專利名稱：米曲霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株米曲霉菌及其在生產釀造醬油中的應用。
背景技術：
米曲霉(Aspergillus oryzae)是釀造醬油中必不可少的微生物，也是釀造醬油生產過程中的核心技術。米曲霉所含的蛋白酶可將原料(黃豆)中的蛋白質分解為氨基酸，所含的淀粉酶可將原料(面粉)中的淀粉分解為糖，從而構成了釀造醬油的主要成分。
優質高產的米曲霉菌種不僅能提高原材料的利用率、產品出品率，還能縮短生產周期、降低生產成本，提高釀造醬油的風味和品質，因此迫切需要一種優質高產的米曲霉菌種。

發明內容
本發明的目的是一株優質高產的米曲霉菌。
本發明所提供的米曲霉菌菌株是(Aspergillus oryzae)LiY05，該菌株已于2006年05月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1711。
米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711的菌落呈圓形，質地疏松，初期菌落中間白色，四周邊緣呈透明射線狀。菌落剛形成時，僅中間一點呈白色，以后隨菌落長大，白色范圍也逐漸擴大，而透明的范圍從一片縮小成邊緣一狹環狀。隨菌落長大，菌落的中心點先呈黃綠色，然后黃綠色向四周擴展。成熟菌落為黃宰色，有時為淡綠宰色。7-10天可達6cm左右，分生孢子頭為放射形，頂囊近視球形，直徑一般為40-50μm，有梗莖。該菌株的孢子形成能力為1.15×1010/g，發芽率為30.98％。具有較高的蛋白酶活力，酸性蛋白酶活為82.58u/g(發酵物)，中性蛋白酶活為2151.81u/g(發酵物)，堿性蛋白酶活為62.4u/g(發酵物)。
可用常規的米曲霉菌培養基及培養方法對本發明的米曲霉菌(Aspergillusoryzae)LiY05 CGMCC No.1711進行培養。
本發明提供了一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711。試產實驗結果證明由該菌株制備的成曲顏色鮮艷，手感輕，菌絲結塊好，孢子著生好，發酵制備醬油產量高、能耗低。本發明的菌株將在釀造醬油生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所有百分比濃度均為質量百分比濃度，所有培養基中的溶劑均為水。
實施例1、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711的第一階段試產試驗對深圳市李金記食品有限公司目前釀造醬油生產用菌種進行篩選、分離，得到一株高產菌株，命名為LiY05，該菌株已于2006年05月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1711。
現用如下方法對本發明釀造醬油生產用菌種LiY05 CGMCC No.1711進行試產試驗1、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711的復接檢測米曲霉菌LiY05能否在常規的米曲霉試管斜面培養基上生長繁殖。分別在常規的米曲霉試管斜面培養基(酐酪素4g，KH2PO40.36g，Na2HPO4·7H2O 1.1g，瓊脂15g，用水定容至1000mL)上接種了10支米曲霉菌LiY05，在30℃下培育3天，結果全部復接成功，可作為生產釀造醬油的始發菌種。
2、復接菌種的分離復壯從復接成功的斜面菌種中篩選出外觀形態好、酶活力高的米曲霉單菌株，以獲得適合釀造醬油生產需要的適應性強、高產優質菌株。具體方法為選擇外觀形態好的試管斜面菌種，將其劃線接種于分離復壯平皿(培養基配方與斜面培養基相同)中，在30℃下培育5-6天，并從平皿中挑選菌落直徑大、外觀形態優良的米曲霉單菌株挑接到斜面試管中，共獲得10株斜面試管菌株，分別編號Y001-Y010，作為第一代試管菌種。
3、分離復壯菌種的初步篩選將步驟2經復壯獲得的菌種Y001-Y010再次接種于斜面試管中，在30℃下培育3天，結果全部接種成功。然后將此10個斜面菌種分別接種于裝有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)專用液體培養基(酐酪素4g，KH2PO40.36g，Na2HPO4·7H2O 1.1g，用水定容至1000mL)的三角瓶中進行擴大培養，用常規方法檢測酶活力，結果見表1，從中挑選出酶活力最高的Y003斜面復壯菌種作為醬油試產實驗用菌種。
表1 Y001-Y010的酶活力檢測結果(單位/克)


4、三角瓶菌種的擴大培養將步驟3挑選出酶活力最高的Y003斜面復壯菌種接種于裝有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)專用液體培養基的三角瓶中進行培養，在30℃下培育3天，結果培養成功。并對該菌種進行了感官、菌絲鏡檢、酶活力測定，結果該菌菌落呈圓形，質地疏松，初期菌落中間白色，四周邊緣呈透明射線狀。菌落剛形成時，僅中間一點呈白色，以后隨菌落長大，白色范圍也逐漸擴大，而透明的范圍從一片縮小成邊緣一狹環狀。隨菌落長大，菌落的中心點先呈黃綠色，然后黃綠色向四周擴展。成熟菌落為黃宰色，有時為淡綠宰色。7-10天可達6cm左右，分生孢子頭為放射形，頂囊近視球形，直徑一般為40-50μm，有梗莖。該菌株的孢子形成能力約為1.15×1010/g，發芽率約為30.98％。具有較高的蛋白酶活力，酸性蛋白酶活約為82.58u/g(發酵物)，中性蛋白酶活約為2151.81u/g(發酵物)，堿性蛋白酶活約為62.4u/g(發酵物)。
5、種曲的試產在與步驟4相同的培養載體及培養條件下，同時對Y003米曲霉菌進行種曲的試產，在30℃下培育3天，結果該種曲試產成功。同時對上述種曲進行了酶活力檢測及感官評定，酶活力檢測結果為(單位/克)Y003的酶活是19796.95，孢子數為1.15×1010/克，色澤翠綠，曲香濃厚，手感均勻疏松，特別適合于生產釀造醬油。
6、醬油生產用曲的第一階段試產現對Y003種曲進行試產，以檢測其對通風制曲生產工藝的適應情況，及在原料大豆、面粉中的生長、繁殖情況。在通風制曲過程中的種曲食鹽濃度相同(21.83g/100mL)，在30℃下培育3天；發酵時統一用料量為大豆1650kg/天，面粉600kg/天，在30℃下發酵80-90天。
通風制曲結果表明米曲霉種曲Y003，在種曲生產過程中無需作特別處理，即在原種曲生產工藝的基礎上，完全可以正常生產。Y003成曲孢子量較大，成曲孢子飛揚，色澤黃綠，偏深黃。但是醬油生產制曲的最終目標是使米曲霉在原料(大豆、面粉)中生長繁殖，是要曲霉產生大量的蛋白酶和淀粉酶，所以成曲中菌絲的著生情況亦很重要，若單追求孢子多，而忽視菌絲是否生長旺盛就不全面了。曲香濃、手感松、結塊好、孢子著生不很久的成曲才是理想的成曲。此外，Y003菌種的適溫較強，能在32-38℃下生長正常，孢子萌發期較原來快4-8小時，用此種曲制曲，將使制曲時間從36小時縮短為30-32小時，可節約近20％的能耗，適用于釀造醬油的生產。
制醪發酵結果表明Y003成曲發酵的醬油色澤較好，發酵過程中，氨基酸生成速度，總酸及食鹽含量均正常。
發酵終結后，發酵終結后，檢測用Y003成曲制備的醬油的感觀特征、理化指標及微生物指標，結果醬油呈紅棕色，有光澤，澄清，醬香純厚，滋味鮮美，咸淡適口；氨基酸肽氮含量≥1.6g/100mL；菌落總數(個/mL)≤2000，大腸桿菌(個/100mL)≤20，符合釀造醬油國家標準。表明本發明的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCCNo.1711適用于釀造醬油的生產。
實施例2、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711的第二階段試產用與實施例1相同的條件對米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCC No.1711進一步進行試產，包括以下步驟一、三角瓶擴大培養將實施例1復壯的米曲霉菌LiY05再次接種于斜面試管中，在30℃下培育3天，然后將斜面菌種分三批(每批間隔1-3天)接種于裝有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)專用液體培養基的三角瓶中擴大培養，不同批次的擴大培養時間見表2，擴大培養后的三角瓶菌種，菌絲呈白色，并長滿綠黃色孢子，輕輕搖瓶感覺蓬松，孢子可脫落飛揚，三批感覺差異不大。同時檢測了酶活力，酶活檢測結果見表2，不同批次的種曲都具有較高的酶活，但存在一定差距。
表2 擴大培養的米曲霉菌LiY05的酶活檢測結果

二、生產用種曲試產分五批(編號Y-00-1～Y-00-5)對上述不同批次的米曲霉菌LiY05種曲進行試產，連續交叉投料10天，具體安排如下4月15日種曲Y-00-1、Y-00-2試產各二天種曲，4月18日完成；4月19日種曲Y-00-3、Y-00-4試產各二天種曲，4月21日完成；4月21日種曲Y-00-5試產各一天種曲，4月24日完成。
分別使用4月15日、4月19日、4月21日在相同條件下制作的三批三角瓶種曲，進行試產。三批成熟的種曲從感官上分析，種曲色澤黃綠，孢子著生情況好。試產結果都感覺曲香濃厚，手感輕，蓬松，手輕觸種曲孢子立即脫落飛揚，三批種曲都是優質種曲。對成熟后的三批種曲進行了酶活力、孢子數檢測。檢測方法按中華人民共和國專業標準(孢子數測定法ZBx66028-87，蛋白酶活力測定法SBx.10317-1999)進行，檢測結果見表3，三批種曲的酶活力及孢子數均較高。
表3 三批成熟種曲的酶活力、孢子數檢測結果

三、通風制曲試產從4月26日開始，采用隔天交叉投料的方法對五批(編號Y-00-1～Y-00-5)米曲霉菌LiY05種曲進行通風制曲試產，并檢測酶活力，酶活檢測結果見表4，制備的成曲的酶活均較高，但不同批次存在差異。
表4 由五批米曲霉菌LiY05種曲制備的成曲的酶活力

感官上看，上述五批米曲霉菌LiY05種曲制得的成曲顏色都較鮮艷，無異常情況，成曲手感輕，菌絲結塊好，孢子著生好，但個別曲料因翻曲破碎不細，所以造成成曲中有直徑4-6cm硬的顆粒，致使菌絲、孢子無法深入著生，雖對成曲的質量影響不大，但應注意。
制曲后期溫度偏高，曲料表面生長雖然良好，但曲料底層水份感覺不夠，因溫度偏高水分發揮過快，造成曲料有收縮裂紋的現象，而裂紋又沒有經常壓緊，造成風從裂紋中跑掉，影響了裂紋周邊的供風與成曲質量，可通過降低后期制曲溫度以及加強補水進行解決此問題，以保證成曲的質量。
在上述通風制曲過程中，不同批次的米曲霉菌LiY05種曲的孢子萌發、菌絲生成、孢子再生過程都較快，比傳統種曲快3-6小時，制曲時間可由原來的40-42小時縮短為36-40小時，使能耗降低約20％。
四、制醪發酵發酵終結后，發酵終結后，檢測用LiY05成曲制備的醬油的感觀特征、理化指標及微生物指標，結果醬油呈紅棕色，有光澤，澄清，醬香純厚，滋味鮮美，咸淡適口；氨基酸肽氮含量≥1.6g/100mL；菌落總數(個/mL)≤2000，大腸桿菌(個/100mL)≤20，符合釀造醬油國家標準。表明本發明的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05 CGMCCNo.1711適用于釀造醬油的生產。
權利要求
1.米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiYO5C GMCC No.1711。
2.權利要求1所述的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiYO5 CGMCC No.1711在生產釀造醬油中的應用。
全文摘要
本發明公開了米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiY05CGMCC No.1711及其在生產釀造醬油中的應用。試產實驗結果證明由該菌株制備的成曲顏色鮮艷，手感輕，菌絲結塊好，孢子著生好，發酵制備醬油產量高、能耗低。本發明的菌株將在釀造醬油生產中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A23L1/238GK1869195SQ20061001211
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月6日 優先權日2006年6月6日
發明者李懷寶, 張玲 申請人:李懷寶