專利名稱：一株金龜子綠僵菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株金龜子綠僵菌及其應用。
背景技術：
甘鹿螟蟲(sugarcane stem borer),俗稱鉆心蟲，昆蟲綱鱗翅目(Lepidoptera),是在廣大蔗區普遍發生、危害嚴重的一類害蟲。其中有螟蛾科昆蟲50種，夜蛾科12種，小卷蛾科，木蠹蛾科和蝶蛾科各I種。該蟲田間發生密度大,甘蔗從下種至砍收的整個生長期都受其危害，在種苗期受害后種苗不能萌芽出土；苗期螟蟲幼蟲危害甘蔗生長點造成枯心苗，使苗數和有效莖減少，其枯心率一般在10% 20%，嚴重的田塊達到60%以上；在甘蔗生長中后期幼蟲鉆蛀嚙食危害蔗莖，破壞蔗莖組織，影響甘蔗生長，遇上強風，蔗莖常從蟲口處折斷，且蟲嚙后留下的創口也是赤腐病等病原菌的侵入口，致使蟲害與病害交疊發 生，不僅嚴重影響產量，也影響甘蔗的宿根性。目前，其防治主要靠化學農藥，如呋喃丹、特丁磷、甲基異柳磷、克百威等，全是劇毒農藥，不僅影響甘蔗本身的實用性，也嚴重影響到環境安全。而且長期使用這些化學農藥，螟蟲會產生抗藥性，勢必要進一步加大施藥量，既增加成本，又加劇環境惡化，造成惡性循環。因此，用生物農藥防治甘蔗螟蟲就成為一條新的防治途徑。目前國內外分離綠僵菌菌株防治對象大部分為蝗蟲、棉鈴蟲、菜青蟲、小菜蛾等，對于地上觸殺性害蟲，Bt等微生物農藥也表現很強競爭力。可是，對于地下害蟲、鉆蛀性和粉蚧等難以直接觸殺重要害蟲，目前除了有些使用高毒農藥有點效果，基本上都沒有什么好方法。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供一株金龜子綠僵菌。本發明所提供的金龜子綠僵菌是金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCCNo. 5952。該菌種已于2012年04月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。本發明金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 在 28°C,在 PDA 培養基上的特征為，菌落初長白色，以后逐漸擴大，其上產生稀疏、暗綠色的分生孢子層并呈環狀分布。菌絲分枝，有隔，無色光滑，寬2. 2 y m-3. 2 u m ;分生孢子梗單生或分枝，分枝頂端具
2-5個柱形的產孢細胞，大小為5. 2-9. OumX 2. 5-3. 2 y m，其上產生向基式的分生孢子鏈；單個分生孢子無色，柱形兩端鈍圓，大小為4. 5-6. 8 u mX I. 8-2. 9 u m0本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種殺蟲菌劑。本發明所提供的殺蟲菌劑，它的活性成分是上述金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213。所述金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213具體可為分生孢子或/和菌絲體。所述殺蟲菌劑具體可用于防治下述I)-5)植物害蟲中的五種、任四種、任三種、任兩種或任一種害蟲I)甘蔗螟蟲；2)椰心葉甲(Brontispa longissima(Gestro)；3)東亞飛幢(Locusta migratoria manilensis Meyen)；4)蒸枝疇蟓(Tessaratoma papillosa Drury)；5)新菠蘿灰粉階(Dysmicoccus neobrevipes (Beardsley) ) 所述甘鹿螟蟲具體可為條螟(Chilo venosatus)。 本發明金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213具體有如下的有益效果生產性狀好、產孢能力強；同時對甘蔗螟蟲殺蟲活性強，二次侵染甘蔗螟蟲效果好，對3 4齡甘蔗螟蟲的LT5tl(致死中時)為7. 44天。利用該菌株生產的殺蟲真菌制劑，能有效控制甘鹿螟蟲的種群數量。而且，金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213還對椰心葉甲、東亞飛蝗、荔枝椿象及菠蘿灰粉蚧具有強致病力，具有較強二次侵染能力和穩定性，比較適合在熱帶、亞熱帶地區應用。菌種名稱金龜子綠僵菌拉丁名Metarhiziumanisopliae菌株編號JF-6213保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2012年04月06日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 5952下面結合具體實施例詳細描述本發明，這些實施例用于理解而不是限制本發明。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的培養基每IL PDA培養基由如下物質制成200g土豆、20.(^葡萄糖、2(^瓊脂和水。其中，用水將培養基定容至1000ml。PDA培養基的配制方法如下將切成小塊的去皮土豆煮沸半小時，然后用紗布過濾，在濾液中，加入葡萄糖和瓊脂，用水定容至IOOOmL,再121 °C濕熱滅菌30min得到PDA培養基。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。實施例I、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213的分離及鑒定I、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的分離稱取中國海南樂東尖峰嶺樹林的表層土壤不同土壤樣品各10g，分別裝入裝有20mL的無菌水的50mL無菌三角瓶中，攪拌混勻后靜置片刻，待土壤沉淀后，吸取5mL上清液至IOmL無菌離心管中備用。取準備好的已滅菌的燕麥瓊脂培養基，50°C左右時加入34mg/mL的氯霉素溶液，使培養基中氯霉素濃度達到約500mg/L，搖勻后將燕麥瓊脂培養基倒于25CmX15CmX3Cm的無菌不銹鋼方盤中，每個方盤大約倒200mL培養基。待培養基冷卻凝固后，各取4mL不同土壤樣品上清液用涂棒均勻涂布接種于不同方盤上，接種完畢蓋上無菌玻璃板，放入28°C的恒溫培養箱中培養。得到金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213。2、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的鑒定(I)形態學鑒定將分離純化到的金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213菌株接種在PDA平板上，28°C觀察菌落形態特征，產孢結構和孢子形狀與大小。結果顯示在PDA培養基上菌落初長白色，以后逐漸擴大，其上產生稀疏、暗綠色的分生孢子層并呈環狀分布。菌絲 分枝，有隔，無色光滑，寬2. 2 y m-3. 2 u m ;分生孢子梗單生或分枝，分枝頂端具2_5個柱形的產孢細胞，大小為5. 2-9. OumX 2. 5-3. 2 y m，其上產生向基式的分生孢子鏈；單個分生孢子無色，柱形兩端鈍圓，大小為4. 5-6. 8 V- mX I. 8-2. 9 u m0(2)菌株的ITS序列擴增、序列測定及分子鑒定無菌條件下，配制金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213孢子懸浮液，取500 ii L孢子懸浮液接種于裝有50mL液體葡萄糖蛋白胨液體培養基(2%葡萄糖和1%蛋白胨)的三角瓶中，置于200轉/min的搖床上28°C恒溫下培養。培養3_5d后，采用真空抽濾方法收集菌絲體，并將菌絲體保存于_20°C冰箱中備用。菌絲體用液氮研磨成粉末狀后，采用SDS法提取基因組DNA。提取的DNA經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度儀測ODa3ci值后，將樣品稀釋至約IOng/ ii L備用。以總DNA為模板，采用Curran等設計的ITS1-5. 8S-ITS2區擴增引物進行PCR擴增，所用引物為 TW81 :5 ’ -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC- ‘ 3 和 AB21:5 ’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-‘3，產生547bp擴增條帶。PCR反應在PCR儀上的反應程序94°C預變性5min ;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，進行35個循環；最后72°C延伸lOmin。將擴增產物用凝膠回收試劑盒回收純化，由寶生物工程(大連)有限公司測序部測序。測序結果表明金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213的ITS1-5. 8S-ITS2區域的序列如序列表中的序列I所示。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 已于 2012 年 04 月 06 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5952。3、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的抗逆特性金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213有較強的抗逆性，在pH值4 9范圍內的PDA培養基中均可以生長，其最適生長pH值為8 ;在似(1濃度為0. 05 0. 25mol/L條件下，NaCl對菌株JF-6213的生長有一定的促進作用，濃度越大促進越明顯，有較強的耐鹽能力；高溫條件及紫外光對綠僵菌孢子萌發有較強的抑制作用。實施例2、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 CGMCC No. 5952 對甘蔗螟蟲室內殺蟲活性的測定
將分離純化到的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 CGMCCNo. 5952菌株接種在PDA平板上在28°C培養8_9天；收集在PDA平板上培養的成熟孢子，用0. 05%(0. 05g/100ml)吐溫-80水溶液分散，配制成終濃度為I X IO8個孢子/ml( I X 108cfu/ml)的懸浮液，該懸浮液即為金龜子綠僵菌菌劑。實驗設兩個處理，分別為金龜子綠僵菌菌劑組(簡稱菌劑組)和對照組。每個處理各3個重復，每個重復各設2株甘蔗苗。將體形大小相近、健康的3 4齡甘鹿螟蟲(條螟(Chilo venosatus)) 30只(3齡23只、4齡7只)接于2株分蘗初期六片葉的甘蔗苗上及甘蔗苗附近土壤中，該甘蔗苗種在塑料盒(15cmX IOcmX 5cm)中，每個塑料盒2株。然后將甘蔗苗隨機分為菌劑組和對照組。菌劑組的處理方法如下用手持噴霧器噴施金龜子綠僵菌菌劑，均勻噴霧至蔗苗滴水，重點噴施蔗苗喇叭口和葉鞘處。對照組用0. 05% (0. 05g/100ml)吐溫-80水溶液替代金龜子綠僵菌菌劑進行同樣的噴霧。噴完在25-32°C培養，觀察15天，隔天記錄死蟲數，計算存活率，經SPSS11. 5軟件統計分析得到金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 CGMCCNo. 5952對3 4齡甘蔗螟蟲的LT5tl(致死中時)為7. 44天(表I)。表I.甘蔗螟蟲的死亡情況
權利要求
1.金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)，其特征在于所述金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的菌株號為JF-6213，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5952。
2.權利要求I所述的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)在生產分生孢子和/或菌絲體中的應用。
3.—種殺蟲菌劑，它的活性成分是權利要求I所述的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)。
4.根據權利要求3所述的菌劑，其特征在于所述金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)為分生孢子或/和菌絲體。
5.根據權利要求3或4所述的菌劑，其特征在于所述殺蟲菌劑用于防治下述I)-5)植物害蟲中的五種、四種、三種、兩種或一種害蟲 1)甘蔗螟蟲； 2)椰心葉甲(Brontispalongissima(Gestro)； 3)東亞飛蟲皇(Locustamigratoria manilensis Meyen)； 4)蒸枝蟲舂蟓(Tessaratomapapillosa Drury)； 5)新菠蘿灰粉階(Dysmicoccusneobrevipes (Beardsley))。
6.根據權利要求5所述的菌劑，其特征在于所述甘蔗螟蟲為條螟(Chilovenosatus)0
7.權利要求I所述的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)在制備植物殺蟲劑中的應用。
8.權利要求3或4所述的菌劑在制備植物殺蟲劑中的應用。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述植物殺蟲劑的靶標害蟲為下述I) -5)植物害蟲中的五種、四種、三種、兩種或一種害蟲 1)甘蔗螟蟲； 2)椰心葉甲(Brontispalongissima(Gestro)； 3)東亞飛蟲皇(Locustamigratoria manilensis Meyen)； 4)蒸枝蟲舂蟓(Tessaratomapapillosa Drury)； 5)新菠蘿灰粉階(Dysmicoccusneobrevipes (Beardsley))。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述甘蔗螟蟲為條螟(Chilovenosatus)0
全文摘要
本發明公開了一株金龜子綠僵菌及其應用。本發明所提供的金龜子綠僵菌是金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.5952。該菌株生產性狀好、產孢能力強；同時對甘蔗螟蟲殺蟲活性強，二次侵染甘蔗螟蟲效果好，對3～4齡甘蔗螟蟲的LT50(致死中時)為7.44天。利用該菌株生產的殺蟲真菌制劑，能有效控制甘蔗螟蟲的種群數量。而且，金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213還對椰心葉甲、東亞飛蝗、荔枝椿象及菠蘿灰粉蚧具有強致病力，具有較強二次侵染能力和穩定性，比較適合在熱帶、亞熱帶地區應用。
文檔編號C12N1/14GK102776130SQ20121027429
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者劉磊, 楊臘英, 梁昌聰, 郭立佳, 黃俊生 申請人:中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所