專利名稱：精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷試劑及檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是精漿彈性硬蛋白酶(Seminal Plasma PMN-Elastase)檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
男性生殖道感染是男性不育的重要病因，占男性不育病因的4～10％。近年來(lái)，隨著性傳播疾病的蔓延，以及亞臨床癥狀和隱性感染的增多，對(duì)男性生殖道感染的實(shí)驗(yàn)室診斷受到特別的重視。醫(yī)學(xué)研究業(yè)已表明，采用過(guò)氧化物酶法檢測(cè)精液中的白細(xì)胞與精漿彈性硬蛋白酶濃度呈良好相關(guān)性。

發(fā)明內(nèi)容
目前體外診斷男性生殖道感染的測(cè)定方法，以顯微鏡鏡下觀察精液白細(xì)胞數(shù)量應(yīng)用最為廣泛。但此方法的結(jié)果報(bào)告主觀性較強(qiáng)，且準(zhǔn)確性受到標(biāo)本新鮮度的影響。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種方便實(shí)用、能夠定量檢測(cè)精漿彈性硬蛋白酶含量的試劑、試劑盒及其檢測(cè)方法，通過(guò)定量檢測(cè)精漿彈性硬蛋白酶的活性，從而確定免疫反應(yīng)中粒細(xì)胞的釋放量以及罹患炎性感染的程度，能為準(zhǔn)確診斷包括隱性感染在內(nèi)男性生殖道感染提供科學(xué)依據(jù)。
上述技術(shù)問(wèn)題的解決方案一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，包括標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液、終止液和含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品。
一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，基本上由標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液、終止液和含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品組成。
所述檢測(cè)試劑還包括微量孔板，所述微量孔板的底部包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體。
所述含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品是至少兩個(gè)彈性硬蛋白酶含量在0-4000納克/毫升之間不同濃度的磷酸鹽凍干粉或溶解液。彈性硬蛋白酶含量取值達(dá)4000納克/毫升，是為了可涵蓋人體精漿彈性硬蛋白酶含量的正常及異常值分布范圍。
所述酶結(jié)合物是含有α1-抗胰蛋白酶與辣根過(guò)氧化物酶的復(fù)合物、酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷與鹽酸的混合緩沖液。
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品是凍干粉時(shí)，還包括起復(fù)溶和穩(wěn)定作用的標(biāo)準(zhǔn)品溶解液，其組成及含量可選葡萄糖0.2～2.0％、氯化鈉1.0～10.0％、酪蛋白0.1～1.0％的水溶液。
所述顯色劑有兩種，一種是含有過(guò)硼酸鈉、氯己啶的檸檬酸與磷酸氫二鈉的混合緩沖液；另一種是含有3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺的二甲基亞砜溶液。為了不至于使?jié)舛鹊蜁r(shí)反應(yīng)速度慢，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)達(dá)不到所需要的反應(yīng)強(qiáng)度，濃度高時(shí)反應(yīng)速度快，非特異性顯色增多，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性，過(guò)硼酸鈉含量在0.01～0.10％之間為宜，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺含量在10～100毫摩爾/升之間為宜。
一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑盒，包括標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液、終止液、含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品和微量孔板，所述微量孔板的底部包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體。
一種包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量孔板的制備方法，包括(一)用去離子水配制包被液；(二)在上述包被液中加入小牛血清、葡萄糖，配制成封閉液；(三)將洗滌液稀釋；(四)作交叉實(shí)驗(yàn)，確定包被抗體與酶標(biāo)抗體的最佳濃度，用包被液稀釋包被抗體至最佳濃度，在微量孔板的各孔中加入包被抗體，使包被抗體充分包被在微量孔板的底部；(五)用洗滌液清洗微量孔板、拍干；(六)在微量孔板的各孔中加入封閉液，使封閉液中的大分子物質(zhì)吸附在未被包被抗體所包被的微量孔板的底部；(七)用洗滌液再清洗微量孔板內(nèi)未吸附的封閉液，拍干；(八)置入無(wú)菌室，抽濕干燥；(九)裝袋、封口保存。
將精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑用于檢測(cè)精漿彈性硬蛋白酶的方法，包括以下步驟(一)試劑準(zhǔn)備(1)標(biāo)本稀釋液配備將濃縮標(biāo)本稀釋液稀釋至應(yīng)用濃度；(2)標(biāo)準(zhǔn)品制備將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉置入溶解液溶解后用標(biāo)本稀釋液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；
(3)洗滌液配備將洗滌液稀釋至應(yīng)用濃度；(二)標(biāo)本制備將采集的精液經(jīng)液化、離心處理后，留取待檢精漿標(biāo)本并用標(biāo)本稀釋液稀釋；(三)定量檢測(cè)(1)準(zhǔn)備適當(dāng)數(shù)量的包被微量板孔，標(biāo)準(zhǔn)液、稀釋標(biāo)本加樣量相等，標(biāo)準(zhǔn)液取不同濃度；(2)用封片膜封板，使標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋標(biāo)本中的彈性硬蛋白酶與包被在微量孔板上的包被抗體充分反應(yīng)；(3)棄去封板膜，用洗滌液洗板，洗去標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋標(biāo)本中未被包被抗體特異性結(jié)合的其它物質(zhì)并拍干；(4)每孔加酶結(jié)合物后，再用封片膜封板，使結(jié)合在包被抗體上的彈性硬蛋白酶與酶結(jié)合物中的α1-抗胰蛋白酶反應(yīng)；(5)再次棄去封板膜，用洗滌液洗板，洗去未與彈性硬蛋白酶發(fā)生特異性結(jié)合的其它物質(zhì)并拍干；(6)將兩種顯色劑均勻混合配制后的顯色液加入微量孔內(nèi)，使顯色液被包被抗體-彈性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物上的辣根過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)；(7)每孔加終止液充分均勻混合后終止辣根過(guò)氧化物酶的催化反應(yīng)，送至酶標(biāo)儀；(8)通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，得到檢測(cè)結(jié)果。
采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于(1)由于彈性硬蛋白酶是一種中性蛋白酶，活性比較穩(wěn)定，利用其特有的抗原性，在精漿彈性硬蛋白酶檢測(cè)試劑中引入已知濃度含量的彈性硬蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)液，通過(guò)使標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋標(biāo)本中的彈性硬蛋白酶分別與彈性硬蛋白酶單克隆抗體的特異性結(jié)合，各自加入酶結(jié)合物，使結(jié)合在包被抗體上的彈性硬蛋白酶與酶結(jié)合物中的α1-抗胰蛋白酶反應(yīng)，可以顯效地增加反應(yīng)的特異性和靈敏度，加入顯色劑，使顯色液被包被抗體-彈性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物上的辣根過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)，生成有顏色產(chǎn)物，利用顏色強(qiáng)度與辣根過(guò)氧化物酶含量成正比的關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液中彈性硬蛋白酶的已知濃度含量，從而可以定量檢測(cè)出精漿彈性硬蛋白酶含量，為更準(zhǔn)確的診斷包括隱性感染在內(nèi)男性生殖道感染提供科學(xué)依據(jù)，本發(fā)明試劑已進(jìn)入臨床試用階段，適宜在治療男性不育的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。(2)由于本發(fā)明采用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，即使在處理或儲(chǔ)藏過(guò)程中造成精液白細(xì)胞的破損，也不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。避免了顯微鏡鏡下觀察精液白細(xì)胞數(shù)量的結(jié)果報(bào)告主觀性較強(qiáng)，且準(zhǔn)確性受到標(biāo)本新鮮度的影響(不新鮮的精液標(biāo)本中的白細(xì)胞易破損)。由于采用了包被有單克隆抗體的微量孔板，制成固相載體，檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、實(shí)用。(3)標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍廣，從0至4000納克/毫升，可涵蓋正常及異常值分布范圍。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，包括標(biāo)準(zhǔn)品 顯色劑B標(biāo)準(zhǔn)品溶解液 濃縮洗滌液(20倍)濃縮標(biāo)本稀釋液(10倍) 終止液酶結(jié)合物 包被微孔板顯色劑A其中，標(biāo)準(zhǔn)品包括標(biāo)準(zhǔn)品1彈性硬蛋白酶含量為4000納克/毫升的樣本稀釋液。
標(biāo)準(zhǔn)品1的制備方法1)、準(zhǔn)確稱取葡萄糖0.5克，氨基乙酸0.220克，硫柳汞0.020克置燒杯，攪拌溶于pH7.40.05M適量磷酸鹽緩沖液內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液定容至100毫升。
2)、稱取400微克彈性硬蛋白酶，溶于上述溶液內(nèi)，分裝凍干，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品2將標(biāo)準(zhǔn)品1向下倍比稀釋制得彈性硬蛋白酶含量為2000納克/毫升的樣本稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)品3將標(biāo)準(zhǔn)品2向下倍比稀釋制得彈性硬蛋白酶含量為1000納克/毫升的樣本稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)品4將標(biāo)準(zhǔn)品3向下倍比稀釋制得彈性硬蛋白酶含量為500納克/毫升的樣本稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)品5彈性硬蛋白酶含量為0的樣本稀釋液。
標(biāo)準(zhǔn)品在置于4℃下保存時(shí)為凍干粉。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解液是含有含有葡萄糖、氯化鈉、酪蛋白的水溶液。
標(biāo)準(zhǔn)品溶解液的制備方法
3)、稱取葡萄糖10克，氯化鈉30mM，酪蛋白2克，硫柳汞0.020克，溶于800毫升雙蒸水中。
4)、移入1000毫升裝容量瓶?jī)?nèi)，用雙蒸水定容至1000毫升，置4℃保存。
濃縮標(biāo)本稀釋液是含有氫化鈉、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫鈉、氯化鉀、硫柳汞和小牛血清的水溶液。
濃縮標(biāo)本稀釋液的制備方法5)、準(zhǔn)確稱取氫化鈉8.000克，磷酸二氫鉀0.200克，十二水磷酸氫鈉2.900克，氯化鉀0.200克，硫柳汞0.100克，溶于50毫升雙蒸水。
6)、加入已滅活小牛血清45毫升。調(diào)整pH值至7.4。加雙蒸水定容至100毫升。4℃保存。
顯色劑有兩種顯色劑A和B，顯色劑A是含有過(guò)硼酸鈉、氯己啶、檸檬酸和磷酸氫二鈉的混合緩沖液；顯色劑B是含有3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的二甲基亞砜溶液(DMA)。
顯色劑A的制作工藝方法7)、稱取過(guò)硼酸鈉(NaBO3·4H2O)0.4625g，氯己啶(又稱洗必太)0.010g，溶于0.05M檸檬酸/磷酸氫二鈉(Na2HPO4)緩沖液溶解(pH4.0)800毫升內(nèi)。
8)、調(diào)整pH值至4.0，用0.05M檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液定容至1000毫升。4℃保存。
顯色劑B的制作工藝方法9)、在分度值為萬(wàn)分之一的分析天平上準(zhǔn)確稱取3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺41mmol，溶于適量二甲基亞砜中，移入1000毫升裝的容量瓶?jī)?nèi)，以DMA定容至1000毫升。
濃縮洗滌液(20倍)的制作工藝方法10)、稱取氯化鈉16.0克，磷酸二氫鉀4.000克，十二水磷酸氫二鈉58.0克，氯化鉀4.000克，硫柳汞1.000克，溶于800毫升雙蒸水中。
11)、取10毫升Tween-20加于上述溶液內(nèi)，混勻。調(diào)節(jié)pH至7.4，用雙蒸水定容至1000毫升，4℃保存。
G、終止液的制作工藝方法12)、量取83.4ml濃鹽酸(37％)，用蒸餾水定容至1000ml。
13)、用1N氫氧化鈉滴定并校正其濃度至1N。
終止液可以是鹽酸含量為1.85～5.55％的水溶液。
H、酶結(jié)合物的制作工藝方法14)、取5mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶于1ml 0.3mol/L，pH 8.1碳酸氫鈉(NaHCO3)，加入1％二硝基氟苯(DNFB)無(wú)水乙醇溶0.1ml，室溫下輕微攪拌1小時(shí)。
15)、加1ml 0.06mol/L過(guò)碘酸鈉(NaIO4)，室溫下避光輕攪30分鐘。
16)、加1ml 0.16mol/L乙二醇，室溫下攪拌1小時(shí)，以終止氧化反應(yīng)。
17)、裝入透析袋，對(duì)0.01mol/LpH 9.5碳酸鹽緩沖液1000ml，4℃透析過(guò)液，換液三次。
18)、取步驟17)制得的醛化HRP溶液3ml加入含5mg α1-抗胰蛋白酶(anti-humanalpha1-antitrypsin)的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫避光輕攪拌2～3小時(shí)。
19)、加入5mg硼氫化鈉(NaHB4)，4℃過(guò)夜。
20)、裝入透析袋，對(duì)0.01mol/LpH 7.2的含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液在4℃下透析24小時(shí)，去除未反應(yīng)的硼氫化鈉，換液三次。
21)、3000r/min離心30min，除去沉淀物。上清液通過(guò)Sephadex G-200凝膠柱層析，PBS洗脫并收集凝膠柱內(nèi)的酶結(jié)合物。
22)、制備酶結(jié)合物稀釋液稱取0.5克酪蛋白，加入1000毫升pH7.520mmol/L的三羥甲基氨基甲烷與鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，在磁力攪拌器上加熱攪拌溶解。待其完全溶解后，加蒸餾水定容至1000毫升。稱取1.0克牛血清蛋白(BSA)、0.010克莧菜紅(AMARANTH)溶于上述溶液中，濾過(guò)除菌，4℃保存。此液即為酶結(jié)合物稀釋液。
23)、用酶結(jié)合物稀釋液稀釋酶結(jié)合物至適當(dāng)比例，4℃保存。
包被微孔板的制備方法，包括如下步驟(一)在優(yōu)質(zhì)去離子水中加入含180毫摩爾/升氯化鈉、0.75％疊氮鈉的0.015克分子濃度pH值為7.3的含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，配制包被液；(二)在上述包被液中加入6％小牛血清、11％葡萄糖，配制封閉液；(三)將洗滌液按比例1∶20稀釋；(四)作交叉實(shí)驗(yàn)，確定包被抗體與酶標(biāo)抗體的最佳濃度，用包被液稀釋包被材料，使其至最佳濃度，在微量孔板的每孔中加入100微升包被材料，在4℃下放置12小時(shí)；(五)用洗滌液洗微量孔板兩次，每次拍干；
(六)每孔加入封閉液100微升，在4℃下放置12小時(shí)；(七)用洗滌液再洗微量孔板一次，拍干；(八)置入無(wú)菌室，抽濕干燥12小時(shí)；(九)置入鋁薄袋，封口，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?br> 一種采用上述精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑制作的試劑盒，各組分含量為標(biāo)準(zhǔn)凍干粉溶解液50～150微升、標(biāo)準(zhǔn)液50～150微升、酶結(jié)合物50～150微升、顯色劑A 50～150微升、顯色劑B 1～4微升、終止液50～150微升和包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量孔板。
一種優(yōu)選方案，各組分含量為標(biāo)準(zhǔn)凍干粉溶解液100微升、標(biāo)準(zhǔn)液100微升、酶結(jié)合物100微升、顯色劑A 100微升、顯色劑B 2.5微升、終止液100微升和包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量孔板。
上述精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑用于精漿彈性硬蛋白酶定量檢驗(yàn)的步驟包括(一)試劑準(zhǔn)備(1)標(biāo)準(zhǔn)品制備將彈性硬蛋白酶含量為4000納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)凍干粉，用標(biāo)準(zhǔn)凍干粉溶解液復(fù)溶至凍干前的體積，溶解0.5小時(shí)待用；將彈性硬蛋白酶含量為4000納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)液向下分別稀釋為彈性硬蛋白酶含量為2000、1000和500納克/毫升三種濃度。
(2)標(biāo)本稀釋液配備以10倍蒸餾水將濃縮標(biāo)本稀釋液稀釋。
(3)洗滌液配備以20倍蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋。
(二)標(biāo)本制備采集的新鮮精液液化后，迅速取部分精液以2000g離心處理10分鐘，留取精漿立即檢測(cè)，或在-20℃下儲(chǔ)存待分析；檢測(cè)前，將待檢精漿標(biāo)本1∶101稀釋。
(三)定量檢測(cè)
(1)準(zhǔn)備一定數(shù)量的包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量板孔標(biāo)準(zhǔn)液、稀釋標(biāo)本加樣量都為100微升/孔。五種標(biāo)準(zhǔn)液彈性硬蛋白酶濃度依次為4000、2000、1500、500和0納克/毫升，以標(biāo)本稀釋液作為0標(biāo)準(zhǔn)。
(2)用封片膜封板置于350～400轉(zhuǎn)/分鐘的孵育振蕩器，在室溫18～28℃下反應(yīng)1小時(shí)。
(3)棄去封板膜、洗板以洗滌液注滿微孔，每次浸泡1分鐘，共洗板5次，拍干。
(4)每孔加酶結(jié)合物100微升用封板膜封板，置于350～400轉(zhuǎn)/分鐘的孵育振蕩器，在室溫18～28℃下反應(yīng)0.75小時(shí)。
(5)再次棄去封板膜、洗板以洗滌液注滿微孔，每次浸泡1分鐘，共洗板5次，拍干。
(6)每孔加顯色液100微升在室溫18～28℃下避光反應(yīng)1/3小時(shí)。
顯色液在使用前0.5小時(shí)內(nèi)臨時(shí)配制，配制方法是按體積比40∶1，將兩種顯色劑均勻混合。
(7)每孔加終止液100微升充分均勻混合后終止反應(yīng)，在1/4小時(shí)內(nèi)送至酶標(biāo)儀。
(8)酶標(biāo)儀以450/630毫微米雙波長(zhǎng)進(jìn)行比色，檢測(cè)結(jié)果由酶標(biāo)儀自動(dòng)輸出。
精漿彈性硬蛋白酶檢驗(yàn)的臨床參考值如下正常值＜290納克/毫升；隱性感染290～1000納克/毫升；確證感染＞1000納克/毫升。
權(quán)利要求
1.一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，包括標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液和終止液，其特征在于還包括含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品。
2.一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，基本上由標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液、終止液和含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品組成。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括微量孔板，所述微量孔板的底部包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體。
4.按照權(quán)利要求3所述的精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品是至少兩個(gè)彈性硬蛋白酶含量在0-4000納克/毫升之間不同濃度的磷酸鹽凍干粉或溶解液。
5.按照權(quán)利要求3所述的精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述酶結(jié)合物是含有α1-抗胰蛋白酶與辣根過(guò)氧化物酶的復(fù)合物、酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷與鹽酸的混合緩沖液。
6.按照權(quán)利要求5所述的精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，其特征在于還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶解液，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶解液是葡萄糖含量為0.2～2.0％、氯化鈉含量為1.0～10.0％、酪蛋白含量為0.1～1.0％的水溶液。(起復(fù)溶和穩(wěn)定作用)
7.按照權(quán)利要求6所述的精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑，其特征在于所述顯色劑有兩種，一種是含有過(guò)硼酸鈉、氯己啶的檸檬酸與磷酸氫二鈉的混合緩沖液；另一種是含有3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺的二甲基亞砜溶液，其中過(guò)硼酸鈉含量為0.01～0.10％，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺含量為10～100毫摩爾/升。
8.一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑盒，包括標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液和終止液，其特征在于還包括含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品和微量孔板，所述微量孔板的底部包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體。
9.一種包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量孔板的制備方法，包括(一)用去離子水配制包被液；(二)在上述包被液中加入小牛血清、葡萄糖，配制成封閉液；(三)將洗滌液稀釋；(四)作交叉實(shí)驗(yàn)，確定包被抗體與酶標(biāo)抗體的最佳濃度，用包被液稀釋包被抗體至最佳濃度，在微量孔板的各孔中加入包被抗體，使包被抗體充分包被在微量孔板的底部；(五)用洗滌液清洗微量孔板、拍干；(六)在微量孔板的各孔中加入封閉液，使封閉液中的大分子物質(zhì)吸附在未被包被抗體所包被的微量孔板的底部；(七)用洗滌液再清洗微量孔板內(nèi)未吸附的封閉液，拍干；(八)置入無(wú)菌室，抽濕干燥；(九)裝袋、封口保存。
10.將精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑用于檢測(cè)精漿彈性硬蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(一)試劑準(zhǔn)備(1)標(biāo)本稀釋液配備將濃縮標(biāo)本稀釋液稀釋至應(yīng)用濃度；(2)標(biāo)準(zhǔn)品制備將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉置入溶解液溶解后用標(biāo)本稀釋液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；(3)洗滌液配備將洗滌液稀釋至應(yīng)用濃度；(二)標(biāo)本制備將采集的精液經(jīng)液化、離心處理后，留取待檢精漿標(biāo)本并用標(biāo)本稀釋液稀釋；(三)定量檢測(cè)(1)準(zhǔn)備適當(dāng)數(shù)量的包被微量板孔，標(biāo)準(zhǔn)液、稀釋標(biāo)本加樣量相等，標(biāo)準(zhǔn)液取不同濃度；(2)用封片膜封板，使標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋標(biāo)本中的彈性硬蛋白酶與包被在微量孔板上的包被抗體充分反應(yīng)；(3)棄去封板膜，用洗滌液洗板，洗去標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋標(biāo)本中未被包被抗體特異性結(jié)合的其它物質(zhì)并拍干；(4)每孔加酶結(jié)合物后，再用封片膜封板，使結(jié)合在包被抗體上的彈性硬蛋白酶與酶結(jié)合物中的α1-抗胰蛋白酶反應(yīng)；(5)再次棄去封板膜，用洗滌液洗板，洗去未與彈性硬蛋白酶發(fā)生特異性結(jié)合的其它物質(zhì)并拍干；(6)將兩種顯色劑均勻混合配制后的顯色液加入微量孔內(nèi)，使顯色液被包被抗體-彈性硬蛋白酶-α1-抗胰蛋白酶-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物上的辣根過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)；(7)每孔加終止液充分均勻混合后終止辣根過(guò)氧化物酶的催化反應(yīng)，送至酶標(biāo)儀；(8)通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，得到檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種精漿彈性硬蛋白酶定量檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法，檢測(cè)試劑包括標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物、顯色劑、洗滌液、終止液和含有用于定量檢測(cè)的彈性硬蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步地，酶結(jié)合物是含有α1－抗胰蛋白酶與辣根過(guò)氧化物酶的復(fù)合物、酪蛋白的三羥甲基氨基甲烷與鹽酸的混合緩沖液。試劑中還包括包被有彈性硬蛋白酶單克隆抗體的微量孔板。通過(guò)彈性硬蛋白酶單克隆抗體包被材料和酶結(jié)合物，可以顯效地增加反應(yīng)的特異性和靈敏度。本發(fā)明還公開(kāi)了上述檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)單、實(shí)用，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)結(jié)果，可以從配用的酶標(biāo)儀自動(dòng)輸出。綜上所述，本發(fā)明通過(guò)引入標(biāo)準(zhǔn)濃度的彈性硬蛋白酶，從而可以定量檢測(cè)出精漿彈性硬蛋白酶含量，為更準(zhǔn)確的診斷包括隱性感染在內(nèi)的男性生殖道感染提供科學(xué)依據(jù)。適宜在治療男性不育的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK1754964SQ20041004079
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者傅劍華, 劉瑜, 胡家純, 何林, 何小紅 申請(qǐng)人:深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司