專利名稱：：高產耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌篩選及培養方法
技術領域：
：本發明涉及高產蛋白酶菌株的篩選及培養方法，特別是高產耐高溫蛋白酶蘇云金桿菌的篩選及培養方法。
背景技術：
：蛋白酶是一種重要的酶制劑，廣泛應用于食品、醫藥、洗滌劑、紡織及皮革工業中。耐高溫蛋白酶具備耐熱、耐變性劑、耐有機溶劑等優點，其研究尤為重視。人們已經從77erM/sag"a"cs,feci"usiWg'arj's，6W/bJc)6ussoM"arj.cw，尸jrocociAs/krj'asws等高溫菌中分離到各種類型的高溫蛋白酶。目前高溫蛋白菌產量低，生產成本高。蘇云金桿菌(fe"'Bi/s"wi/^ie"w's，簡稱Bt)是一種非常重要的昆蟲病原細菌，是至今為止最為成功的微生物殺蟲劑。其主要用途作為生物農藥,國內外尚未見到利用Bt生產耐高溫酶的報道。通常發酵優化過程需要的周期較長，工作量大。采用統計數學的方法能夠較快達到優化目標，同吋可建立相關的數學模型，預測最佳值。獲得優化值更具科學性、可靠性與準確性。目前二水平設計的PlackeU-Burman設計與響應面分析法(Responsesurfacemethodology簡稱RSM)是被認為在優化過程中最有效的統計方法。
發明內容本發明的目的篩選高產耐高溫蛋白酶的Bt菌株，采用數學統計學的方法進行該菌株發酵條件優化，獲得最優的培養基與培養條件。1、菌株篩選方法，包括以下步驟初篩在55x:的條件下，利用酪蛋白瓊脂鑒定平板對市場所能購得的提供初篩Bt菌株的菌落瓊脂塊與其初始發酵液分別進行檢測，選取水解酪蛋白形成透明圈較大且水解圈明顯的菌株為初篩菌株；復篩對所述初篩菌株進行發酵驗證，以酪蛋白為底物，采用紫外分光測定法進行酶活測定，選取高酶活的菌株Btl40為高產耐高溫蛋白酶的菌株，其初始發酵水平為263.43U/mL。2、發瞎條侔汰化(1)Btl40形態特征與生理生化特征采用微生物學分析法進一步了解Btl40細胞形態特征與常見生理生化反應特征。表lAf140生理生化特性項目革i主氏染色麥芽糖葡萄糖蔗糖v.p淀粉脲酶七葉靈蛋白水解結果++一++++++++++(2)Plackett-Burman設計篩選重要影響因子通過單因素篩選試驗得到與Btl40產酶相關的培養基與培養條件8個因素。采用Plackett-Burman設計篩選產酶重要影響因子，選用試驗次數N二12的設計，對初始pH、裝量、葡萄糖(％)、酵母粉(％)、黃豆餅粉(％)、KH2P04(%)、MgS04(a/。)和CaCO:,⑨等8個因素進行考察，結果見表2、表3，發現可信度大于80%的幾個因素均為培養基組分。它們對產酶影響順序為黃豆餅粉〉酵母粉〉葡萄糖〉CaC03表2N-12的Plackett-Burman的試驗設計與結果實驗AB(C)DE(F)GH(I).TK酶活(u/mL)1-l1l-l1_1-1-l111678.821_1l1-11-l-1-l11675.33-l-1111-111-l1-1747.8411l_111-l1-1-l一l645.3511-11-l-1-1111一l678.26-l1l1-l11-l1-1一l681.67-l-1-1-l-1-1-1-l-l-l—1612.38-l-l-1111-l11_11701.491-1l-l-1-l111-1]678.210-l1-i_1-l111--111741.31111-111-l1-l-l-li798.3121_1-1-l-111-l111736.4表3各因素的主效應因素F檢驗大于iFl值概率重要性排列A初始pH0.230.66277B裝量(niL/250mLA)0.510.52536D葡萄糖(％)3.580.15493E酵母粉(％)5.740.09622G黃豆備r15.210.029911!KH2P04(%)0.010.93078JMgS04(%)l.恥0.25645KCaC03(%)2.910.18644(3)響應面分析優化培養基組成對三個重要因素，即黃豆餅粉、酵母粉、葡萄糖，采用Box-Behnken的中心組合設計，設計了3因素3水平共15個試驗點，進行響應面分析優化，建立了二次響應面回歸模型并進而尋求最優響應因子水平。回歸方程中回歸系數的估算值見表4，得到擬合二次回歸方程如下Y二759.36+51.33*Xl+7.21*X2—20.98*X3+12.45X1*X1—61.21X2*X2一74.52X3*X3—29.47X1*X2+1.50X2*X3—0.53X1*X3。模型可信度分析見表5。二次響應面回歸模型是顯著(決定系數R2=0.9472)，模型擬合程度很好，說明這3個因素及其二次項能解釋￥變化的94.72%，模型回歸P值二0.0104;擬合不足P值^0.6561，說明模型失擬不顯著，回歸顯著，所以該模型可以用于Bt產酶發酵優化的理論預測。由模型推出最高產酶水平的最佳培養基配方(重量百分比)為黃豆餅粉1.8%、酵母粉0.36%、葡萄糖0.14%、K跳0.25%、MgS04*7H200.035%、CaC030.05%、其余為水。初始pH值為7.0。模型預測值為826.66U/mL，實驗驗證值為837.71U/mL，試驗值與模型計算值相差+l.34%。表4回歸方程中回歸系數的估計值Table6Estimatedvalueofcoefficientintheregressionequation<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表5方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)培養條件優化采用單因素篩選法對Btl40產酶條件進行優化，確定最佳的發酵條件:所述產酶條件包括發酵溫度、裝液量、接種量和發酵時間。培養基裝量35mL/250mL三角瓶，培養溫度31。C，搖瓶轉速為250r/min，接種量為O.75raL(菌懸液濃度7Xl(f個/mL)，初始pH7.0，發酵時間為24h。(5)Btl40蛋白酶酶學特性Btl40蛋白酶最適用作用溫度為55"C，在55'C條件下lh基本不失活，在6(TC條件下lh仍有6(m以上的活力，是典型的耐高溫蛋白酶。3、Btl40發酵條件優化結果采用黃豆餅粉培養基，最佳的產酶配方按重量百分比如下黃豆餅粉l.8%、酵母粉O.36%、葡萄糖0.14%、KH2P040.25%、MgS04-7H200.035%、CaC030.05%，其余為水；最佳的發酵產酶培養條件培養基裝量35mL/250mL三角瓶，培養溫度31。C，搖瓶轉速為250r/min，接種量為O.75mL(菌懸液濃度7X106個/mL)，初始pH7.0,發酵時間為24h。Btl40蛋白酶酶學特性研究表明是一種典型的耐高溫蛋白酶。本發明的優點在于1.首次采用Bt菌株制備耐高溫蛋白酶；2.高溫蛋白酶由于其具備耐熱、耐變性劑、耐有機溶劑等優點，在工業具有更廣泛的用途；3.Btl40生產耐高溫蛋白酶時，不影響發酵結束收集芽孢生產殺蟲劑，使該菌兼具有蛋白酶與殺蟲劑兩種產品的生產能力。以1噸發酵為例除了獲得相應的Bt殺蟲劑外，還獲得6090Kg1萬單位的酶粉。4.采用統計學方法對Bt140產酶過程進行優化，獲得最佳配方與發酵條件，Btl40產酶水平有了顯著的提高，由初篩的263.43U/mL提高到918.56U/mL。具體實施例實施例一一種高產耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌篩選方法，包括以下步驟酪蛋白底物瓊脂鑒定平板制作瓊脂鑒定平板配方(重量百分比)為酪蛋白2%，瓊脂2%，其余為水，pH為7.0-7.2，制備成厚度為3mm的瓊脂平板。初篩l:平板分離34株Bt菌株，待長出稀疏的小菌落后，用打孔器取出長有單菌落的瓊脂小塊，每一菌株取3個瓊脂塊，將34株瓊脂塊置于同一塊的鑒定平板上，共三塊鑒定平板，置于37t:繼續培養24h，根據瓊脂塊周圍形成的蛋白水解圈大，且透明程度高的菌株為高產菌株。初篩2:利用打孔器在酪蛋白底物瓊脂鑒定平板上打出34個1.5mm的大小一置的孔洞，分別在孔洞中加入15nL34株菌株的發酵酶液，將鑒定平板置于55"C的培養箱中24h，重復3塊平板。根據孔洞周圍所形成的蛋白水解圈大，且透明程度高的菌株為高產菌株。結合初篩l與初篩2可以準確獲得34株Bt中耐高溫蛋白酶高產菌4株。復篩對初篩菌株獲得4株Bt菌株進一步進行發酵驗證，并以酪蛋白為底物，采用紫外分光測定法進行酶活測定，獲得高酶活的菌株Bt140，其初始發酵水平為263.43U/raL。實施例二Btl40產酶發酵液制備Btl40發酵液制備，包括菌株選擇、斜面培養、一級種子、斜面培養基為牛肉膏蛋白胨培養基。Btl40斜面培養置于37。C下，培養2d后，保存于4T的冰箱中。從斜面接一環至250mL三角瓶中，培養基裝量為35mL/250mL三角瓶，培養基為牛肉膏蛋白胨，在31。C的條件下，置于250r/min的搖床上，培養15h，獲得一級種子。通過對一級種子的計數，控制發酵的接種量為O.75mL(菌懸液濃度7X106個/mL),發酵培養基配方(重量百分比)為黃豆餅粉1.8%、酵母粉0.36%、葡萄糖0.14%、,040.25%、MgS047H200.035%、CaC030.05%,其余為水。發酵產酶培養條件為培養基裝量35mL/25()mL三角瓶，培養溫度3rC，搖瓶轉速為250r/min，菌懸液濃度為7XKf個/mL，每瓶接種量為O.75mL，初始pH7.0，發酵時間為24h，即獲得BtMO產酶發酵液。實施例三利用Btl40產酶發酵液制備耐高溫蛋白酶和Bt殺蟲劑1、制備Bt殺蟲劑取如實施例一所述的Btl40產酶發酵液1000L，調節pH至5.0，在50r/min攪拌下，按3%的比例加入絮凝劑Al2(S04)3.18H2030kg，沉淀2h后，采用蝶式離心機，離心機轉速為8000r/min，離心操作15-20min，進行菌液分離，獲得濕菌體和去除菌體后的產酶發酵液。收集濕菌體真空干燥8h，粉碎后得Bt殺蟲劑；去除菌體后的產酶發酵液用于制備耐高溫蛋白酶。2、制備食品級耐高溫蛋白酶取去除菌體后的產酶發酵液1000L，采用100目的濾布濾除大顆粒，將過濾液進行超濾濃縮，超濾膜的孔徑為IOOOO道爾頓，濃縮比為1:4，獲得耐高溫蛋白酶的濃縮液。加入70kg固體助劑玉米淀粉進行噴霧干燥。采用離心式噴霧機，空氣進口溫度為8(TC，出口溫度4(TC，最終制備得到10000U/g食品級耐高溫蛋白酶酶粉。3、制備工業級耐高溫蛋白酶酶粉取去除菌體后的產酶發酵液1000L,用鹽酸調節pH至4.0以下，加入硫酸銨使其濃度控制在55-60%，沉淀24h后，傾去上清液，將沉淀通過三足式離心機，在4000r/min的條件下離心20min除去母液，將沉淀置于4(TC條件下真空干燥，烘干后磨成粉制備得到5000U/g工業級耐高溫蛋白酶酶粉。權利要求1、一種高產耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌篩選方法，包括以下步驟(1)初篩在55℃的條件下，利用酪蛋白瓊脂鑒定平板對供初篩Bt菌株的菌落瓊脂塊與其初始發酵液分別進行檢測，選取水解酪蛋白形成透明圈較大且水解圈明顯的菌株為初篩菌株；(2)復篩對所述初篩菌株進行發酵驗證，以酪蛋白為底物，采用紫外分光測定法進行酶活測定，選取高酶活的菌株Bt140為高產耐高溫蛋白酶的菌株。2、一種利用高產耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌制備產酶發酵液的方法，其特征在于(1)采用如權利要求l所述的高產耐高溫蛋白酶的Btl40菌株為生產菌株；(2)采用黃豆餅粉培養基，按重量百分比配方如下黃豆餅粉l.8%、酵母粉O.36%、葡萄糖0.14%、KH2P040.25%、MgS047H200.035%、CaC030.05%，其余為水；(3)發酵產酶培養條件為培養基裝量35mL/250mL三角瓶，培養溫度3rC，搖瓶轉速為250r/min,菌懸液濃度為7X1(^個/mL，每瓶接種量為O.75mL，初始pH7.0，發酵時間為24h。全文摘要一種高產耐高溫蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌篩選及培養方法，采用酪蛋白底物瓊脂鑒定平板初篩與發酵酶活測定復篩的方法獲得高產耐高溫蛋白酶蘇云金芽孢桿菌Bt140；采用Plackett-Burman設計與響應面分析法快速獲得了Bt140最佳的發酵產酶配方與發酵條件，最終搖瓶發酵水平可達918.56U/mL。Bt140生產耐高溫蛋白酶時，不影響發酵結束收集芽孢生產殺蟲劑，使該菌兼具有蛋白酶與殺蟲劑兩種產品的生產能力。以1噸發酵為例，除了獲得相應的Bt殺蟲劑外，還獲得60～90Kg1萬單位的酶粉。文檔編號C12N1/20GK101161811SQ200610069339公開日2008年4月16日申請日期2006年10月12日優先權日2006年10月12日發明者潔余,雄關,吳昌標,張靈玲,張群林,李今煜,莉沙,毅鄭,黃天培,黃必旺,黃志鵬申請人:福建農林大學