專利名稱：一種蟲草真菌胞內多糖復合物的制備及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥技術領域，具體涉及一種蟲草真菌(Tolypocladium sp.)胞內多糖的制備方法及其抗腫瘤、抗氧化活性的應用。
背景技術：
冬蟲夏草是我國一種名貴的強壯滋補類中藥，作為一種既可藥用又可食用的高級滋補品，對老、少、病、弱、虛者皆宜服用，無任何副作用。由于其嚴格的寄生性和特殊的生長地理環境，天然蟲草資源越來越少，價格十分昂貴。近來已有研究報道，人工培養的蟲草真菌活性成分與天然蟲草非常相似，具有廣泛的生物活性作用，目前已有數種人工培養的蟲草真菌開發成產品。因此，采用人工培養的蟲草真菌來代替天然蟲草已成趨勢。
蟲草多糖是蟲草所含生理活性物質中最重要、最豐富的類群之一，其特點為生理活性強，適應面廣，可用于治療高血脂癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性疲勞綜合癥、慢性肝炎、肝硬化、惡性腫瘤以及減輕腫瘤放療和化療后的毒副作用。

發明內容
本發明需要解決的問題是提供一種蟲草真菌胞內多糖的制備方法及其抗腫瘤、抗氧化活性的應用。本發明方法簡便，所得蟲草真菌胞內多糖得率高、活性顯著、周期短、無毒、安全。
本發明技術方案1、以本實驗室優化得到的液體發酵培養基培養蟲草真菌，經過濾收集菌絲體。烘干，磨碎，用熱水浸提法提取其胞內多糖復合物PS，得率為6％～7％。
2、采用H22小鼠肝癌模型測定胞內多糖復合物對腫瘤生長的作用和抗氧化作用，如瘤重，肝、腦、血清脂質過氧化產物丙二醛(MDA)及其超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力。該多糖復合物可顯著抑制腫瘤的生長，提高肝、腦過氧化物酶的活力，降低脂質過氧化物的產生。
本發明的有益效果本發明所述的蟲草真菌胞內多糖復合物具有較強的抗氧化能力，同時對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用。目前的研究表明機體內自由基含量與腫瘤的關系非常密切，腫瘤的發生、促進和發展三個階段中，均有自由基的催化、推動。因此，利用抗氧化物質消除機體內過多的自由基，可以在一定程度上抑制腫瘤的發生、促進和發展。SOD和GSH-PX是體內重要的抗氧化酶，可使體內過多的O2-、·OH、H2O2等毒性自由基轉變為低毒性物質，這對保護機體免受自由基的損害非常重要。SOD和GSH-PX同時升高，可有助于細胞清除活性氧損傷的能力。MDA是細胞膜脂質過氧化物的終產物，且本身也可交聯蛋白質、磷脂上的氨基，使細胞可塑性降低，導致細胞膜損傷。本實驗室所研究制備的蟲草真菌胞內多糖能顯著提高小鼠血清、肝、腦組織中SOD和GSH-PX的活性，降低小鼠血清、肝、腦中MDA的含量。
由此可見，本實驗室研究制備的蟲草真菌胞內多糖復合物具有較好的抗腫瘤和抗氧化活性，可用于制備各種預防和治療腫瘤的藥物和保健品，以及抗衰老保健食品，其活性顯著、價格低廉、生產簡便、無毒、安全。
具體實施例方式
1.蟲草真菌的培養固體培養基(PDA)1000ml馬鈴薯浸出液(取馬鈴薯切片20g于蒸餾水1000ml中煮沸30min)，20g葡萄糖，15g瓊脂，pH7.0.
液體培養基(1L)蛋白胨5g，酵母粉2g，葡萄糖40g，KH2PO41g，MgSO40.5，pH7.0。
種子液培養100ml錐形瓶中裝25ml蟲草真菌液體培養基，挑取已活化的PDA平板上菌落邊緣的瓊脂菌絲塊(0.Scm×0.5cm)接種至液體培養基中培養，于搖床25℃，180r/min培養4天。
擴大培養100ml錐形瓶中裝25ml蟲草真菌液體培養基，每瓶接種2.5ml種子液，于搖床25℃，180r/min培養4天。
2.胞內多糖復合物PS的制備通過過濾收集菌絲體，將菌絲體用蒸餾水清洗3遍后置于50℃烘箱中烘干，磨碎。取20g磨成細粉的干菌絲體加入400ml蒸餾水中煮沸3個小時，3000r/min離心10min，收集上清液，重復3次后合并上清液。將得到的上清液濃縮至體積小于100ml，冷卻至室溫后加3倍體積95％乙醇沉淀，4℃過夜。然后再以3000r/min離心10min收集沉淀，蒸餾水溶解沉淀后離心，取上清液進行透析，離心去不溶物，取上清液再次用無水乙醇沉淀，自然干燥，即獲得胞內多糖復合物PS，得率為6％～7％。，其中多糖含量為80.11％。
3.動物實驗雄性ICR小鼠30只，隨機分成4組，每組6只。正常組不接種腫瘤，給等量生理鹽水；腫瘤未治療組不給藥，給生理鹽水；胞內多糖低劑量組(PSl)(100mg/Kg)；胞內多糖高劑量組(PS2)(200mg/Kg)。每天固定時間給藥一次并記錄小鼠活動情況，胞內多糖采用灌胃方式給藥，每次灌胃0.2ml/只。給藥7天后，每只小鼠右腋下皮下接種0.1ml濃度為1×107個/ml的H22腫瘤細胞。繼續給藥7天，于最后一次給藥后24h測小鼠體重，眼球摘除放血法處死小鼠，離心收集血清用于測定MDA含量和SOD活力。剝離皮下腫瘤并稱重，在冰臺上迅速取出肝、腦組織用鋁箔包好立即放置-80℃保存，用于測定肝、腦脂質過氧化產物丙二醛(MDA)及其SOD、GSH-PX活力。
4.抗氧化酶活性及脂質過氧化物測定用黃嘌呤氧化酶法測定SOD、二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-PX。用硫代巴比妥酸法測定MDA。
胞內多糖復合物PS對小鼠腫瘤生長的作用結果見表1。與腫瘤未治療組相比，治療組的平均腫瘤重量均有所下降，其中PS1組對皮下H22腫瘤的生長有顯著抑制作用。
表1 胞內多糖復合物對小鼠皮下H22腫瘤重量的影響(x±s)

*P＜0.05，與腫瘤未治療組相比較。
胞內多糖復合物對小鼠肝、腦、血清SOD活力的影響見表2。在肝、腦組織中，腫瘤未治療組SOD活力顯著低于正常對照組水平；PS1、PS2組SOD活力相對于腫瘤未治療組有顯著升高，腦組織PS2組SOD活力較正常小鼠體內SOD活性水平顯著升高，其余各組較正常小鼠體內SOD活性升高但無顯著性差異。在小鼠血清中，腫瘤未治療組SOD活力與正常對照組相比無顯著性降低；PS1、PS2組SOD活力相對于正常對照組、腫瘤未治療組均有顯著性升高。
表2 胞內多糖復合物對小鼠肝、腦、血清SOD活力的影響(x±s)

#P＜0.05，與正常對照組比較。*P＜0.05，**P＜0.01與腫瘤未治療組相比較。
胞內多糖復合物對小鼠肝、腦GSH-PX活力的影響見表3。在小鼠肝、腦組織中，腫瘤未治療組GSH-PX活力相對于正常對照組顯著降低；PS1、PS2組中除PS1組中腦組織GSH-PX活力較腫瘤組無顯著升高外，肝、腦組織GSH-PX活力相對于腫瘤未治療組均有顯著增加，但是與正常對照組相比無顯著性差異。
表3 胞內多糖復合物對小鼠肝、腦GSH-PX活力的影響(x±s)

#P＜0.05，與正常對照組比較。*P＜0.05，**P＜0.01與腫瘤未治療組相比較。
胞內多糖復合物對小鼠肝、腦、血清脂質過氧化產物MDA的影響見表4。在小鼠肝、腦組織和血清中，腫瘤未治療組MDA值較正常對照組有所升高，其中腦組織中MDA有顯著性提高；與腫瘤未治療組相比，PS1、PS2肝臟組織中MDA有極顯著性降低，在PS2腦組織中有顯著性降低，但是在血清中無顯著性差異。
表4 胞內多糖復合物對小鼠肝、腦、血清脂質過氧化產物MDA的影響(x±s)

#P＜0.05，與正常對照組比較。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與腫瘤未治療組相比較。
通過以上研究表明，本發明制備的蟲草真菌胞內多糖復合物能夠顯著提高H22肝癌模型小鼠肝、腦、血清中的SOD、GSH-PX活力，減少脂質過氧化物的積累，具有明顯的抗氧化、抗腫瘤作用。
權利要求
1.一種蟲草真菌胞內多糖復合物的制備方法，其特征在于(1)蟲草真菌發酵的液體培養基成分為1L培養基中含蛋白胨5g，酵母粉2g，葡萄糖40g，KH2PO41g，MgSO40.5，pH7.0；(2)蟲草真菌的培養條件為25～28℃，180r/min搖床震蕩培養3～4天；(3)蟲草真菌胞內多糖復合物的制備，通過過濾收集菌絲體，將菌絲體用蒸餾水清洗3遍后置于50℃烘箱中烘干，磨碎，取20g磨成細粉的干菌絲體加入400ml蒸餾水中煮沸3個小時，3000r/min離心10min，收集上清液，重復3次后合并上清液，將得到的上清液濃縮至體積小于100ml，冷卻至室溫后加3倍體積95％乙醇沉淀，4℃過夜，然后再以3000r/min離心10min收集沉淀，蒸餾水溶解沉淀后離心，取上清液進行透析，離心去不溶物，取上清液再次用無水乙醇沉淀，自然干燥，即獲得胞內多糖復合物PS。
2.根據權利要求1所述方法生產的蟲草真菌胞內多糖在制備預防和治療腫瘤藥物或保健品中的應用。
3.根據權利要求1所述方法生產的蟲草真菌胞內多糖在制備抗衰老保健品中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物制藥技術領域。研究了一種蟲草真菌胞內多糖的制備方法及其抗腫瘤、抗氧化活性的應用，用于研制開發藥品，保健品和功能食品。蟲草真菌經液體培養后所得到的菌絲體烘干磨碎，用熱水提取法提取胞內多糖(PS)，得率為6～7％，其中多糖含量為80.11％。獲得的提取物具有較強的抗腫瘤、抗氧化活性，可用于藥品和保健食品的基料，具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、預防心血管疾病等功能。
文檔編號C12P19/04GK1706956SQ20051004026
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月27日 優先權日2005年5月27日
發明者張偉云, 陳佳萍, 陳偉, 蘆婷婷, 李靜, 鄭翌 申請人:南京大學