專利名稱：綠僵菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于防治蟑螂的新綠僵菌菌株。
居室是人類生存活動的主要場所，保護居室環境，實現綠色生活是現代人生活的夢想，化學農業不當適用已經使人們產生了巨大的憂慮，而衛生殺蟲劑直接用于起居、工作環境，應用不污染環境的生物制劑控制衛生害蟲，對人們的生活、健康都具有重要的意義。
綠僵菌是一類能侵染昆蟲的真菌，為半知菌亞門絲孢綱綠僵菌屬。SnebB.(1991)首先篩選活動侵染蟑螂的綠僵菌菌株，1994年在美國注冊登記了第一個綠僵菌防治蟑螂的產品，并被美國國家環保局認定為環保產品。
CN93117629(申請人為美國生態科學公司，申請日1993年8月19日)公開了綠僵菌對白蟻有致死作用，可應用防治白蟻。
盡管已有綠僵菌產品存在，但現有的綠僵菌對多種有害昆蟲有致死作用，其對特定有害昆蟲，特別是蟑螂的專一性較差。
本發明人對野外采集的昆蟲病原真菌進行篩選，誘變，培養出一株對蟑螂有更好防治效果的新金龜子綠僵菌，命名為IBCCM321.93。本發明人已將該綠僵菌菌株于2002年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國，北京，中關村，郵政編碼100080)，保藏編號為CGMCC No.0853，名稱為金龜子綠僵菌(Metarriziumanisopliae)。
本發明的綠僵菌的營養生長階段為絲狀體，菌絲有膈、分支，直徑為1.5-2微米。由菌絲細胞特化出粗短的分生孢子梗，其上產生瓶狀小梗，從瓶梗末端向基部連續生長分生孢子即繁殖體，具有粘性，排列成長鏈狀。在顯微鏡下，分生孢子為單細胞，呈長橢圓型，兩端鈍圓，大小為7.2-9.3×3-4微米。在PDA培養基上，初始菌落為白色絮狀，初始產孢時為橄欖綠色，孢子老熟時為灰綠至深綠色。
盡管已記錄的綠僵菌的寄生昆蟲有200多種，但對不同菌株而言，寄生范圍相對狹小，有的非常專一。本發明的綠僵菌菌株IBCCM321.93的專一性較強，只對德國小蠊有高致病力，對美洲大蠊和褐斑大蠊寄生率有30％左右的侵染力，對包括家蠶在內的多種鱗翅目幼蟲的寄生力均在10％以下。表1列出了IBCCM321.93對不同昆蟲的侵染效果(106spores)表1綠僵菌IBCCM321.9對不同昆蟲的侵染效果(106spores)

綠僵菌對蟑螂的致病機理真菌對寄生昆蟲的侵入和繁殖過程實際上是病原真菌侵染與寄生昆蟲自身防御的斗爭過程。綠僵菌侵入寄主并造成流行包括四個過程(1)孢子附著于表皮并萌發；(2)芽管穿透寄主體壁；(3)在寄主體內生長繁殖，分泌毒素，致死蟲體形成僵蟲；(4)在僵蟲表面和體內產生分生孢子，形成再次侵染的感染源，最終從個體形成的傳播實現群體效應的致病流行過程。
從德國小蠊感病癥狀看，蜚蠊接種綠僵菌處理2-3天后表現明顯病癥，第5天后開始死亡。患病初期行動遲緩，少食或不取食，初死時肢體僵硬，有的表面為淺紅色，保濕幾日后，體表可長出菌絲，之后可見綠色小團粒即分生孢子長出體表。用電鏡超微切片可觀察到綠僵菌侵入、定殖、繁殖和破壞蟲體組織的過程。
侵入包括四個過程(1)孢子附著于表皮；(2)孢子萌發；(3)芽管穿透寄生體壁；(4)在寄主體內生長。孢子在寄主表皮附著是綠僵菌侵染寄主的前提，然后才能通過孢子萌發產生芽管直接穿入蟲體進行侵染。綠僵菌的孢子發出的芽管在適宜的條件下長出一種附著孢，這這附著孢覆蓋著一層粘性物質，能粘附于寄主的體壁，為芽管在侵入創造條件。對超微結構進行觀察，表明芽管在穿透過程中的機械壓力和酶活性。芽管穿透表皮之后就在血腔里產生蟲菌體或是延長形成菌絲后再產生酵母狀的蟲菌體。除此外它還能通過分泌某些代謝產物作為免疫已知因子限制寄主的正常防御反應。離體生物測定證明，綠僵菌的代謝產物(包括破壞素)能夠可逆地遏制蟑螂的酚氧化酶的活性。
定殖當芽管穿透蟑螂表皮進入血腔后，以菌絲的形式生長2-6小時，隨著蟑螂免疫系統的激活，產生體液免疫。6-12小時，菌絲生長產生蟲菌體，隨后由體壁侵入的芽管直接形成蟲菌體。蟲菌體不斷產生又抑制蟑螂免疫系統作用。經過侵染與反侵染的較量，蟑螂體內環境一旦抵御失敗，綠僵菌即迅速生長，即完成綠僵菌的定殖過程。
增殖當綠僵菌定殖后，便在寄主血腔內大量增殖，并引發寄主體內各組織、器官的病理變化，使之發生解離或破壞。首先侵染的是脂肪組織，同時蟲體的內表皮也遭到破壞，肌肉束斷面顯著減小；馬氏管斷面變得透明，但未見蟲菌體；中腸的上皮細胞已有相當程度的溶解和破壞。在腸上皮和圍食膜之間出現了較大的空隙，在圍食膜內包裹著食物。在感病死亡36小時的蟲體切片上，可見到大量分生孢子梗突破蟲體表皮，在分生孢子梗上生長出分生孢子。此時，腸壁變得很薄，已觀察不到細胞構造。圍食膜已不存在，但體腔中還殘存有少量肌肉和氣管的螺旋絲。
本發明的金龜子綠僵菌蟑螂菌株是蟑螂的特異寄生真菌，國內外都有有關綠僵菌安全性的報道。Al-Kadi的研究表明綠僵菌對豬和大白鼠既無毒性也無致病性，孢子即使到達體內組織，如血液、胃、肝內也不能萌發。至今未曾發現它寄生于哺乳動物或引起“三致”作用。本發明的綠僵菌IBCCM321.93菌株有較強的專一性，未發現它對經濟昆蟲有致病作用。經中國預防醫學科學院的大白鼠急性經口毒性試驗測定，表明毒性遠大于低毒標準，屬于低毒產品，因此，對人類和環境安全。
權利要求
1.一種綠僵菌，保藏編號為CGMCC No.0853。
2.權利要求1所述綠僵菌用于防治蟑螂。
全文摘要
本發明公開了一種新的綠僵菌菌株IBCCM321.93，保藏編號為CGMCC No.0853。該菌株與其他已知的綠僵菌相比，對寄主昆蟲有較強的專一性，且對蟑螂的殺滅效果更好。
文檔編號C12N1/14GK1448502SQ0215652
公開日2003年10月15日 申請日期2002年12月16日 優先權日2002年12月16日
發明者張澤華, 高松, 農向群 申請人:張澤華, 高松, 農向群