本發明屬于卷煙香精香料制備技術領域，具體是涉及一種利用特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。
背景技術：
在煙草行業中，香精香料對卷煙產品的口味起著決定性作用。現今生產的香料、香精中約85％的產品是通過化學合成方法得到的。但是用化學法合成的香料不僅合成較困難、且大量使用會對人體健康造成影響。隨著人們生活水平的提高，對煙用香料的需求趨向于天然、健康、安全、營養和多功能性。
天然香精香料是高價值的精細化工產品，但由于原料有限、提取成本高，僅僅依靠從天然動、植物中提取天然香料，遠遠滿足不了卷煙香料市場的需求。利用微生物發酵技術可以制備香料或進行香料的轉化，在提高香料產品質量的同時，還能夠節約能源、降低成本，因此，科技人員對于卷煙用香精香料的生物制取技術進行了不斷嘗試。
類胡蘿卜素是一大類在自然界廣泛分布的四萜類化合物，其降解的致香物質包括β-紫羅蘭酮、β-大馬酮、和二氫獼猴桃內酯等，因具有較低的感觀閾值，是許多香料的特征香味，這類香味物質在天然材料中含量很低，且提取成本昂貴，近年來一些研究者嘗試通過酶或微生物體系模擬類胡蘿卜素的自然降解，以獲得新型香料。
米曲霉(aspergillusoryzae)在自然界廣泛分布，是一類產復合酶的菌株，除產蛋白酶外，還可產淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，但關于用米曲霉降解葉黃素制備煙用香料的研究，在現有技術中尚未見報道。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種以特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。所得產品符合天然香料的要求，具有濃郁木香味，能夠與煙香形成良好的配伍。
本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為質量百分數。
本發明從云南省紅河州陳化煙葉中分離了一株真菌ynca9804作為試驗菌種，對其進行了its序列分析，鑒定結果表明該細菌屬于曲霉屬，其分類命名為米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804，保藏號為cctccno：m2016654。
本發明所述的米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株的形態學特征為：菌落微膨大、疏松粉狀，中間淡黃綠色，邊緣白色，背面乳白色；菌絲體發達，菌絲不光滑，有隔多分枝；分生孢子梗粗糙或有麻點，孢子囊呈球形或半球形，孢子鏈著生于小孢子梗上。
本發明所述的米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株的分子鑒定特征為：測序結果在genbank中進行同源性比對，提取相似度98％以上的序列，利用mega6.0軟件，以領域連接法構建系統發育樹，ynca9804與菌株aspergillusoryzaestrainatcc42149聚為一簇，同源性為100％，鑒定菌株ynca9804為米曲霉(aspergillusoryzae)。
利用所述米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法，包括以下步驟：
(1)將米曲霉菌株ynca9804置于斜面固體培養基中保存備用；
(2)葉黃素儲備液的制備：稱取5g葉黃素，溶于10ml的二氯甲烷中，待葉黃素徹底溶解后加入1gtween-80進行乳化；在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發干，再加入100ml無菌蒸餾水混合均勻，得儲備液待用；
(3)降解葉黃素的產香發酵：
①將保存備用的米曲霉菌株ynca9804轉接到液體種子培養基中，搖床上28℃培養24h，轉速為180r/min，得米曲霉種子液；所述的液體種子培養基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5～6.8，裝入250ml錐形瓶，100ml/瓶，121℃，25min滅菌備用；
②取步驟①所得米曲霉種子液，按培養基體積比1％接入50l發酵罐中進行液體培養，同時按培養基體積比0.05％～1％加入葉黃素儲備液，50l發酵罐定容30l；所述的培養基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5；培養控制條件：溫度25～40℃，通氣比0.1～10，罐壓：0.03～0.08mpa，do≥20％，攪拌速率120～400r/min，發酵時間48h～192h；
(4)發酵完成后過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
進一步的，為防止香料變質，按煙用香料重量的5％添加丙二醇。
步驟(1)中所述的斜面固體培養基為：馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph值6.5～6.8，121℃，25min滅菌，冷卻至60℃倒平板備用。
與現有技術相比，本發明具有以下優點：
(1)首次以米曲霉降解葉黃素制備煙用香料，經感官評吸測定，所得香料具有豐富煙香，增加卷煙木甜香的作用。
(2)經由米曲霉菌株ynca9804降解葉黃素得到的煙用香料，具有濃郁木香味，通過gc-ms檢測，結果表明香料中含有β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯及β-環檸檬醛等致香物質成分；將該香料添加到卷煙中進行評吸，結果表明香氣量較為充足，甜韻感豐富，地方性雜氣減少，喉部舒適性增加，余味較為舒適，口腔收斂較強。
(3)本發明原料來源充足；所用培養基簡單，菌株性狀穩定、易于保存、活化和發酵。
(4)生產工藝簡單、操作性、規范性及可控性強，便于實現大規模工業化生產，具有良好的開發應用前景。
保藏生物材料的說明
本發明的菌株，已于2016年11月30日，保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，該中心地址：中國湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山武漢大學內，該菌株分類命名為：米曲霉(aspergillusoryzae)ynca9804，保藏編號cctccno：m2016654。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下通過實施例及試驗數據，對本發明作進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不是對本發明技術方案的限定。
實施例1
(1)將保存于固體斜面的米曲霉ynca9804菌株(cctccm2016654)轉接到液體種子培養基中，搖床上28℃培養24h，轉速為180r/min。
斜面固體培養基：馬鈴薯(去皮)200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph值6.5-6.8。121℃，25min滅菌，冷卻致60℃倒平板備用。
液體種子培養基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5-6.8。裝入250ml錐形瓶，100ml/瓶，121℃，25min滅菌備用。
(2)稱取5g葉黃素，溶于10ml的二氯甲烷中，待葉黃素徹底溶解后加入1gtween-80進行乳化；在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發干，再加入100ml無菌蒸餾水混合均勻，得儲備液待用；
(3)將步驟(1)培養生長米曲霉ynca9804種子液6瓶，按1％(v/v)接入50l發酵罐中進行液體培養，50l種子罐定容30l。葉黃素儲備液的投料量比例為0.1％(w/v)。
培養基：nano32g/l，k2hpo41g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，feso4.7h2o0.01g/l，葡萄糖20g/l，ph值6.5。
(4)培養控制條件：溫度32℃，通氣比1(v/v)，罐壓：0.03mpa，do≥20％，攪拌速率120r/min，發酵時間72h。
(5)發酵完成后過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得發酵煙用香料。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少，改善余味。
實施例2
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為0.05％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度30℃，發酵時間48h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少。
實施例3
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為0.2％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度35℃，發酵時間72h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實施例4
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為0.5％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度38℃，發酵時間72h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實施例5
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為0.5％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度32℃，發酵時間96h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(5)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，木甜香味突出，刺激性減少，改善余味。
實施例6
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為1％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度32℃，發酵時間120h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
實施例7
重復實施例1，有以下不同點：
(3)培養基：葉黃素儲備液的投料比例為0.3％(w/v)。
(4)培養控制條件：溫度32℃，發酵時間72h。
(5)為防止變質，按發酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)專家品吸結果：與未加發酵香料卷煙相比煙香豐富，增加木甜香味，刺激性減少，改善余味。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和變化等，均應包含在本發明的保護范圍之內。