專利名稱：精漿果糖酶法定量檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外診斷試劑類，具體適用于精漿果糖的定量檢測。
背景技術(shù)：
在男性不育的臨床與理論研究中，精漿果糖作為精囊特異性的分泌指標(biāo)，一直占有很重要的地位，廣泛應(yīng)用于鑒別單純性輸精管阻塞所致的無精癥和輸精管、精囊發(fā)育不良引起的無精癥；另外它也能間接反映雄性激素的分泌水平。
以往國內(nèi)主要是用間苯二酚法檢測精漿果糖，但其方法存在結(jié)果準(zhǔn)確性不高、樣本要去蛋白、溫育溫度為90℃、需要加入強(qiáng)腐蝕性的濃鹽酸等弱點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦吲哚法定量檢測精漿果糖，但其方法也存在標(biāo)本要經(jīng)去蛋白處理、溫育溫度為50℃，要加入強(qiáng)腐蝕性的濃鹽酸、需要在玻璃試管內(nèi)反應(yīng)等不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明意在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、反應(yīng)迅速、處理溫度低、安全環(huán)保的精漿果糖酶法定量檢測試劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種精漿果糖酶法定量檢測試劑，包括緩沖液、顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)品和酶保護(hù)液，所述酶保護(hù)液為含有果糖脫氫酶的酶保護(hù)液，酶保護(hù)液中果糖脫氫酶的含量優(yōu)選3000～8000U/L。
所述含有果糖脫氫酶的酶保護(hù)液為凍干粉，還包括凍干粉溶解液，凍干粉溶解液是酶保護(hù)液。
所述緩沖液為含防腐劑的檸檬酸緩沖液。
所述顯色劑為含有碘唑四氮藍(lán)(4-Fluoro-3-nitrobenzotrifluoride簡稱NBT)或碘硝基四氮唑紫(p-Iodonitrotetrazolium violet簡稱INT)、酚嗪二甲酯硫酸鹽(4-Amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride，簡稱PMS)的去離子水溶液。
包括終止液，用于終止酶促反應(yīng)。
所述終止液為含有稀酸的溶液。
由于上述技術(shù)方案，結(jié)合下面將要詳述的實(shí)施例，本發(fā)明突出的技術(shù)效果在于樣本無需進(jìn)行去蛋白處理，操作更簡單，檢測更方便，更適于臨床應(yīng)用；采用果糖脫氫酶，加快反應(yīng)速度，整個反應(yīng)過程只需40分鐘；采用稀酸作為終止液，較強(qiáng)腐蝕性的濃鹽酸更安全、環(huán)保；溫育溫度為37℃，比間苯二酚法和吲哚法中的溫育溫度都低，在操作中更安全；將酶保護(hù)液凍干，并在緩沖液中采用了防腐劑，使得試劑更穩(wěn)定，貯存期可達(dá)一年。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例，一種精漿果糖酶法定量檢測試劑，包括緩沖液、顯色劑、酶保護(hù)液凍干粉、果糖標(biāo)準(zhǔn)液(8mM)、酶保護(hù)液凍干粉溶解液和終止劑。其中1000ml緩沖液含有疊氮鈉(NaN3)0.15g、檸檬酸9.5g；每100ml酶保護(hù)液凍干粉中含有果糖脫氫酶450U；酶保護(hù)液凍干粉溶解液是酶保護(hù)液；顯色劑是含有NBT和PMS的去離子水溶液，每100ml顯色劑中含有NBT 0.03克、PMS0.45克；終止劑是含有濃硫酸的去離子水溶液，每1000ml終止劑中含有濃硫酸27.5毫升。
上述精漿果糖酶法定量檢測試劑中的各成分采用如下工藝方法制得A、緩沖液的制作工藝方法1)用分析天平稱取檸檬酸9.5g，NaN30.15g，加去離子水至950ml攪拌溶解。
2)調(diào)節(jié)pH(以1mol/l氫氧化鈉)至4.7～4.9。
3)用去離子水定容至1000ml，過濾后4℃保存；B、酶保護(hù)液凍干粉的制作工藝方法4)取果糖脫氫酶450U，加入少量進(jìn)口酶保護(hù)液振蕩溶解后，用酶保護(hù)液定容至100毫升。
5)分裝后凍干，4℃保存；C、凍干粉溶解液的制作工藝方法6)進(jìn)口酶保護(hù)液，4℃保存；D、顯色劑的制作工藝方法7)用分析天平準(zhǔn)確稱量NBT 0.03克，置于燒杯內(nèi)加去離子水90毫升。
8)再加入PMS0.45克，待完全溶解后以去離子水定容至總體積100ml；E、果糖標(biāo)準(zhǔn)液貯存液(8mM)的制作工藝方法9)用分析天平準(zhǔn)確稱取果糖0.7206g，NaN30.25g，加滅菌去離子水定容至500ml。
10)濾過除菌，4℃保存；F、終止劑的制作工藝方法11)準(zhǔn)確量取濃硫酸27.5毫升，置于燒杯內(nèi)，沿?zé)诰従徏尤?00毫升去離子水內(nèi)，邊加邊攪拌。
12)待溶液恢復(fù)至室溫后移入1000毫升裝容量瓶內(nèi)，用去離子水定容至1000毫升。4℃保存。
上述實(shí)施例中，緩沖液是NaN3含量為0.01～0.1％的檸檬酸緩沖液，NaN3在緩沖液中起防腐劑的作用；酶保護(hù)液凍干粉是果糖脫氫酶含量為3000～8000U/L的酶保護(hù)液凍干粉，一般而言，精漿果糖酶法定量檢測試劑的酶保護(hù)液中，果糖脫氫酶含量的下限為3000U/L，為控制成本，果糖脫氫酶的含量的上限為8000U/L，在3000～8000U/L的范圍內(nèi)，果糖脫氫酶的含量越高，催化反應(yīng)到終點(diǎn)的速度越快；酶保護(hù)液凍干粉溶解液是酶保護(hù)液；顯色劑是NBT含量為0.01～0.1％、PMS含量為0.2～0.8％的去離子水溶液，顯色劑中NBT的含量0.01～0.1％和PMS的含量0.2～0.8％是與足量的果糖脫氫酶催化精漿果糖脫氫后的氫原子反應(yīng)的有效量，NBT還可以用INT或其他常用的顯色劑替換，PMS還可以用其他的常用顯色劑替換；終止劑是濃硫酸含量為2～4％的去離子水溶液，終止劑只要是稀酸溶液就行了，其中濃硫酸還可以用其他的酸來替換。
試驗(yàn)例，用精漿果糖酶法定量檢測試劑檢測精漿果糖含量，具體步驟為一、試劑準(zhǔn)備1、每瓶酶保護(hù)液凍干粉加0.6ml酶保護(hù)液凍干粉溶解液溶解，室溫溶解30min，待用。
2、配制工作液，方法是緩沖液9份，加顯色劑1份，充分混勻，待用。
二、樣本準(zhǔn)備新鮮精液液化后，迅速取部分精液2000g離心10分鐘；取精漿用蒸餾水1∶4稀釋。
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將8mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液向下對倍稀釋為4、2和1mmol/L三個濃度，用蒸餾水作為零標(biāo)準(zhǔn)濃度，即標(biāo)準(zhǔn)管S1～S5中果糖濃度分別為0、1、2、4、8mmol/L。
四、檢測步驟
1、取微孔板條若干，各檢測孔在微孔板上的位置排列方式如表一 表一微孔板上各檢測孔的排列表一中，S代表標(biāo)準(zhǔn)孔，SB代表標(biāo)準(zhǔn)空白孔，R代表標(biāo)本測定孔，RB代表標(biāo)本對照孔。
2、在微孔中完成下列操作標(biāo)準(zhǔn)管(0，1，2，4，8mM) 標(biāo)準(zhǔn)空白管測定管標(biāo)本對照管(S1～S5) (SB) (R) (RB)稀釋標(biāo)本(ul) ---- ---- 1010標(biāo)準(zhǔn)液(ul) 10---- ---- ----酶保護(hù)液(ul) 15---- 15----工作液(ul) 200 200 200 200振蕩混勻，封片，37℃避光準(zhǔn)確反應(yīng)40min去掉封板膜，每孔加終止液50ul，振蕩混勻。上酶標(biāo)儀490nm比色各管吸光度(OD)OD1OD2OD3OD4五、比色與計(jì)算因?yàn)闃?biāo)本的吸光度(OD)與標(biāo)本的濃度的比值等于標(biāo)準(zhǔn)液的OD值與標(biāo)準(zhǔn)液的濃度的比值，即
同時已經(jīng)用蒸餾水將精漿標(biāo)本稀釋了4倍，因此在計(jì)算標(biāo)本濃度時也相應(yīng)地將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度乘以4。
綜上所述，計(jì)算精漿中果糖含量(C標(biāo)本)的公式如下 其中，ΔOD標(biāo)本＝OD3-OD4，ΔOD標(biāo)準(zhǔn)＝OD1-OD2標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際濃度(mmol/L)輸入酶標(biāo)儀的應(yīng)用濃度(mmol/L)0 01 42 84 168 32以Bio-Tek ELx800酶標(biāo)儀為例，程序設(shè)置主要參數(shù)如下MAPPING DIRECTIONDOWN；BLANK MAPP-DOWN；ENTER NUMBER OF STANDARDS05ENTER NUMBER OF STANDARD REPLICATES01CONCN.OF STD10CONCN.OF STD24CONCN.OF STD38CONCN.OF STD416CONCN.OF STD532按“平滑曲線(QUAD)”方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線酶標(biāo)儀打印輸出結(jié)果，即為檢測標(biāo)本真實(shí)濃度(mmol/L)。
六、結(jié)果報(bào)告果糖最終檢測結(jié)果以“μmol/一次射精”方式報(bào)告。
一次射精精漿果糖量(μmol)＝精漿果糖濃度(mmol/L)×一次射精的精液總體積(ml)七、正常參考值一次射精的精漿果糖含量≥13μmol。其中13μmol是根據(jù)WHO推薦的參考值。
八、臨床適用性1、可判斷精囊分泌功能；2、結(jié)合精漿中性α-葡糖苷酶的檢測，可判斷梗阻性無精癥的梗阻部位。
權(quán)利要求
1.一種精漿果糖酶法定量檢測試劑，包括緩沖液、顯色劑、酶保護(hù)液和標(biāo)準(zhǔn)品，其特征是所述酶保護(hù)液是含有果糖脫氫酶的酶保護(hù)液。
2.如權(quán)利要求1所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述酶保護(hù)液中果糖脫氫酶的含量為3000～8000U/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述含有果糖脫氫酶的酶保護(hù)液為凍干粉，還包括凍干粉溶解液，所述凍干粉溶解液是不含果糖脫氫酶的酶保護(hù)液。
4.如權(quán)利要求3所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述緩沖液為含防腐劑的檸檬酸緩沖液。
5.如權(quán)利要求1或2所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述顯色劑為含有碘唑四氮藍(lán)或碘硝基四氮唑紫、酚嗪二甲酯硫酸鹽的去離子水溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述顯色劑中碘唑四氮藍(lán)或碘硝基四氮唑紫的含量為0.01～0.1％、酚嗪二甲酯硫酸鹽的含量為0.2～0.8％。
7.如權(quán)利要求3所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述顯色劑為碘唑四氮藍(lán)或碘硝基四氮唑紫的含量為0.01～0.1％、酚嗪二甲酯硫酸鹽的含量為0.2～0.8％的去離子水溶液。
8.如權(quán)利要求1或2所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于還包括終止液，用于終止酶促反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求8所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于所述終止液為含有稀酸的溶液。
10.如權(quán)利要求3所述的精漿果糖酶法定量檢測試劑，其特征在于還包括終止液，所述終止液為含有稀酸的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種精漿果糖酶法定量檢測試劑，包括緩沖液、顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)品和酶保護(hù)液，所述酶保護(hù)液為含有果糖脫氫酶的酶保護(hù)液。所述酶保護(hù)液為凍干粉，還包括凍干粉溶解液，用于溶解酶保護(hù)液凍干粉。所述緩沖液為含防腐劑的檸檬酸緩沖液。還包括終止液，用于終止顯色反應(yīng)。所述終止液為含有稀酸的溶液。采用本發(fā)明，樣本無需進(jìn)行去蛋白處理，操作更簡單，反應(yīng)速度快，整個反應(yīng)過程只需40分鐘，試劑穩(wěn)定，2～8℃保存貯存期可達(dá)一年。
文檔編號C12Q1/54GK1595153SQ20041004024
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請人:深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司