可能影響。這些重組克隆的主要益處之一是在相同的遺傳背景下在當前蛋白酶和逆轉錄酶抑制物的選擇的情況下研究特定編碼區的靈活性。實際上，與HIV-l原始分離林相比，使用重組病毒消除了目標編碼區外部的多態性或突變的可能的適應度影響。因而，獲得了可以用于研究所有類型的HIV變體的適應度的完全標準化方案。測定病毒適應度的方法對于設計治療方式可能是有用的。例如，一種方法可以包括測定在存在一種或多種藥物的情況下患者的臨床分離林的相對復制能力，并使用所述相對復制能力來確定該患者的適合的藥物療法。本發明還提供了下述方法，來幫助科學家研究在存在或缺乏環境因素時不同的HIV毒林的進化，所述環境因素例如但不限于，藥物壓力，稀釋因子，竟爭性結合蛋白質例如白蛋白、Ctl-糖蛋白，細胞系等等。此外，本發明提供了選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的引物;HIV質粒載體，其包含HIV基因中標簽化的或未標簽化的序列和gag、pol或env基因基因序列、其部分和其組合的刪除，其中所述標簽4匕的序歹'J在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個或多個沉默突變。本發明進一步提供了用于定量HIV病毒的病毒適應度的試劑盒。用于測定在一定環境中兩種或更多種HIV病毒的病毒適應度的此類試劑盒包含i)選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種引物；和/或ii)一種或多種標簽化的HIV質粒栽體和任選的未標簽化的HIVHXB2D質粒載體；和iii)任選的用于定量擴增的探針，如本發明所描述的。還可用至少一種HIV抑制物來使得此類試劑盒完整化。任選地，可以添加帶有WTHIV序列的參考原病毒DNA或質粒。任選地，對于HIV感染易感的細胞可以添加到試劑盒中。此外，可以添加其它環境因素。通過定量擴增對總病毒群體中一種或多種標簽化的重組傳染性病毒的比例和未標簽化的重組傳染性病毒的比例的測定通過體外擴增技術來進行，所述技術包括但不限于，聚合酶鏈式反應(PCR)、鏈交換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、自持的序列復制(3SR)、基于轉錄的擴增(TAS)、滾環擴增(RCA)、環介導的等溫擴增(LAMP)和連接酶鏈式反應(LCR)(由Schweitzer,B.andKingsmore,S.，2001，Combiningnucleicacidamplificationanddetection.CurrentOpinioninBiotechnology,12:21-27綜述)。可以4吏用一些方案來實時監測通過體外擴增技術產生的擴增子積累，所迷方案采用LuxTM發熒光引物、可被DNAzymes、QZymes或MNAzymes裂解的探針、TaqMan⑧探針、分子信標、蝎子引物(scorpions)或任何其它FRET探針。本發明進一步提供了一種方法，其中通過采用MNAzymes作為監視技術的聚合酶鏈式反應進行定量擴增。來自病毒適應度實驗的結果可以用于針對大量的WT和突變HIV毒林開發存在或不存在特定環境因素下特定擴增子的復制能力水平的數據庫。特定擴增子的基因型或表型可以與存在其它病毒的情況下所述特定擴增子的復制能力相關聯。檢索相同的基因型或表型，向數據庫進一步提問來鑒定對于任何被檢索序列來說是否已知相應的病毒適應度。在后一種情況中，可以確定有效的病毒適應度。可以生成報告，包括病毒抹相對于一種或多種其它毒株(包括WT)的病毒適應度，研究中的毒林的基因型和/或表型，以及其它信息，如測試的環境因素、生物制劑篩截，等等。這種數據庫可以與gag、pol或env基因序列信息一起被分析，結果用于確定合適的治療策略。-附圖l,在中心部分，是完整HIV基因組的示意圖。在上部，包膜基因是強調示出的，其表明了標簽的位置以及以及用于檢測該標簽的引物結合的位置。在下半部分，是用于擴增gag蛋白酶擴增子的引物結合的位置的示意圖概觀，其稍后可以與合適的標簽化的或未標簽化的質粒載體重新結合。-附圖2顯示了pGEM載體pGEM-HIVdelGPRT的圖鐠(登記號nrLMBP4568,于2002年7月1日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時微生物協作保藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所述載體具有gag蛋白酶逆轉錄酶編碼序列的刪除。-附圖3顯示了pGEM栽體的圖語(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env))(登記號nrLMBP5112,于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時樣i生物協作保藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所述載體具有gag蛋白酶逆轉錄酶編碼序列的刪除，并還包含標簽化的包膜基因。-附圖4顯示了pGEM載體的圖鐠(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int))(登記號nrLMBP5113,于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時樣i:生物協作^f呆藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所迷載體具有gag蛋白酶逆轉錄酶編碼序列的刪除，并還包含標簽化的整合酶序列。-附圖5是對MT4細胞中各種相對輸入濃度下HIVHXB2DWT和標簽化的mVHXB2D的隨時間的病毒生長情況的比較。-附圖6描繪了對來自使用雙標記共感染的MT4細胞的HIVHXB2DWT和標簽化的HIVHXB2DDNA的檢測。-附圖7a、7b和7c顯示了針對模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA的擴增曲線，其中用引物SEQIDNO:7和6進行擴增。B-FAM標記對應于HIVHXB2DDNA(附圖7a)，D-JOE對應于標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖7b),TAMRA對應于持家基因(GAPD)(附圖7c)。-附圖8a、8b和8c顯示了針對模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA的擴增曲線，其中用引物SEQIDNO:5和6進行擴增。B-FAM標記對應于HIVHXB2DDNA(附圖8a)，D-JOE對應于標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖8b)，TAMRA對應于持家基因(GAPD)(附圖8c)。-附圖9a、9b和9c顯示了針對模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA的擴增曲線，其中用引物SEQIDNO:8和9進行擴增。B-FAM標記對應于HIVHXB2DDNA(附圖9a),D-JOE對應于標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖9b)，TAMRA對應于持家基因(GAPD)(附圖9c)。-附圖10a、10b和10c顯示了針對模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA的擴增曲線，其中用引物SEQIDNO:5、6、7、8和9進行擴增。B-FAM標記對應于HIVHXB2DDNA(附圖10a),D-JOE對應于標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖10b)，TAMRA對應于持家基因(GAPD)(附圖10C)。-附圖U提供了附圖7-10中顯示的擴增的材料的終點凝膠電泳的圖。-附圖12是對MNAzyme的示范性設計的描述，其中partzymesA和B的底物臂部分(A)結合報告物(Reporter)底物，其上附著了熒光標簽(左)和淬滅劑(右)。催化核心部分(C)位于底物臂部分(A)和感受器臂部分(B)之間。在感受器臂部分(B)與目標(Target)結合時，報告物(Repoter)底物在MNAzyme裂解位點(MNAzymeCleavageSite)被裂解，從而增加了熒光。-附圖13:多目標的示范性多路分析的示意圖可以使用兩種或更多種底物同時檢測兩種或更多種目標，每種底物特異于一種MNAzyme。優選地，用不同的熒光基團標記底物。在這個實施例中，目標l可以通過監視FAM熒光方面的提高來檢測，目標2可以通過監視JOE熒光方面的提高來檢測。Q:淬滅劑；FAM，JOE:熒光基團。-附圖14呈現了用于監視HIV病毒適應度的MNAzymePCR分析的實例。闡述了雙鏈PCR分析，其使用兩種MNAzymes用于兩個序列的同時檢測和定量。上部的序列HIVHXB2DWT,含有位于被MNAzyme1識別的第二區域的5'的野生型(WT)序列。在笫二(3')區域中的灰色圓圏相應于為標簽化的野生型堿基。所述下部的序列標簽化的HIVHXB2D含有通過感興趣的HIV目標病毒(T)的擴增衍生的序列，其位于由MNAzyme2識別的第二區域的5'。在第二(3')區域中的條紋方形相應于沉默突變(標簽化的堿基)。正向PCR引物(箭頭5'P)和反向PCR引物(箭頭3'P)指示了上部的HXB2DWT和下部的標簽化的HXB2D序列。MNAzyme1在存在上部HXB2DWT擴增子的情況下適應度，產生在FAM(F)和淬滅劑(Q)之間裂解底物1(S-l)的活性核酸酶。MNAzyme2在存在下部的標簽化的HXB2D序列的情況下適應度，產生在JOE(J)和淬滅劑(Q)之間裂解底物2(S-2)的活性核酸酶。發明的簡要說明定義術語"病毒適應度"是指任何HIV-1變體在給定環境下，例如在存在或不存在藥物的細胞系統中的復制能力。術語"標簽"是指化學部分，其是核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸，當其取代另一個序列或添加至另一個序列時，為該序列提供了額外的用途，或賦予了有用的性質，特別是在對其檢測或分離方面。特別地，在本發明中，術語"標簽"是指下述一個或多個核苷酸，其在HIVDNA載體中被具有獨特性的其它一個或多個核苷酸替換，這些核苷酸的替換都是沉默突變，其不破壞HIVDNA的閱讀框。在本發明中，一個或多個沉默突變被導入HIVDNA栽體中，特別是選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中，從而產生"標簽化的HIVDNA栽體"。"未標簽化的HIVDNA載體"是指不包含導入所迷標簽化的HIVDNA栽體中的一個或多個沉默突變的栽體。"擴增子"被定義為通過離體或體外核酸擴增技術產生的任何核酸分子。特別是，擴增子包含當與引物接觸時能與引物雜交并且可以是整個分子或其部分的序列。來自目標HIV病毒的擴增子是指感興趣的HIV目標病毒的核酸序列，它的復制能力將要通過本發明來測定。特別地，來自目標HIV病毒的擴增子包含HIV基因之一或其部分以及其組合，所述基因選自gag、pol和env基因，即，gag基因、pol基因的DBM編碼區、pol基因的逆轉錄酶編碼區、pol基因的整合酶編碼區、env基因、其部分、以及其組合。特別地，來自目標HIV病毒的擴增子選自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env和其部分。另外，擴增子可以包括側翼區域，例如，對于gag-PR和PR-RT基因，具有5'LTR序列的那些側翼區域或其部分。應當理解，這種擴增子可以是各種來源的，包括質粒、來自患者的材料或實驗室病毒，包括IIIB和NL4-3，或任何其它突變的或WT病毒。來自目標HIV病毒的擴增子不能與在定量擴增期間擴增的序列混淆。這種最后的序列或擴增子分別對應于標簽化的HIVDNA載體或未標簽化的HIVDNA載體的標簽化的或未標簽化的區域。這些標簽化的HIVDNA栽體或未標簽化的HIVDNA載體最后與來自目標HIV病毒的擴增子重新組合，定量擴增的序列來源于重組病毒。特別地，定量擴增的擴增子包含或缺少在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導入的一個或多個沉默突變。"引物"是指DNA或含DNA的核酸分子的短片段，其(i)能在經由聚合酶;導的合成啟動，^本身物理地擴大。-'〃、'目標核酸序列的"擴增"是指體外目標擴增技術，借此目標序列被拷貝，產生充當進一步的擴增循環的模板的擴增子。這種體外擴增技術包括但不限于，聚合酶鏈式反應(PCR)、鏈交換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、自持的序列復制(3SR)、基于轉錄的擴增(TAS)、滾環擴增(RCA)、環介導的等溫擴增(LAMP)和連接酶鏈式反應(LCR)。"環境"是指藥物壓力，例如抗病毒藥物、抗生素或任何其它藥物，竟爭性結合蛋白質，例如白蛋白、al糖蛋白、毒素，特定類型的介質、血清和其成分，稀釋因子，細胞系，溫度，壓力，放射等等。治療或治療方式是指通過使用藥物、以給定劑量、時間間隔、持續時間、單獨地或不同組合地，經由不同的給藥途徑，在適合的制劑中，等等，對個體的醫學狀況的管理或處理。"藥物"是指任何試劑，例如化學治療劑、肽、抗體、反義物、核酶和任何它們的組合，無論它是市場化的還是正在開發的。可以在本發明的分析中測試的抗HIV藥物的實例包括所有批準的和正在開發的核苷酸、核苷以及非核苷RT抑制物、PR抑制物、侵入抑制物、包膜抑制物和整合酶抑制物。HIV抑制物包括核苷逆轉錄酶抑制物(NRTI)、核苷酸逆轉錄酶抑制物(NtRTI)、非核苷逆轉錄酶抑制物(NNRTI)、蛋白酶抑制物(PI)、侵入抑制物、融合抑制物、gp41抑制物、gpl20抑制物、整合酶抑制物、共同受體抑制物(例如，CCR5、CXCR4、...)、出芽/成熟抑制物，等等。HIV核苷RT抑制物包括其作用機制包括抑制病毒RT酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HIV核普逆轉錄酶抑制物包括疊氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、扎西他濱(ddC)、去羥肌苷(ddl)、阿巴卡韋(ABC)。的那些化合物^舉例^言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HHIV非核苷逆轉錄酶抑制物包括奈韋拉平、地拉韋定、施多寧、TMC120、TMC125、卡普韋林、calanolide、UC781、SJ-1366、二苯甲酮、PETT化合物、TSAO化合物。的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HIV非核苷酸逆轉錄酶抑制物包括阿德福韋(PMEA)、替諾福韋(PMPA)和其它膦酸酯。HIV蛋白酶抑制物包括其作用機制包括抑制病毒蛋白酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HIV蛋白酶抑制物包括利托那韋(RTV)、茚地那韋(IDV)、奈非那韋(NFV)、安普那韋(APV)、替利那韋(SC-52151)、替拉那韋(TPV)、沙奎那韋(SQV)、洛匹那韋(LPV)、阿扎那韋、帕利那韋、莫折那韋、BMS186316、DPC681、DPC684、AG1776、GS3333、KNI-413、KNI-272、L754394、L756425、LG-71350、PD161374、PD173606、PD177298、PD1783卯、PD178392、PNU140135、山楂酸、U-140690、RO033-4649、TMC114、TMC26，它們的前體藥物、代謝物、N-氧化物和鹽。HIV侵入抑制物或gpl20抑制物包括其作用機制包括抑制病毒侵入或gpl20糖蛋白的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，現有的將來新的化合物，HIV進入或gpl20抑制物包括BMS806、硫酸葡聚糖、蘇拉明、菊苣酸。HIV融合抑制物或gp41抑制物包括其作用;f幾制包括抑制病毒融合或gp41糖蛋白的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HIV融合或gp41抑制物包括T20、T1249。HIV整合酶抑制物包括其作用機制包括抑制病毒整合酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，HIV整合酶抑制物包括L-870810、L-870812、pyranodipyrimydines、S-1360。共同受體抑制物包括其作用機制包括抑制HIV與細胞膜上存在的細胞受體(例如CCR5、CXCR4)的相互作用的那些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，共同受體抑制物包括TAK779、AMD3亂AMD8664、AMD070、SHC國C、SHC-D、AK602、TAK-220、UK-427,857、T22。些化合物。舉例而言(且不限于現有的和將來新的化合物)，Hrv、出芽/成熟抑制物包括PA-457。術語"嵌合"指包含來自不同來源的核酸材料的構建體，例如，WT病毒與實驗室毒株的組合、WT序列和受試者衍生的臨床分離物序列的組合。病毒如本文所使用的，人類免疫缺陷病毒(HIV)是指下述任何HIV,其包括實驗室毒抹、野生型毒林、突變毒抹和包含至少一種HIV病毒(例如，HIV臨床分離抹)的任何生物樣品。與本發明相符的HIV毒抹是能夠感染哺乳動物、特別是人類的任何這種毒抹。實例有HIV-1、HIV-2和SIV。對于本發明的實施，HIV病毒是指包含至少一種HIV病毒的任何樣品。例如，樣品可以從個體、從細胞培養物獲得，或使用重組技術或克隆來產生。與本發明相符的HIV毒林是能夠感染細胞系和人類的任何這種毒林。用于獲得質粒的病毒林優選是HIV野生型序列，例如LAI、用于B亞型HIV研究的HXB2D。LAI,也稱為IIIB，是野生型HIV毒抹。它的一個特別的克隆(這意味著一條序列)是HXB2D。這種HXB2D序列可以摻入質粒中。也可以使用來自其它亞型或群組的HIV的其它克隆。HIVDNA,例如原病毒DNA，可以代替病毒RNA用于本文描述的方法。在使用RNA的情況中，需要通過適合的逆轉錄酶將其逆轉錄成cDNA。描述RNA分析的方案也可以用于DNA分析。然而，如果方案從DNA開始，本領域的技術人員將知道不需要逆轉錄。被設計賴以擴增RNA鏈的引物也與DNA退火并擴增DNA。逆轉錄和擴增可以用單個引物集進行。適合地，可以用半嵌套方法，或更適合地，嵌套方法來逆轉錄和擴增遺傳物質。來自目標HIV病毒的擴增子來自目標HIV病毒的擴增子可以從HIV-1臨床分離物、定點突變體、或從選擇實驗得出的病毒獲得。任何類型的患者樣品可以用于獲得期望的擴增子，例如，血清、血液和組織。病毒RNA可以使用已知的方法分離，例如在Boom,R.etal.(Boom，R.etal.(J.Clin.Microbiol.28(3):495-503(1990),通過引用合并進本文)中描述的，或通過其它常規方法，例如酸苯酴方法(例如，酸胍-笨酚-氯仿(AGPC)方法)、異硫氰酸胍操作、采用Chomczynski和Sacchi的方法(Anal.Biochem.162，156-159(1987))。備選地，可以用許多商業的方法例如QIAAMP病毒RNA試劑盒(Qiagen,Inc.),從體液如血漿、血清或無細胞液體獲得病毒RNA。也可以利用Trizol(Gibco),按照廠家所述，從沉淀的病毒分離病毒RNA。用于分離病毒RNA的其它商業的試劑盒包括但不限于，QiagenRNeasy試劑盒、Catrimox-14RNA分離試劑盒Ver.2.11(TaKaRa)、RNAgents總RNA分離系統(Promega)、RNAzol、Tel-Test、Stratagene、Tri-ReagentBD(Sigma)、purescript總RNA分離試劑盒(GentraSystems,orQiagen)。可以使用本領域技術人員已知的方法，例如Maniatis等人(1982)描述的過程從組織提取DNA，其涉及制備細胞溶胞產物，隨后用蛋白酶K消化，通過多步驟的笨酚、乙醇沉淀和核糖核酸酶消化提取，實現DNA純化。任選地，也可以用可獲得的商業方法，來從體液獲得DNA，例如用QIAAMPBlood試劑盒用于從血液和體液的DNA分離(Qiagen,Inc.)。互補DNA可以用SensiscriptRT(Qiagen)合成。核酸可以通過一些技術來擴增，例如聚合酶鏈式反應(PCR)、鏈交換擴增(SDA)、滾環擴增(RCA)、環介導的等溫擴增(LAMP)、轉錄介導的擴增(TMA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、自持的序列復制(3SR)、基于轉錄的擴增(TAS)和連接酶鏈式反應(LCR)。HIVDNA載體本發明涉及標簽化的和未標簽化的HIVDNA栽體。這種病毒DNA可以是原病毒DNA,即，是能復制的準型病毒，或其它類型的栽體，例如質粒。特別地，原病毒DNA和載體或質粒具有在其DNA序列中的刪除，所述刪除最多對應于或重疊于來自以上所指目標HIV病毒的擴增子的側翼區域。在一個實施方式中，本發明涉及標簽化的和未標簽化的質粒，以及涉及在本文公開的方法中使用所述質粒。完整的HIV序列可以摻入質粒中，或者僅其一部分，例如，本發明中使用的質粒缺少gag、pol和env基因、其部分和其組合。所述刪除還可以包含部分側翼基因，或最終超過一個基因。適合的質粒主干可以選自包括pUC、pBR322和pGEM的組。在一個實施方式中，每種標簽化的HIVDNA載體和未標簽化的HIVDNA載體包含野生型或突變毒抹的主干。在一個實施方式中，由標簽化的和未標簽化的HIVDNA栽體包含的質粒DNA包含HXB2D野生型毒株的基因組。例如，可通過用合適的限制性內切酶處理較長的DNA、用合適的純化方法純化消化物、然后使這樣獲得的感興趣DNA片段自我連接，來制備含有本發明的DNA的刪除構建體。因而，本發明的刪除構建體的構建可以通過用限制性內切酶例如Clal和BcII限制性內切酶消化來實現，這兩個酶在特定的位點裂解質粒主干并從而除去gag和蛋白酶序列。備選地，在除去gag和蛋白酶序列之前，可以通過沉默突變將Munl或Nhel位點插入質粒中，之后用Munl/BssHn或Nhel/BcII分別消化，隨后除去gag和蛋白酶序列。獨特的限制性位點指在核酸上被限制性內切酶識別的一個位點的單次出現，或者它不發生在構建體中的別處。可以在擴增之后通過重新連接擴增的質粒的DNA的5'和3'末端來創建獨特的限制性位點。備選地，獨特的限制性位點可能不必創建，因為它可能已經完全地位于末端之一中，5'或3'末端。任選地，可以插入獨特的限制性位點。任選地，獨特的限制性位點的部分可以存在于要擴增的區域中。從擴增衍生的獨特的限制性位點的創建是優選的方法，因為這是單步驟的、直接的、簡單的和快速的方法。獨特的限制性位點進一步與重組病毒的產生相關。本領域技術人員應當理解，獨特的限制性位點的產生將取決于HIV基因組的序列，以及取決于要由此刪除的序列。可以用于本發明中的獨特的限制性位點是在HIV基因組中僅出現一次的那些，并且可以側翼于要刪除的感興趣區域，并且不改變閱讀框或由感興趣核酸所編碼的蛋白質的序列。任選地，用于擴增的引物可以含有相同的或其它的特異性限制性內切酶位點來便于插入不同的載體中。另外，用于擴增的引物之一可以含有磷酸化的5'末端-接頭以便于外源擴增子的插入。任選地，獲得含有下述WTHIV序列的質粒的方法可以在第二克隆載體中進行，所述WTHIV序列在最多對應于或重疊于要重新組合的擴增子的側翼區域的區域中具有刪除。例如，蛋白酶-逆轉錄酶區域可以被插入克隆栽體例如pGEM質粒中，例如，pGEM3載體的主干可以通過擴增被使用和操作，以除去蛋白酶和/或逆轉錄酶編碼區的部分，從而使得來自樣品的其余蛋白酶-逆轉錄酶序列的插入以不會破壞閱讀框的方式進行。被操作的蛋白酶-逆轉錄酶區域隨后被放入pGEM-HXB2D載體中，從而它除了含有相關的蛋白酶-逆轉錄酶刪除之外還含有完全的野生型HIV序列。蛋白酶-逆轉錄酶刪除載體的實例是pGEM-HXB2DAPR-RT，其具有包含整個蛋白酶編碼區和大部分逆轉錄酶編碼區的刪除。逆轉錄酶刪除載體的實例是pGEM-HXB2D△RT,其具有逆轉錄酶編碼區的刪除。技術人員應當理解，本領域已知的其它的HIV栽體和克隆操作也可以用于創建缺少gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env的質粒，用于與受試者衍生的序列重組或連接以及創建傳染性病毒。例如，可以通過重新將gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因的部分導入質粒中來制備刪除構建體，在所述質粒中早先已經分別刪除了gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT曙int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因。用于擴增感興趣的區域，即要重新導入的部分的引物是本領域技術人員已知的。一般地，必須創建載體以容許刪除的序列的重新插入而不破壞gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR曙RT漏int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT和env基因的閱讀框。可以通過將一個或多個沉默突變導入以上討論的質粒構建體來獲得標簽化的HIVDNA載體。沉默突變的導入將應用于形成質粒的部分的那些基因，即，不形成來自目標HIV病毒的擴增子的部分的那些基因。一個或多個沉默突變可以摻入質粒的任何mv基因，只要產生的重組病毒的表型保持不變即可。在一個實施方式中，一個或多個沉默突變的導入在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中進行。在另一個實施方式中，沉默突變的導入在env或pol基因中，特別是在編碼包膜蛋白質的env區域中、或在編碼整合酶的pol區域中進行。在另一個實施方式中，沉默突變的導入在env基因中進行，在密碼子1和857之間、特別是在密碼子100和800之間、更特別是在密碼子200和600之間、又更特別是在密碼子300和500之間、例如在密碼子400和500之間、例如在密碼子430和490之間、特別是在密碼子468和475之間。在另一個實施方式中，沉默突變的導入在編碼整合酶酶的pol基因的區域中進行，在密碼子1和288之間、特別是在密碼子50和275之間、更特別是在密碼子100和250之間、又更特別是在密碼子150和250之間、例如在密碼子200和250之間、特別是在密碼子230和231之間。沉默突變的這種引入可以通過使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene)和對感興趣區域的適合的誘變寡核苷酸引物來實現。定點誘變容許產生點突變，交換核苷酸以及刪除或插入單個或多個核苷酸，可能具有氨基酸水平上的改變。對于本發明的范圍，定點誘變被用于在感興趣的基因中插入沉默突變。基本過程使用質粒DNA和兩個寡核苷酸引物，所述引物與質粒的反鏈互補并含有期望的突變。這些引物在聚合酶鏈式反應(PCR)期間擴增，這繼之以用限制性內切酶DpnI消化，限制性內切酶Dpnl是對于曱基化的和半曱基化的DNA的特異性核酸內切酶。在這種消化期間，親本質粒將被除去。具有期望的突變的新創建的質粒可以用于轉4匕E.coli。特別地，適合的誘變寡核苷酸引物是本文下文描述的引物和它們的同源物，本文要求了對它們的保護。SEQIDNO:l-2的引物對于將沉默突變摻入pol基因的整合酶編碼區域是有用的，SEQIDNO:3-4對于將沉默突變摻入HIV衍生的質粒的包膜基因中是有用的。表l:誘變寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些引物選自SEQIDNO:1-4，或使用本領域的技術人員已知的算法如FASTA和BLAST測定時與SEQIDNO:1-4具有至少80%的同源性、優選的90%的同源性、更優選的95%的同源性。在此列出的引物序列任選地可以;故標記。適當地，這種標記可以4吏用熒光、發光或吸光度來檢測。此外，位于在此給出的序列上游或下游50個核苷酸(nt)的區域內的引物是本發明的一部分。特別地，引物可以位于在此給出的序列的上游或下游20nt的區域內，它們也是本發明的一部分。并且，包含本文所述的任何引物中存在的至少8個連續堿基的引物構成了本發明的實施方式。感興趣地，引物包含在此處描述的任一引物中存在的至少12個連續堿基。在本發明的一個方面，引物可以含有接頭區域用于克隆。任選地，引物的接頭區域可以含有限制性內切酶識別位點。優選地，所述限制性內切酶識別位點是獨特的限制性內切酶識別位點。備選地，引物可以與目標區部分地退火。突變序列的存在可以通過最終質粒克隆的DNA測序來確認。本發明提供了HIV質粒載體，其包含標簽化的序列；和gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；其特征在于標簽化的序列在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個或多個沉默突變；條件是所述一個或多個沉默突變不位于刪除的基因序列中。本發明進一步提供了HIV質粒栽體，其包含gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；并且沒有標簽化的序列。適當地，HIV質粒栽體來自HIV野生型毒林HXB2D(Ratneretal.(1987)AIDSRes.Hum.Retrovir.3:57-69])。適當地，標簽化的序列位于選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的一個或多個基因中,優選的位于evn或pol基因中，更優選的位于編碼包膜蛋白質的env區域中，或位于編碼整合酶的pol區域中。在本發明的一個實施方式中，標簽化的HIV質粒載體在env基因中包含標簽化的序列，其在密碼子1和857之間、特別是在密碼子100和800之間、更特別是在密碼子200和600之間、又更特別是在密碼子300和500之間、例如在密碼子400和500之間、例如在密碼子430和490之間、特別是在密碼子468和475之間。在env基因中包含標簽化的序列的這些HIV質粒栽體是要求被保護的。在本發明的另一個實施方式中，標簽化的HIV質粒載體在編碼整合酶的pol基因的區域中包含標簽化的序列，其在密碼子1和288之間、特別是在密碼子50和275之間、更特別是在密碼子100和250之間、又更特別是在密碼子150和250之間、例如在密碼子200和250之間、特別是在密碼子230和231之間。在pol基因的整合酶編碼區域中包含標簽化的序列的這些HIV質粒載體是要求被保護的。特別地，本發明提供了標簽化的HIVDNA載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)(登記號碼LMBP5112，SEQIDNO:28)和pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int)(登記號碼LMBP5113,SEQIDNO:29),其已經于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-Plasmidecollectievakgroepmoleculairebiologie的比矛J時孩i生物十辦作寸呆藏所中。標簽化的和未標簽化的重組傳染性病毒的產生通過將每種標簽化的或未標簽化的HIVDNA栽體與感興趣的編碼片段，即來自目標HIV病毒的擴增子一起轉染入細胞中，隨后通過細胞中的無細胞病毒上清液的傳代，可以產生重組的標簽化和未標簽化的傳染性的病毒。轉染可以通過電穿孔、連接、脂轉染或任何其它方法來實現。為了制備重組HIV病毒，gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env或其部分的擴增序列4皮摻入標簽化的或未標簽化的HIVDNA栽體中，所述栽體包含具有最多相應于所述擴增子的部分的刪除的HIV野生型或其突變毒抹。在擴增子和刪除構建體之間遺傳物質交換時產生傳染性的克隆，來產生HIV序列。可以通過在適合的宿主細胞中在載體和擴增子序列的重疊DNA片段之間的同源重組，來將來自目標HIV病毒的擴增子摻入合適的HIVDNA載體。備選地，可以根據本領域標準的克隆操作，在獨特的限制性位點，將來自目標HIV病毒的擴增子摻入載體中。后者是直接克隆策略。適合于直接克隆策略的是兩種不同的限制性位點，其被用來便于擴增子在合適的方向上的連接。可以保持重組病毒儲備用于將來的分析，例如，生存力測試。細胞培養細胞可以選自T細胞、單核細胞、巨嗟細胞、樹突狀細胞、郎格罕氏細胞、造血千細胞、外周血單核細胞(PBMC)或前體細胞、人類T淋巴樣千細胞系、MT4、MT2、CEM和PM-1細胞。對于HIV序列的同源重組，適合的宿主細胞包括MT4和PM-1。MT4是含有CXCR4共同受體的CD4+T細胞系。PM-1細胞系表達CXCR4和CCR5共同受體。所有上述細胞能夠在HIVDNA載體與來自目標HIV病毒的擴增子重組時產生新的傳染性病毒顆粒。在細胞培養中，細胞通常被維持在富含蛋白質的介質中，例如補充有10%的胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(例如青霉素和鏈霉素)的RPMI1640中。有趣地，在HIV感染之前，可以用植物凝集素對PBMC細胞進行若干天的刺激，并將其維持在R-20培養基中(補充有20%胎牛血清的RPMI1640)、L-谷氨酰胺、HEPES緩沖液、重組人類白細胞介素-2;青霉素和鏈霉素中。生長竟爭分析然后將重組標簽化的和未標簽化的病毒以不同的比例混合在一起，例如，0/100,25〃5,50/50,75/25，100/0。其它比例可以是0/100、20/80、40/60、60/40、80/20、100/0。如果測試超過兩種病毒，例如，三種，比例可以是例如0/0/100、0/33/66、33/66/0。混合的病毒樣品被用于感染細胞，所述細胞懸浮在有或沒有抗病毒藥物或任何其它環境成分中，如本文所描述的。因而，通常懸浮在介質中的細胞以傳染劑量的重組標簽化的和/或未標簽化的病毒來接種。測定病毒滴度(表示為感染復數，MOI)并調整到合適的范圍，優選在0.0001和0.01之間，更優選約0.001傳染性病毒單位/細胞。在本發明的一個實施方式中，包含標簽化的HIVDNA栽體和來自第一目標HIV病毒的第一目標擴增子的標簽化的重組傳染性病毒與包含未標簽化的HIVDNA載體和來自第二目標HIV病毒的第二目標擴增子的未標簽化的重組傳染性病毒混合。這些病毒在給定的環境中在細胞培養物中混合，通過定量擴增來測定在所述環境中所述標簽化的和未標簽化的重組病毒的復制能力。對細胞進行孵育、洗滌、重懸浮、重孵育，所有這些都按照需要來進行。在不同的時間收獲上清液，例如在第1、4、7、10和14天。從某一天開始，例如，開始孵育后的笫四天，培養物被傳代，在孵育、洗滌、重懸浮和重孵育之后，在特定的時點，例如第1、4、7、10、14或任何其它的一天從培養物上清液提取病毒RNA。病毒RNA提取可以根據本領域已知的的幾種技術實現，例如，通過使用QiagenRNA試劑盒。備選地，將細胞與重組傳染性病毒一起培養，在特定的時間點，收集細胞，進行基因組DNA提取。基因組DNA提取可以^f艮據本領域已知的幾種技術實現，例如，通過使用來自Invitek試劑盒InvisorbDNA細胞HTS96試劑盒/V用于純化基因組DNA。在群體中標簽化的重組病毒對比未標簽化的重組病毒的比例通過定量擴增來測定。定量擴增定量擴增提供了用于對將要測定復制能力的病毒進行直接定量所需的數據。在定量擴增期間，從如上所迷的細胞培養物或上清液提取的、重組病毒的標簽化的和相應的未標簽化的區域被擴增和檢測，這通常同時進行。任選地，持家基因可以用作內部對照。結果可以通過參考外部定量標準以絕對項表示，即，以原病毒DNA拷貝數/細胞數的數目，或以與樣品中存在的總病毒群體或另一種HIV病毒相比的相3于項。用于核酸序列擴增的技術是本領域已知的。這些包括DNA聚合酶介導的技術，例如聚合酶鏈式反應(PCR)(參見，例如美國專利No.4,683,202;美國專利No.4，683，195;美國專利No,4,000,159;美國專利No.4，％5，188;美國專利No.5,176,995)(Saikietal.，1985;Chehabetal.,1987)、鏈交換擴增("SDA")(Walkeretal.,1992)、滾環擴增("RCA")(Lizardietal.，1998)、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和環介導的等溫擴增("LAMP")(Notomietal.,2000;Nagamineetal.,2002)。其它目標擴增技術是由RNA聚合酶介導的，例如，轉錄介導的擴增("TMA")(Jonasetal.,1993)、自持的序列復制("3SR，，)(Fahyetal.,1991)和基于核酸序列復制的擴增("NASBA，，)(Compton,1991)。通過PCR、RT-PCR、SDA、RCA和LAMP產生的擴增產物("擴增子")由DNA組成；而RNA擴增子由TMA、3SR和NASBA產生。一種已知的定量擴增技術是實時PCR。聚合酶鏈式反應(PCR)在專利NO.US4683195和US4683202中描述。本文使用的術語"實時PCR"是指從PCR分析發射的信號在反應期間被監測，作為每個PCR擴增循環期間擴增子產量的指標，即，"實時"地，這與常規的PCR不同，在常規PCR中分析信號在PCR反應的結束時檢測。實時PCR—般基于對焚光報告物的檢測和定量。信號增加與反應中PCR產物的數量成正比。通過記錄每個循環中熒光發射的數量，有可能在指數期監視PCR反應，其中在PCR產物數量方面的第一次顯著提高與目標模板的初始數量相關。對于"實時PCR"的一般性說明，參見Deheeetal.J.Virol.Meth.102:37-51(2002);和Aldeaetal.J.Clin.Microbiol.40:1060-1062(2002)(對于"LightCycler,，，,其中實時的、動力學的定量容許測量在PCR的log線性階段期間進行)。在本發明的一個實施方式中，被定量擴增的HIV標簽化重組病毒的序列包含在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中的一個或多個沉默突變。在本發明的一個實施方式中，被定量擴增的HIV未標簽化的重組病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV標簽化重組病毒的所述一個或多個沉默突變，即，它缺少所有選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因的一個或多個沉默突變。在本發明的另一個實施方式中，被定量擴增的HIV標簽化重組病毒的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區域中的一個或多個沉默突變。在本發明的另一個實施方式中，被定量擴增的HIV未標簽化的重組病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV標簽化重組病毒的一個或多個沉默突變，即，它缺少所有在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區中的所述一個或多個沉默突變。在一個實施方式中，特異于標簽化的和未標簽化的重組傳染性病毒的定量擴增的正向和反向引物包括SEQIDNO:5-12。SEQIDNO:5是正向引物，其延伸標簽化的包膜基因，即，包含一個或多個沉默突變的包膜基因。SEQIDNO:6是反向引物，其延伸標簽化的包膜基因和WT包膜基因。SEQIDNO:7是正向引物，其延伸WT包膜基因。SEQIDNO:8-9是正向和反向引物，其延伸持家基因或對照基因。SEQIDNO:IO是正向引物，其延伸標簽化的整合酶編碼序列，即，包含一個或多個沉默突變的整合酶編碼序列，以及WT整合酶編碼序列。SEQIDNO:ll是反向引物，其延伸標簽化的整合酶編碼序列。SEQIDNO:12是反向引物，其延伸WT整合酶編碼序列。其它的序列可以附加到正向引物上以容許實時PCR監視。此類序列可以包括但不限于，用于LUXTM檢測的發熒光探針、用于zymogene檢測的反義DNAzyme序列、以及Scorpion探針序列。任選地，用于實時監測的附加的序列可以附著于反向引物。表2:特異于標簽化和未標簽化重組傳染性病毒的定量擴增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在進一步的實施方式中，特異于標簽化和未標簽化的重組傳染性病毒的定量擴增的正向和反向引物包括SEQIDNO:19-20，和24-25。SEQIDNO:19是正向引物，其延伸標簽化的包膜基因和WT包膜基因。SEQIDNO:20是反向引物，其延伸標簽化的包膜基因，和WT包膜基因。SEQIDNO:24是正向引物，其延伸人類基因組RPLPO基因。SEQIDNO:25是反向引物，其延伸人類基因組RPLPO基因。表3:特異于標簽化和未標簽化重組傳染性病毒的定量擴增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>上文描述的引物和它們的同源物是被要求保護的。這些引物選自SEQIDNO:5-12、19-20和24-25,或如使用本領域技術人員已知的算法如FASTA和BLAST確定的具有至少80%的同源性、優選的90%的同源性、更優選的95%的同源性。在此列出的引物序列任選地可以被標記。適當地，可以使用熒光、發光或吸光度來檢測這種標記。此外，位于在此給出的序列上游或下游50個核苷酸(nt)的區域內的引物構成了本發明的部分。特別地，引物可以位于在此給出的序列的上游或下游20nt的區域內，并且也構成了本發明的部分。并且，包含在此處描迷的任一引物中存在的至少8個連續堿基的引物構成了本發明的實施方式。感興趣地，引物包含在此處描述的任一引物中存在的至少12個連續堿基。在本發明的一個方面，引物可以含有接頭區域用于克隆。任選的，引物的接頭區域可以含有限制性內切酶識別位點。優選的，所述限制性內切酶識別位點是獨特的限制性內切酶識別位點。做為選擇，引物可以與目標區部分地退火。實時PCR的方法使用熒光引物或探針，例如LUX發熒光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探針、T叫Man⑧探針、分子信標、scorpions或任何其它FRET探針。在本發明的其它實施方式中，定量擴增采用能夠裂解熒光探針的MNAzymes。在根據本發明的方法中，定量擴增可以通過聚合酶鏈式反應、鏈交換擴增或轉錄介導的擴增進行，采用LUXTM發熒光引物、TaqMan⑧探針、分子信標、scorpions、DNAzymes、MNAzymes或任何其它與FRET探針聯結的引物。在一個實施方式中，所述定量擴增通過聚合酶鏈式反應進行，并采用MNAzymes,即，采用在MNAzymes附近的引物和尋皮MNAzymes裂解的探針。LUXTM引物是用單個熒光基團標記的寡核苷酸。其一般長度為20-30個堿基，它們被設計為具有靠近發夾結構中3'末端的熒光基團。這種結構內在地使得具有焚光猝滅能力；從而不需要獨立的淬滅部分。當引物變為摻入雙鏈PCR產物時，熒光基團被去淬滅，引起熒光信號的顯著提高。TaqMan⑧探針(Heidetal.,1996)利用Taq聚合酶的發焚光5'核酸外切酶活性來測量cDNA樣品中目標序列的數量。TaqMan⑧探針是寡核苷酸，其含有通常在5'堿基處或附近的熒光染料以及通常在3'堿基處或附近的淬滅部分。淬滅劑部分可以是染料，例如TAMRA,或者可以是非熒光分子，例如4-(4-二甲基氨基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)。當被照射時，被激發的熒光染料將能量轉移到附近的淬滅染料分子而不是發熒光(這稱為FRET-F6rster或熒光共振能量傳遞)。因而，報告物和淬滅劑的緊密接近防止任何熒光的發射，此時探針是完整的。TaqMan探針被設計來與PCR產物的內部區域退火。當聚合酶復制結合了TaqMan⑧探針的模板時，它的5'核酸外切酶活性裂解探針。這結束了淬滅劑的活性(沒有FRET),報告物染料開始發射熒光，其在每個循環與探針裂解的速率成比例地提高。PCR產物的積累通過監視報告染料的熒光方面的提高來檢測(注意到引物未被標記)。TaqMan⑧分析使用了通用的熱循環參數和PCR反應條件。由于裂解僅當探針與目標雜交時發生，檢測的熒光來源于特異性擴增。雜交和裂解的過程不受產物的指數性積累的影響。發熒光探針的一種特殊的需求是在5'末端不能是G。鄰近于報告物染料的"G"甚至在裂解之后也淬滅報告物熒光。分子信標是用于鑒定細胞內存在的特定核苷酸序列的探針(Tyagietal.，(1998)NatureBiotechnology16:49-53)。分子信標可以僅由核酸組成，例如DNA或RNA,或者它可以由肽核酸(PNA)結合物組成。分子信標與特定核苷酸序列的結合允許體內或體外地鑒定那些序列的存在。分子信標包括結合物(例如，一種結構，例如量子點標簽化的珠子)、探針、熒光基團和淬滅部分。探針是包含莖和環結構的單鏈寡核普酸，其中親水性附著基團附著于單鏈寡核苷酸的一個末端，淬滅部分附著于單鏈寡核苷酸的另一個末端。熒光基團可以是任何熒光有^f幾染泮牛或單量子點，從而它的發射不與量子點標簽化的珠子的發射重疊。淬滅部分理想地淬滅焚光基團的發光。淬滅焚光基團的發光的任何適合的淬滅部分可以用于以上描述的結合物中。蝎子引物是含有與探針共價連接的PCR引物的雙功能分子。探針中的熒光基團與降低熒光的淬滅劑相互作用。在PCR反應期間，熒光基團和淬滅劑分離，其引起來自反應管的光輸出的提高。在Whitcombe，D.，TheakerJ.，Guy，S.P,，Brown,T.，Little,S.(1999)-DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescence,NatureBiotech17，804-807中更完整地描述了蝎子引物，其由專利EP1088102保護。DNAzyme(Santoro，S.andJoyce,G.,1997,AgeneralpurposeRNAcleavingDNAenzyme.ProcNatlAcadSciUSA.94:4262-4266.ReviewedEmilsson,G.M.andBreaker,R.R.,2002,Deoxyribozymes:newactivitiesandnewapplications.Cell.Mol.LifeSci.59，596-607)是催化活性的寡核苷酸，其可以，例如，在特定的磷酸二酯鍵處裂解核酸底物。DNAzyme由側翼是兩個底物識別結構域的催化結構域組成。其觀察S'J標準的Watson-Crick堿基配對規則，必須與它的底物雜交來適當地催化裂解。DNAzymes可以與體外擴增技術組合使用，例如PCR，作為產生可檢測信號的手段，因而容許擴增的核酸目標序列的實時監測(US6,140,055)DNAzymes通過使用具有5'tag的引物導入擴增子，所述引物是無活性的、DNAzymes的反義序列。當這些序列案子體外擴增期間被拷貝時，催化活性的正義DNAzyme序列與目標序列一起被共同擴增。這產生了起到DNAzymes的作用、能夠裂解報告物底物的擴增子。重要的試劑包括與無活性的、DNAzyme的反義鏈結合的一種基因特異性引物；和第二種基因特異性引物。在本發明的一個實施方式中，5'和3'引物特異于目標擴增子。除了DNAzyme之外，還存在著DNAzyme特異性熒光底物。這種通用的探針由短的核酸片段組成，所迷核酸片段在一個末端被焚光基團標簽化，在另一個末端為BlackHoleQuencherTM染料(BHQ)。DNAzyme底物最終充當DNA拷貝數的度量。每一輪擴增，活性DNAzymes的數目與DNA拷貝數成正比地提高。DNAzyme活性方面的指數性提高引起熒光的相應增加，容許實時監測DNA擴增。在一種優選的實施方式中，所述方法從多個拷貝的目標DNA開始，因而需要較少的循環來達到檢測閾值水平，通常由"Ct"值表示。在DNAzyme特異性熒光底物中存在的熒光基團包括FAM、CALFluorOrange、JOE和TAMRA染料，等等。它們在它們的激發狀態強烈地發射，但在它們的淬滅狀態僅樣吏弱地發射。MNAzymes(Johnson&JohnsonResearchPtyLimited,Australia的專利申請PCT/AU2006/001473)是基于DNAzymes的催化核酸。MNAzymes由兩種或更多種寡核普酸序列(例如，partzymes)構成，其是被定量擴增的標簽化的或相應的未標簽化的區域)，形成能夠催化性修飾底物如報告物底物的活性核酸酶。包含partzymeA和partzymeB的示例性MNAzyme在附圖12中描繪。參考附圖12，DNApartzymesA和B各自與目標結合，即，MNAzyme組裝輔助物分子(例如，通過與堿基配對目標的Watson-Crick堿基配對)。當partzymesA和B在目標上相互鄰近地雜交時，僅形成MNAzyme。MNAzyme的底物臂與報告物底物結合，報告物底物的裂解由MNAzyme的催化核心催化，所述催化核心通過partzymesA和B的催化結構域的相互作用形成。MNAzyme裂解熒光基團和淬滅劑染料配對之間的底物，因而產生信號。DNA/RNA嵌合體(報告物底物)的裂解在附圖中舉例說明。術語"MNAzyme"也稱為"多組件核酸酶"。MNAzyme也可以包含穩定化寡核苷酸，其通過與組裝輔助物或底物相互作用提供了MNAzyme的穩定性。明顯^>,為了可檢測的催化活性，MNAzyme的形成需要至少是partzyme組件與目標(或組裝輔助物)的組裝，以及報告物底物的結合，任何這些組件的缺乏將引起催化活性的缺失。可以通過大量方法的任一種來標記與MNAzymes使用的報告物底物，所述方法包括，例如熒光基團(有或沒有一種或多種其它組件，例如淬滅劑)、放射性標記、用生物素標記(例如，生物素化)或化學發光標記。催化核酸的報告物底物也可以包括蛋白質或核酸酶，例如，共價地附著到它們的末端。與MNAzymes使用的報告物底物可以是一般的報告物底物系統，通過容許容易的設計改變來創建識別不同目標的新的MNAzymes,其容許快速的分析開發。partzymes的底物臂部分和催化核心部分可以保持不變，僅有為新的目標所需的一個或多個partzymes的感受器臂部分的改變。提供一般底物序列，因而相同的底物可以被包括入多種不同目才示的分析中。進一步地，相同的底物可以被包括入本文的各種實施方式的方法中，包括其中底物在溶液中游離的、或拴系在或附著于支持物的分析。一系列一般底物可以用于容許多個目標的同時檢測的多路反應。使用一般底物的MNAzyme策略提供了相對于一些技術例如TaqMan⑧或Beacons的主要優點，這些技術需要設計和使用對每個新的目標特異的探針。如以下更詳細描述地，MNAzymes在能夠利用通用或一般報告物底物的某些實施方式中具有有益的性質。這種底物以當前優選的結構在附圖12中示出，其中報告物底物包含可檢測部分和淬滅劑部分。淬滅劑部分適合于減少或消除來自底物的可檢測部分的可檢測信號，直到底物被MNAzyme裂解。例如，淬滅劑部分可以包含"BlackHoleQuencher1"(BHQ1)或"BlackHoleQuencher2"(BHQ2)。因而，MNAzyme在可檢測部分和淬滅劑部分之間裂解報告物底物，容許兩個部分在溶液中分離，從而隨著淬滅劑部分遠離于可檢測部分、或有效地從可檢測部分的局部環境中除去，容許可檢測信號出現或提高。通過設計MNAzyme的組件partzymes,得以使用一般或通用報告物底物。通過僅改變partzymes的感受器臂部分，但是通過裂解不變的底物臂，可以設計出特異于多種目標的每一種的大量MNAzymes,所有這些都利用通用報告物底物用于檢測。技術人員將理解，就消除針對每個目標定制的或獨特的底物需要而言它所提供的益處。每個新的目標僅需要一個或多個感受器臂部分的一個或多個改變；底物臂部分和催化核心部分可以保持恒定。因而，使用MNAzyme,單個報告物底物可以用于單個目標，使用改變的MNAzymes，可以用于一系列分析中的多個目標。多種報告物底物容許多路化，來在單個分析中使用多種MNAzymes檢測多個目標，一種MNAzyme針對一個目標。利用MNAzymes的這種多路方法在溶液中或附著在支持系統上容易地實現。本文包括如本文所述的，在涉及將一種或多種報告物底物、或MNAzymepartzymes或組裝輔助物、或其它的酶活性連接到支持物的系統中，可以實現多路的分析。可以通過提高可檢測效果的MNAzyme來修飾底物。在檢測過程中，通過MNAzyme的報告物底物修飾可以包括，例如，裂解、連接、外啉金屬取代、碳-碳鍵、酯鍵或酰胺鍵的形成。作為通過MNAzyme的報告物底物修飾的結果，產生了可檢測的效果，由此該效果的量是想要測量的目標的數量的指示。可檢測效果可以通過多種方法來測量，包括熒光光語、表面胞質團共振、質譜法、NMR、電子自旋共振、偏振熒光光"i普、園二色性、免疫分析、層析、輻射測量、光度測量、閃爍照相術、電子方法、UV、可見光或紅外光語、酶學方法或其任何組合。在一個實施方式中，報告物底物是SEQIDNO:17-18,它們各自用不同的熒光基團標記。具有SEQIDNO:17的底物在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來末端標記，其被稱為SubBi-6-FB。這種底物SEQIDNO:17對于跟蹤未標簽化的野生型HXB2DWT擴增子的積累是有用的，可以用492nm的激發在516nm處監測這種底物的裂解。具有SEQIDNO:18的底物在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來末端標記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SEQIDNO:18對于跟蹤標簽化的HXB2D擴增子的積累是有用的，可以用535nm的激發在555nm處監測這種底物的裂解。在表4中，列出了這些底物。小寫字母的堿基代表RNA,大寫字母的堿基代表DNA。表4:報告物底物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在進一步的實施方式中，報告物底物是SEQIDNO:17-18和23，三種不同的報告物底物，它們每一種用不同的熒光基團標記。具有SEQIDNO:17的底物在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來末端標記，其被稱為SubBi-6-FB。這種底物SEQIDNO:17對于跟蹤未標簽化的野生型HXB2DWT擴增子的積累是有用的，可以用492nm的激發在516nm處監測這種底物的裂解。具有SEQIDNO:18的底物在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來末端標記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SEQIDNO:18對于跟蹤標簽化的HXB2D擴增子的積累是有用的，可以用535nm的激發在555nm處監測這種底物的裂解。具有SEQIDNO:23的底物在5'末端用Quasar670部分、以及在3'末端用BHQ2部分來末端標記，其被稱為SubBi-3-Q6B2。做為選擇，具有SEQIDNO:23的底物可以在5'末端用TAMRA部分、以及在3'末端用BHQ2部分來末端標記。這種底物SEQIDNO:23對于3艮蹤RPLPO擴增子的積累是有用的，可以用635nm的激發在665nm處監測這種底物的裂解。這三種底物的序列在表5中列出。小寫字母的堿基代表RNA，大寫字母的堿基代表DNA。表5:報告物底物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在本發明的一個實施方式中，MNAzyme結構基于包括10:23和8:17DNAzymes的DNAzymes。在各種實施方式中，MNAzymes包含核糖核苷酸堿基和脫氧核糖核苷酸堿基。在更優選的實施方式中，MNAzyme結構至少部分地基于DNAzyme的結構。在其它一些優選的實施方式中，MNAzymes至少包含某些脫氧核糖核苷酸堿基或其類似物。在更優選的實施方式中，MNAzyme的催化核心包含一個或多個脫氧核糖核普酸石咸基或其類似物。在更優選的實施方式中，一個或多個脫氧核糖核苷酸堿基或其類似物被包括在底物的催化作用中。在其它一些實施方式中，在催化核心內的至少一個脫氧核糖核苷酸堿基或它的類似物改善了催化活性。在又另外的實施方式中，相對于沒有存在所述脫氧核糖核苷酸堿基的可比較MNAzyme而言，為了以可測量的速率發生催化作用，對于在MNAzyme的催化核心中的至少一個脫氧核糖核普酸堿基或它的類似物存在著嚴格的要求。MNAzymes可以含有一個或多個取代，例如本領域技術人員公知的類似物、衍生物、修飾或改變的堿基、核糖核芬酸、糖類或磷酸鹽主干的改變、各種刪除、插入、取代、二重化或其它修飾或這些的任何組合。這樣的修飾、取代、刪除、插入等等可以在感受器和/或底物臂中和/或在催化核心部分中進行，從而分子保持催化活性。對結合底物或組裝輔助物的臂的取代或修飾可以是良好耐受性的，實際上是容許分子針對不同的底物/組裝輔助物的修整的基礎。例如，感受器臂的修飾將容許對不同的組裝輔助物的適應，而底物臂的修飾將容許對不同底物的適應。熟練的技術人員將理解，MNAzymes包括脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸，或者甚至兩者。包含至少一個、以及優選的所有的脫氧核糖核苷酸組件寡核苷酸的那些MNAzymes是當前優選的。還優選的是，在MNAzyme的催化核心內包含至少一個脫氧核糖核普酸;咸基、或它的類似物的那些MNAzyme。再更優選的是其中這樣的名成基是催化活性所需的那些實施方式。MNAzyme結構的基本實例在附圖12中描繪。顯示的結構包含partzymeA和partzymeB,其具有與MNAzyme組裝輔助物分子配對的堿基，在此簡略顯示為目標。通過與目標相互作用PartzymesA和B容許催化核心變得緊密接近從而形成。MNAzyme的底物臂相互作用于或堿基配對于底物，在此稱為報告物底物。因而，MNAzyme自我組裝，這種過程通過MNAzyme組裝輔助物分子目標的存在被便利化。在不存在目標時，將不形成MNAzyme。底物的修飾(在這種情況中，裂解)4皮在由直立箭頭指出的底物內的MNAzyme裂解位點處的MNAzyme的催化核心所催化。在本發明的這個特定實施方式中的底物包含具有可檢測信號的可檢測部分，例如熒光基團F，以及通過淬滅劑Q的作用對可檢測信號F具有淬滅效果的淬滅劑部分。在MNAzyme裂解位點處裂解時，存在著可檢測信號的大幅增加，在此處是熒光，其是容易檢測和定量的。更具體地，附圖12中顯示partzymeA和partzymeB各自包含底物臂部分、催化核心部分和感受器臂部分。在存在目標的情況下，partzymeA和partzymeB的感受器臂部分可以開始與目標的互補部分，例如DNA或RNA序列雜交以及石成基配對。在以這種方式接觸目標時，MNAzyme自我組裝形成催化核心，其可以修飾被底物臂結合的底物。優選地，MNAzyme的存在通過它的催化活性的檢出或測出來^r測。這樣組裝的MNAzyme的底物臂可以嚙合底物，例如，附圖12中顯示的報告物底物，通過底物臂和底物上的互補序列的相互作用。一旦底物這樣嚙合與底物臂，催化核心可以促進底物的修飾(例如，裂解)，其隨后可以被直接地或間接地測量。在一個實施方式中，本發明提供了被設計以檢測兩種不同的目標擴增子的partzymes，所述目標擴增子即從未標簽化的野生型HXB2DWT擴增的那些，以及從HXB2D標簽化的序列擴增的那些。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的-成基與目標雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列的3'末端的P代表3'磷酸基團。表6:被設計以檢測兩種不同的目標擴增子的partzymes:即擴增的未標簽化的野生型HXB2DWT，以及擴增的HXB2D標簽化的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在進一步的實施方式中，本發明提供了被設計來檢測三種不同的目標擴增子的partzymes，即，從未標簽化的野生型HXB2DWT序列擴增的那些、從HXB2D標簽化的序列擴增的那些、以及從RPLPO基因擴增的那些。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列的3'末端的P代表3'磷酸基團。表7:被設計以檢測三種不同的目標擴增子的partzymes:即擴增的未標簽化的HXB2DWT序列、擴增的HXB2D標簽化的序列、以及擴增的RPLPO序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>多種MNAzymes在本發明中是有用的，因為它們容許檢測相差少至一個核苷酸的相關的序列。類似地，獨特的報告物底物是檢測幾種目標的每一種所需的。在某些情況下，為了使該方法多路化，需要為每個報告物底物使用不同的或獨特的可檢領'H言號來便于該方法的設計。根據用于擴增核酸(即，DNA或RNA)的操作來擴增目標核酸，包括本發明的重組病毒的標簽化的或相應的未標簽化的區域。優選地，使用體外擴增的標準方法。在擴增期間產生的擴增子充當MNAzyme的目標，由此，MNAzyme活性是目標存在的指示。本領域技術人員應當理解，這種監測可以在允許擴增和MNAzyme組裝和催化活性的條件下在單個容器中進行，或者，通過在最后時或擴增反應的過程中除去樣品，MNAzyme分析可以在擴增之后、或在整個擴增中的時間點進行。還應當理解，組合目標擴增與催化核酸活性的方法或方案可能需要特定的反應條件。優選地，反應條件適合于聚合酶活性(用于擴增)以及底物的催化性核酸修飾(用于檢測)。對于DNAzymes已經描迷了例如在PCR期間用于在高溫下測定同時的催化活性和聚合酶活性的條件的方案(Impeyetal.,2000)。在這個文章中展現了包括臂長度、緩沖液、溫度、二價離子濃度和添加劑作用的因素的影響。DNA酶適合于與體外擴增策略一起使用。例如，通過在擴增期間本領域高溫，它們不被不可逆地變性。在本發明的一個實施方式中，根據一種方法進行定量擴增，用于檢測至少一種目標或組裝輔助物的存在，其中目標或組裝輔助物是如上所述的重組病毒的一個標簽化的或相應的未標簽化的區域，所述方法包括a)提供兩種或更多種寡核普酸組件，其中至少第一寡核苷酸組件和第二寡核苷酸組件在存在至少第一組裝輔助物的情況下自我組裝來形成至少第一催化活性多組件核酸酶(MNAzyme);b)提供至少第一報告物底物，所述笫一底物能夠被所述第一MNAzyme修飾，其中通過所述MNAzyme的所述底物的所述修飾提供了可檢測效果；c)在允許以下的條件下，使所述兩種或更多種寡核芬酸組件與可能含有所述至少第一組裝輔助物的樣品接觸(1)所述至少第一MNAzyme的自我組裝，和(2)所述至少第一MNAzyme的催化活性；以及d);險測所述可4企測的效果。檢測至少一個目標或組裝輔助物的存在的方法可以進一步包括提供至少第三和第四寡核苷酸組件，其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸組件能夠在存在至少一個其它的目標或組裝輔助物的情況下自我組裝來形成至少一個其它的催化活性MNAzyme,其中至少一個其它的報告物底物存在于所述樣品中，所述其它的報告物底物能夠僅被所述其它的MNAzyme修飾，其中所述修飾提供了所述其它的可檢測效果。病毒復制能力的測定獲得對于標簽化和/或未標簽化的重組病毒的隨時間的閾值循環(Ct)值的標準曲線，并標繪在標準曲線上，一般地從對照或持家基因獲得，在給定病毒群體中或在給定環境下的給定標簽化物種的比例被顯示和計算。本發明的方案和產物可以用于各種診斷的、臨床的、毒理學的研究和法醫目的，包括藥物發現、設計患者治療、藥物效力測定以及患者管理。當前的方法可以與其它分析一起使用。結果可以在計算機模型和數據庫中實施。另外，本發明的方案和產品還允許監視抗HIV化合物對病毒適應度的影響。病毒適應度分析可以用作高通量篩選分析或包含高通量篩選分析的部分，所述分析中評估多種HIV毒林和環境組合。來自病毒適應度實驗的結果可以用于開發在存在其它HIV毒株和環境因素的情況下復制能力水平的數據庫。本發明還提供了下述試劑盒。所述試劑盒可以用于任何在此描述的方法。在一個實施方式中，所述試劑盒可以用于測定在一定環境中兩種或更多種目標HIV病毒的復制能力。本發明的試劑盒可以包含標簽化的HIV質粒載體、未標簽化的HIV質粒載體、引物、和探針。在另一個實施方式中，所述試劑盒包含細胞系。在本發明的一個實施方式中，所述試劑盒包含選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種引物；和/或根據本發明的標簽化的HIV質粒栽體，以及任選的未標簽化的HIVHXB2D質粒栽體。所述試劑盒可以進一步包含環境成分。做為選擇，所述試劑盒還可以包含partzymesSEQIDNO:13-16以及21-22。本發明的方法的步驟的順序可以改變。技術人員將能夠確定在步驟順序上什么改變是合適的。根據在此公開的本發明的說明書和實踐的考慮，本發明的其它實施方式對于本領域技術人員是顯而易見的。說明書和實施例意欲被認為僅是示例性的，而保護范圍由權利要求表明。以下的非限制性實例幫助闡述本發明的原則。實驗部分縮寫MNAzyme:多組分核酸酶，或多部分核酸酶；DNAzyme:脫氣核糖核酸酶；RNAzyme:核一唐核酸酶，或核酶；PCR:聚合酶鏈式反應；dH20:去離子蒸餾水；F:熒光基團；200680051987.3說明書第38/56頁Q:淬滅劑；JOE或6-JOE:6-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基熒光素；FAM或6-FAM:6-羰基焚光素；BHQ1:BlackHoleQuencher1;BHQ2:BlackHoleQuencher2.實施例1根據在EP877937、EP1283272或EP1285971中解釋的方案制備重組病毒。具有標簽化的包膜基因的病毒是質粒載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)和擴增子GPRT的重組的結果。具有標簽化整合酶序列的病毒是質粒栽體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int)和擴增子GPRT的重組的結果。具有標簽化序列的病毒是質粒載體pGEM-HIVdelGPRT和擴增子GPRT的重組的結果。擴增子GPRT是指由gag基因的最后81個氨基酸、蛋白酶基因的完整序列、逆轉錄酶基因的p51部分組成的序列。GPRT擴增子從突變病毒毒株和從WT病毒毒林獲得。來自突變毒林的GPRT擴增子與標簽化的質粒栽體重組。來自WT毒抹的GPRT擴增子與未標簽化的質粒栽體重組。來自突變毒林的GPRT擴增子與未標簽化質粒載體的重組，以及來自WT毒抹的GPRT擴增子與標簽化的質粒栽體的重組是另一種選擇。質粒載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)的序列被SEQIDNO:13包括。質粒栽體pGEM-HIVdelGPRTjagged(int)的序列被SEQIDNO:14包括。質粒載體pGEM-HIVdelGPRT的序列，即，沒有標簽，謬皮SEQIDNO:15包括。以下的包膜基因序列在下劃線的區域中顯示了已經導入沉默突變(以粗體和小寫字母標記)的地方標簽化的包膜基因(SEQIDN°26):ATGAGAGTGAAGGAGAAATATCAGCACTTGTGGAGATGGGGGTGGAGATGGGGCACCATGCTCCTTGGGATGTTGATGATCTGTAGTGCTACAGAAAAATTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGTATGATACAGAGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAGTAGTATTGGTAAATGTGACAG43AAAATTTTAACATGTGGAAAAATGACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGTTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTGTTAGTTTAAAGTGCACTGATTTGAAGAATGATACTAATACCAATAGTAGTAGCGGGAGAATGATAATGGAGAAAGGAGAGATAAAAAACTGCTCTTTCAATATCAGCACAAGCATAAGAGGTAAGGTGCAGAAAGAATATGCATTTTTTTATAAACTTGATATAACACCTCAGTCA丁TACACAGGCCTGTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTAAAATGTAATAATAAGACGTTCAATGGAACAGGACCATGTACAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCAGTAGTATCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGATCTGTCAATTTCACGGACAATGCTAAAACCATAATAGTACAGCTGAACACATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGAATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACTTTAAAACAGATAGCTAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATAATCTTTAAGCAATCCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGCACAGTTTTAATTGTGGAGGTTAA丁AGTAC丁TGGAGTACTGAAGGGTCAAATAACACTGAAGGAAGTGACACAATCACCCTCCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGCAGAAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATG丁TCATCAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGAGGtGAcATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTGGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTC丁TCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGAT丁GTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAGTATTGGAGTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAGCTTGCTCAATGCCACAGCCATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTAGTACAAGGAGCTTGTAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTATAA以下的整合酶編碼區域的序列在下劃線的區域中顯示了已經導入沉默突變(以粗體和小寫字母標記)的地方標簽化的整合酶編碼序列(SEQIDN。27):TTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGATGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTGCCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAACTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGCAGGAAACAGCATATTTTCTTTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTGCTACGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGAATCAAGCATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACtcacGtAATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAG一旦產生重組病毒，制備含有7.5x106個MT4-LTR-EGFP細胞的六個試管。然后，根據下式制備8ml重組病毒預稀釋物(MOI:感染復數)0.001MOI的最終稀釋物/20=預稀釋因數根據下表8，在下述條件下將重組病毒添加到重懸浮的細胞中表8<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>病毒和細胞的混合物在37。C孵育30分鐘，隨后在1200xg旋轉孵育10分鐘。除去上清液，用培養基洗涂細胞。試管在200xg離心5分鐘，團粒重懸浮在培養基中。將重懸浮的細胞添加到含有培養基的培養燒瓶中，并在37。C孵育。仔細地記錄時間。每24小時之后，對燒瓶記錄致細胞病變效果和焚光。在O小時(洗滌步驟后)、15小時、24小時、39小時、48小時、63小時、72小時、和87小時，收集6ml重懸浮的細胞培養物。通過離心回收上清液和細胞在1800xgio分鐘之后，收集2xl.5ml上清液。將400plPBS添加到上清液的其余部分中，來重懸浮細胞團粒。重懸浮的細胞分到2個試管中，上清液和細胞都保持在-80。C。根據供應商提供的方案，使用來自Invitek(Westburg)的InvisorbSpinBloodMini試劑盒從細胞團提取DNA。用分光光度計測量DNA濃度，將DNA濃度調節到100ng/pl。樣品然后保存在-20。C。在實時分析中測試2pl保存的樣品。將DNA添加到實時PCR混合物中，并置于PCR儀中。實時PCR混合物含有野生型引物混合物、通用底物FAM、標簽引物混合物、通用底物JOE、對照引物混合物、通用底物FAMTAM、具有FAMTAM的BDQtaqPCR緩沖液、PCR級水以及BDQtaqDNA聚合酶混合物。2jalDNA模板與實時PCR混合物的混合物置于熱循環儀(ABI7700)中，采用以下程序<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>產生的Ct(閾值循環)值被用于測定標簽病毒和野生型病毒的復制能力。在附圖5中，在MT4細胞中在各種相關的輸入濃度下HIVHXB2DWT和標簽化的HIVHXB2D的病毒生長的比較。進一步的在附圖6中，描繪了來自使用雙標記共感染的MT4細胞的HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA的檢測，其中標簽化的引物連接到JOE探針，未標簽化的野生型引物連接到FAM探針。在附圖7a、7b和7c中，對用于共感染MT4細胞的模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴增曲線。使用的引物是SEQIDNO:7和6,使用的標記是B-FAM針對HIVHXB2DDNA(附圖7a)D-JOE針對標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖7b)TAMRA針對持家基因(GAPD)(附圖7C)在附圖8a、8b和8c中，對用于共感染MT4細胞的模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴增曲線。使用的引物是SEQIDNO:5和6，使用的標記是B-FAM針對HIVHXB2DDNA(附圖8a)D-JOE針對標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖8b)TAMRA針對持家基因(GAPD)(附圖8c)在附圖9a、9b和9c中，對用于共感染MT4細胞的模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴增曲線。使用的引物是SEQIDNO:8和9,使用的標記是B-FAM針對HIVHXB2DDNA(附圖9a)D-JOE針對標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖9b)TAMRA針對持家基因(GAPD)(附圖9c)在附圖10a、10b和10c中，對用于共感染MT4細胞的模板HIVHXB2D和標簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴增曲線。使用的引物是SEQIDNO:5、6、7、8和9,使用的標記是B-FAM針對HIVHXB2DDNA(附圖10a)D-JOE針對標簽化的HIVHXB2DDNA(附圖10b)TAMRA針對持家基因(GAPD)(附圖10c)在附圖11中提供了附圖7-10中顯示的擴增的材料的終點凝膠電泳的圖片。圖片清楚地顯示了，已經開發了可行的三聯分析，其能夠區分未標簽化的WT和標簽化的HIVDNA載體模板(即，HIVHXB2Dvs.標簽化的HIVHXB2DDNA),甚至是在存在基因組DNA背景的情況下。PCR效力在90。/。和110%之間，數據擬合標準曲線的相關系數是>0.99。在l-和n-plex之間的ACt(即，閾值循環的變異)是《1循環。實施例2:MNAzvmes用于經由二聯實時PCR來定量HIV核酸序列的用途多組分核酸酶(MNAzymes)含(i)特異性識別并結合組裝輔助物，例如目標核酸的感受器區域；(ii)催化核心區域；和(iii)結合底物的底物區域。MNAzymes由兩個(或更多個)獨立的寡核苷酸"partzymes，，組成，所述"partzymes"僅在存在組裝輔助物的情況下形成活性酶。催化活性的MNAzyme可以在熒光基團和淬滅劑染料配對之間裂解核酸報告物底物，從而產生焚光信號。組裝輔助物的實例包括目標被分析物，例如DNA或RNA序列。MNAzymes可以用于容許檢測通過聚合酶鏈式反應(PCR)或其它體外擴增技術產生的目標DNA擴增子。進一步地，利用MNAzymes的實時PCR檢測容許測定反應中起初存在的目標的數量。開發了利用兩種MNAzymes來便于實時監測的二聯PCR分析，用于對(i)未標簽化的HIVHXB2DWT序列和(ii)被修飾以含有四個沉默突變(標簽)的標簽化的HIVHXB2D序列進行同時檢測和定量。設計標簽堿基，從而它們不影響復制能力但是容許標簽化的HXB2D序列和未標簽化的HXB2DWT序列之間的辨別(附圖14)標簽的不存在或存在分別提供了"野生型"序列(WT)或通過對感興趣的HIV目標病毒擴增衍生的那些序列的存在的代替性標記物，其位于未標簽化或標簽化的區域的上游。2丄用于二聯PCR分析的Partzvme寡核苷酸多個目標可以在包含多種獨特的MNAzymes的一個多路化反應中同時檢測。每種MNAzyme具有特異于一個目標的感受器臂，和特異于一系列一般報告物底物的獨特成員的底物臂，所述報告物底物每一種用不同的熒光基團來標記。在以下的實施例中，設計MNAzymes以檢測兩種不同的目標擴增子，即，從未標簽化的野生型HXB2DWT擴增的那些，以及從HXB2D標簽化的序列擴增的那些。針對每個目標的partzymesAandB的序列在以下從5'到3'列出。在以下序列中，下劃線的石成基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標雜交，斜體的堿基與底物雜交。在每個序列末端的P代表3'磷酸基團。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>2.2.報告物底物在這個實施例中，使用了兩種不同的報告物底物，每一種用不同的熒光基團標記。底物的序列以下從5'向3'書寫。在當前的實施例中，第一底物SubBi-6在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來末端標記，其被稱為SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB對于跟蹤未標簽化的HXB2DWT擴增子的積累是有用的，可以用492nm的激發在516nm處監測SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來末端標記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB對于跟蹤HXB2D標簽化的擴增子的積累是有用的，可以用535nm的激發在555nm處監測SubBi-2-JB的裂解。小寫字母的堿基代表RNA,大寫字母的堿基代表DNA。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>2.3.用于目標序列的擴增的PCR引物引物5HIV和3HIV被用于野生型和標簽化的目標HXB2D序列的擴增。通過PCR使用以下列出的寡核苷酸PCR引物產生擴增子。表11SEQIDNO:按5'到3'方向列出的引物序列名稱19(正向)ATTAACAAGAGATGGTGGTAA5HIV20(反向)GTGCTACTCCTAATGGTTCAA3HIV2.4.反應成分對目標序列的擴增和定量在25的總反應體積中進行對目標序列的實時擴增和定量。所有的反應在Mx3005PTMQPCR系統(Stratagene)中進行，循環參數是，95°C7分鐘，95。C15秒和60。C30秒(每個循環溫度降低1°C)的10個循環，最后95。C15秒和50'C120秒的40個循環。反應含有40nM的3HIV和400nM的5HIV，200nM的每種partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P和TgB5/2-P)、200nM的每種底物(SubBi-6-FB和SubBi-2-JB)、7mMMgCl2、200|tiM每種dNTP,10單位Rnasin(Promega)、1xlmmobuffer(Bioline)和1單位的Immolase(Bioline)。如以下表12中表明的，雙份的反應含有或缺少質粒或基因組DNA模板。表12:反應中存在的目標DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>2.5.結果對未標簽化的和標簽化的目標序列的同時擴增以及使用目標特異性MNAzvmes經由兩種不同報告物底物裂解進行的^^測通過監視由于SubBi-6-FB被MNAzymel(包含partzymesWTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上熒光的提高，實時地檢測和定量未標簽化的HXB2DWT序列。MNAzyme1僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由HXB2DWT質粒或原病毒HXB2DWT目標序列的擴增(以下表13和14)產生的擴增子。在不存在HXB2DWT質粒或原病毒DNA的情況下，在FAM通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。進一步的，在存在單獨的來自標簽化的原病毒DNA的擴增子的情況下，在FAM通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。通過監視由于SubBi-2-JB被畫Azyme2(包含partzymesTgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上焚光的提高，實時地檢測和定量標簽化的HXB2D序列。MNAzyme2僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由標簽化的HXB2D質粒或標簽化的原病毒HXB2D目標序列的擴增(以下表13和14)產生的擴增子。在不存在標簽化的質粒或原病毒HXB2D模板DNA的情況下，在JOE通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。進一步的，在存在單獨的來自未標簽化的HXB2DWT原病毒DNA的擴增子的情況下，在JOE通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。通過相對于達到閾值熒光時的循環數(Ct)來對質粒濃度的log值進行繪圖，對未標簽化的和標簽化的HXB2D質粒目標產生標準曲線。以下在表13中顯示的每種已知數量(標準)的Ct值是兩份反應的平均值。對未標簽化的和標簽化的目標序列顯示了標準曲線的相關系數(R2)和斜率以及反應效率。表13:對含有未標簽化的野生型和標簽化的HXB2D質粒的反應的<table>complextableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>根據從未標簽化的和標簽化的HXB2D質粒產生的標準曲線，來估計MT-4基因組DNA混合物內的未標簽化的WT和標簽化的HXB2D原病毒的拷貝數(表14)。每種未標簽化的和標簽化的HXB2D原病毒序列的拷貝數被表示為總拷貝數(未標簽化的加上標簽化的原病毒序列)的百分比，將估計值與原始spikedMT-4混合物中的百分比相比較。具有含100%未標簽化的原病毒序列或100%標簽化的原病毒序列的基因組MT-4的樣品能被很容易地相互區分(表14)。在僅存在標簽化的原病毒序列的情況下，隨著時間過去MNAzyme1沒有產生熒光方面的背景提高。類似地，在僅存在未標簽化的原病毒序列的情況下，隨著時間過去MNAzyme2沒有產生焚光方面的背景提高。利用MNAzyme分析，未標簽化序列的未標簽化序列比標簽化序列比例為80%、50%和20。/。的混合物分別被計算為含有77%、47%和21%的未標簽化的序列。表14:以各種百分比存在的未標簽化的和標簽化的原病毒DNA序列的擴增和檢測的反應結果<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>這個實施例中的MNAzymePCR反應容許同時檢測和產生標準曲線，以用于在二聯反應中定量未標簽化的和標簽化的核酸HXB2D序列。該分析容許辨別未標簽化的和標簽化的序列，反之亦然。進一步的，MNAzyme分析能夠測定樣品中存在的未標簽化的和標簽化的原病毒HXB2DDNA的絕對和相對數量。因而，MNAzymePCR提供了在HIV病毒適應度分析中實時監測HIV-1序列的方法。實施例3:MNAzvmes用于經由三聯實時PCR來定量HIV和對照核酸序列的用途開發利用三種MNAzymes來便于實時監測的三聯PCR分析，用于對(i)未標簽化的HIVHXB2DWT序列，(ii)被修飾以含有四個沉默突變(標簽)的標簽化的HIVHXB2D序列，和(i")對照人類RPLPO基因進行同時檢測和定量。設計標簽堿基，從而它們不影響復制能力但是容許修飾的標簽化HXB2D序列和未標簽化的HXB2DWT序列之間的辨別。標簽的不存在或存在分別提供了"野生型"WT序列或通過對感興趣的HIV目標病毒擴增衍生的那些序列的存在的代替性標記物，其位于未標簽化或標簽化的區域的上游。3丄用于三聯PCR分析的Partzvme寡核苷酸多個目標可以在包含多種獨特的MNAzymes的一個多路4匕反應中同時檢測。每種MNAzyme具有特異于一個目標的感受器臂，和特異于一系列一般報告物底物的獨特成員的底物臂，所述報告物底物每一種用不同的熒光基團來標記。在以下的實施例中，設計MNAzymes以檢測三種不同的目標擴增子，即，從未標簽化的HXB2WT擴增的那些，從標簽化的HXB2D序列擴增的那些以及從RPLPO基因擴增的那些。對于每個目標的partzymesAandB的序列在以下從5'到3'列出。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列末端的P代表3'磷酸基團。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>3.2.報告物底物在這個實施例中，使用了三種不同的報告物底物，每一種用不同的熒光基團標記。底物的序列以下從5'向3'書寫。在當前的實施例中，第一底物SubBi-6在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來末端標記，其被稱為SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB對于跟蹤未標簽化的野生型HXB2DWT擴增子的積累是有用的，可以用492nm的激發在516nm處監測SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來末端標記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB對于跟蹤標簽化的HXB2D擴增子的積累是有用的，可以用535nm的激發在555nm處監測SubBi-2-JB的裂解第三底物SubBi-3在5'末端用Quasar670部分、在3'末端用BHQ2部分標記，其被稱為SubBi-3-Q6B2。底物SubBi-3-Q6B2被用于監視RPLPO擴增子的積累，用635nm的激發在665nm處監測SubBi-3-Q6B2的裂解。三種底物的序列在以下列出。小寫字母的堿基代表RNA，大寫字母的堿基代表DNA。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>3.3.用于目標序列的擴增的PCR引物行擴增。引物5R05和3R05被用于擴增人類基因組RPLPO基因核苷酸PCR引物的序列在以下列出。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>3.4.反應成分目標序列的擴增和定量目標序列的實時擴增和定量在25pL的總反應體積中進行。所有的反應在Mx3005PTMQPCR系統(Stmtagene)中進行。循環參數是，95°C7分鐘，95°C15秒和60°C30秒(每個循環溫度降低1。C)的10個循環，最后95°C15秒和50°C120秒的40個循環。反應含有400nM的5HIV、40nM的3HIV、40nM的5R05、200nM的5R05、200nM的每種partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P、TgB5/2-P、R05A4/3-P和R05B5/3-P)、200nM的每種底物(SubBi-6-FB、SubBi-2-JB和SubBi-3-Q6B2)、7mMMgCI2、200mM每種dNTP,10單位Rnasin(Promega)、1ximmobuffer(Bioline)和1單位的Immolase(Bioline)。如下表18所示的，雙份的反應含有或缺少質粒或基因組DNA模板。表18:反應中存在的目標DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>3.5.結果同時擴增未標簽化的野生型和標簽化的目標HXB2D序列以及對照RPLPO基因序列以及使用目標特異性MNAzvmes經由三種不同報告物底物裂解進行檢測通過監視由于SubBi-6-FB被MNAzymel(包含partzymesWTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上熒光的提高，實時地檢測和定量未標簽化的HXB2D-WT序列。MNAzyme1僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由未標簽化的HXB2DWT質粒或未標簽化的原病毒HXB2DW丁目標序列的擴增(以下表19和20)產生的擴增子。在不存在未標簽化的HXB2DWT質粒或原病毒DNA的情況下，在FAM通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。進一步地，在存在單獨的來自標簽化的原病毒DNA的擴增子的情況下，在FAM通道上隨著時間沒有熒光信號的提南。通過監視由于SubBi-2-JB被MNAzyme2(包含partzymesTgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上熒光的提高，實時地檢測和定量標簽化的HXB2D序列。MNAzyme2僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由標簽化的HXB2D質粒或標簽化的原病毒HXB2D目標序列的擴增(以下表19和20)產生的擴增子。在不存在標簽化的質粒或原病毒HXB2D模板DNA的情況下，在JOE通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。進一步地，在存在單獨的來自未標簽化的HXB2DWT原病毒DNA的擴增子的情況下，在JOE通道上隨著時間沒有熒光信號的提高。通過監^L由于SubBi-3-Q6B2#皮MNAzyme3(包含partzymesR05A4/3-P和R05B5/3-P)裂解在Quasar通道上熒光的提高，實時地檢測和定量RPLPO基因。MNAzyme3僅在存在基因組DNA的情況下形成。在存在提取自K562或MT-4細胞的基因組DNA的情況下觀察到焚光的增加。在缺少基因組DNA的情況下隨著時間的過去沒有萸光信號的提高。通過相對于達到閾值焚光時的循環數(Ct)來標繪質粒濃度的log值，對未標簽化的和標簽化的HXB2D質粒目標產生標準曲線。以下在表19中顯示的每種已知數量的質粒(標準)的Ct值是兩份反應的平均值。顯示了RPLPO的Ct值，對所有的標準獲得的相似的值表明在所有的標準中存在相似數量的基因組DNA。對未標簽化的和標簽化的目標序列顯示了標準曲線的相關系數(R2)和斜率，以及反應效力。表19:未標簽化的和標簽化的HXB2D目標以及對照RPLPO序列的實時分析的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在MT-4基因組DNA混合物內的未標簽化的和標簽化的HXB2D原病毒的拷貝數(表20)。每種未標簽化的和標簽化的HXB2D原病毒序列的拷貝數被表示為總拷貝數(未標簽化的加上標簽化的原病毒序列)的百分比，估計值與原始spikedMT-4混合物中的百分比相比較。具有含100%未標簽化的原病毒序列或100%標簽化的原病毒序列的基因組MT-4的樣品很容易地相互區分(表20)。在僅存在標簽化的原病毒序列的情況下，隨著時間過去MNAzyme1沒有產生熒光方面的背景提高。類似地，在僅存在未標簽化的原病毒序列的情況下，隨著時間過去MNAzyme2沒有產生焚光方面的背景提高(表20)。80%、50%MNAzyme分析被分別地計算含有74%、47%和28%的未標簽化的序列。表20:以各種百分比存在的未標簽化的和標簽化的原病毒DNA序列的擴增和檢測的反應結果(三聯MNAzyme形式)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>這個實施例中的MNAzymePCR反應容許同時^r測和產生標準曲線，用于在三聯反應中定量未標簽化的和標簽化的核酸HXB2D序列。該分析容許辨別未標簽化的和標簽化的序列，反之亦然。進一步地，MNAzyme分析能夠測定樣品中存在的未標簽化的和標簽化的原病毒HXB2DDNA的絕對和相對數量。RPLPO基因序列可以提供標準或測試樣品中基因組DNA數量的內部對照。因而，三聯MNAzymePCR提供了在HIV病毒適應度分析中實時監測HIV-1序列的方法。權利要求1.一種用于測定兩種HIV病毒在環境中的復制能力的離體或體外方法，所述方法包括下述步驟e)產生標簽化的重組傳染性病毒，其包含標簽化的HIVDNA載體和來自第一目標HIV病毒的第一擴增子；其中所述標簽化的HIVDNA載體通過在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導入一個或多個沉默突變來產生；其中所述標簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于或重疊于來自所述第一目標HIV病毒的所述第一擴增子的側翼區域；其中所述一個或多個沉默突變被導入下述基因中，所述基因不被來自所述第一目標HIV病毒的所述第一擴增子包括；以及其中所述第一擴增子包含來自所述第一目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；f)產生未標簽化的重組傳染性病毒，其包含未標簽化的HIVDNA載體和來自第二目標HIV病毒的第二擴增子；其中所述未標簽化的HIVDNA載體不包含在步驟a)的標簽化的HIVDNA載體中導入的一個或多個沉默突變；其中所述未標簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于或重疊于來自所述第二目標HIV病毒的所述第二擴增子的側翼區域；以及其中所述第二擴增子包含來自第二目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；g)在給定環境中在細胞培養物中混合步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及h)通過檢測所述標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中的一個或多個沉默突變，和通過檢測所述未標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中一個或多個沉默突變的缺乏，通過定量擴增測定總病毒群體內標簽化的重組傳染性病毒的比例和未標簽化的重組傳染性病毒的比例。2.—種用于測定三或更多種HIV病毒在環境中的復制能力的離體或體外方法，所述方法包括下述步驟a)產生權利要求1中步驟a)的標簽化的重組傳染性病毒；b)產生權利要求l中步驟b)的未標簽化的重組傳染性病毒；c)產生其它的一種或多種標簽化的重組傳染性病毒，每種包含標簽化的HIVDNA栽體和來自其它一種或多種目標HIV病毒的笫三種或后續的擴增子；其中通過在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導入一個或多個沉默突變來產生所述標簽化的HIVDNA栽體，所述一個或多個沉默突變不同于這個權利要求的步驟a)的所述第一標簽化的HIVDNA載體的一個或多個沉默突變；其中每種所述標簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對應于(correspondsatmost)或重疊于來自所述笫三或后續的目標HIV病毒的所述第三或后續的擴增子的側翼區域；其中所述一個或多個沉默突變被導入下述基因中，所述基因不被來自所迷第三或后續的目標HIV病毒的所述第三或后續的擴增子包括；以及其中所迷第三或后續的擴增子包含來自所述第三或后續的目標HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；d)在給定的環境中在細胞培養物中混合步驟c)的重組傳染性病毒和步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及e)通過檢測每種所述標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中的一個或多個沉默突變，和通過檢測所述未標簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中一個或多個沉默突變的缺乏，通過定量擴增測定總病毒群體內每種標簽化的重組傳染性病毒的比例和未標簽化的重組傳染性病毒的比例3.根據權利要求1-2的任一項的方法，其中所述擴增通過聚合酶鏈式反應(PCR)、鏈交換擴增(SDA)、轉錄介導的擴增(TMA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、自持的序列復制(3SR)、基于轉錄的擴增(TAS)、滾環擴增(RCA)、環介導的等溫擴增(LAMP)或連接酶鏈式反應(LCR)進行。4.根據權利要求1-3的任一項的方法，其中所述定量擴增利用Lux發熒光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探針、T叫Man⑧探針、分子信標、蝎子引物或任何其它FRET探針來監測。5.根據權利要求l-4的任一項的方法，其中所述定量擴增通過聚合酶鏈式反應、采用鄰近MNAzymes的引物和被MNAzymes裂解的探針來進行。6.根據權利要求1-5的任一項的方法，其中每種所述標簽化的HIV千。，"、，？'、、7.根椐權利要求6的方法，其中每種所述標簽化的HIVDNA載體和所述未標簽化的HIVDNA栽體是原病毒HIVDNA或質粒DNA。8.根據權利要求7的方法，其中所述質粒DNA包含HXB2D野生型毒抹的基因組。9.根據權利要求l-8的任一項的方法，其中所述來自目標HIV病毒的擴增子包含選自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、evn和其部分的序列之一。10.根據權利要求1-9的任一項的方法，其中所述環境包含一種或多種藥物、一種或多種結合蛋白或其混合物。11.根據權利要求1-10的任一項的方法，其中通過在HIVDNA載體的pol基因的整合酶編碼區中導入一個或多個沉默突變來產生所述標簽化的HIVDNA栽體，其中所述一個或多個沉默突變的導入使用引物SEQIDNO:1-2來進行。12.根據權利要求1-10的任一項的方法，其中通過在HIVDNA栽體的env基因中導入一個或多個沉默突變來產生所述標簽化的HIVDNA載體，其中所述一個或多個沉默突變的導入使用引物SEQIDNO:3-4來進行。13.—種標簽化的HIV質粒栽體，其中所述質粒栽體的主干是野生型HXB2D，所述栽體包含-標簽化的序列；和-gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；其特征在于，所述標簽化的序列在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個或多個沉默突變；以及條件是所述一個或多個沉默突變不位于所述刪除的基因序列中。14.根據權利要求13的標簽化的HIV質粒載體，其中所述標簽化的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區域中的一個或多個沉默突變。15.根據權利要求14的標簽化的HIV質粒載體，其中所述質粒栽體是SEQIDNO:28(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env))或29(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int))。16.選自SEQIDNO:1-16、19-22和24-25的寡核苷酸。17.標簽化的HIV包膜基因序列，其中所述標簽化的HIV包膜基因序列是SEQIDNO:26。18.標簽化的HIV整合酶編碼基因序列，其中所述標簽化的HIV整合酶編碼基因序列是SEQIDNO:27。19.一種用于離體或體外測定兩種或更多種HIV病毒在環境中的復制能力的試劑盒，所述試劑盒包含-選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種寡核苷酸；和/或-根據權利要求13-15的任一項的一種或多種標簽化的HIV質粒載體，和任選的未標簽化的HIVHXB2D質粒栽體。20.根據權利要求19的試劑盒，其進一步包括選自SEQIDNO:13-16和21-22的一種或多種寡核苷酸。全文摘要本發明涉及在給定環境中評價HIV病毒復制能力的方法和裝置。特別地，本發明提供了生長競爭檢驗，其可以利用重組標簽化的HIV-1病毒系統來測定相關的病毒適應度。所述方法依靠質粒載體、擴增子、引物和探針，以及由此的能復制的病毒的生成。所述方法和材料可以用于多個領域，包括診斷、藥物篩選、藥物遺傳學和藥物開發。文檔編號C12Q1/70GK101365808SQ200680051987公開日2009年2月11日申請日期2006年12月7日優先權日2005年12月7日發明者A·V·托德,B·A·J·梅斯,E·莫卡尼,G·克勞斯,I·P·M·德貝爾,L·T·里姆斯基,M·-P·T·M·M·G·德貝圖恩申請人:泰博特克藥品有限公司;莊臣及莊臣研究股份有限公司