專利名稱：一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法
技術領域：
本發明涉及一種降解有機磷農藥海洋微生物的篩選，具體的說是一種快速篩選降解有 機磷農藥海洋微生物的方法。
背景技術：
農業應用的農藥是防治病害、蟲害、草害的有效的植物保護方法之一。農藥以不同的 劑型經過稀釋，以拌種、噴霧或撒施等方式降落在作物上及士壤里。然而，在目前的技術 水平條件下，農藥的利用率僅為20%，而80%或更多的農藥在施用后進入環境中，進入環 境的農藥很容易隨雨水形成的地表徑流而進入河流或近岸海域，形成對水環境的污染。現 有技術中，針對有機磷污染物，人們不斷在在自然界中尋找能夠降解有機磷農藥的微生物 和其產生的活性物質，但絕大多數微生物降解有機磷農藥效率低、微生物的作用極其緩慢， 目前，降解有機磷微生物產品往往集中于陸地土壤微生物，而降解有機磷的海洋微生物產 品還是空白。

發明內容
為了克服傳統技術中的不足，本發明的目的是提供一種操作簡單、結果可靠、效率高的 快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為
(1) 樣品采集
用無菌取樣瓶采集沿海或近外海捕撈漁場的水樣或泥樣，放入20-4(TC的恒溫箱中恒溫
0.5-1.5小時恒溫箱中待用；
(2) 分離篩選
水樣中加入不同濃度的有機磷農藥，搖勻，靜置30min后在營養瓊脂平板上涂布，20-40 'C培養48-72h，從有菌落生長的有機磷農藥濃度最高的平板上挑選不同形態的菌落接種到 營養瓊脂斜面上。
(3) 降解菌的富集培養
將所挑選的耐藥菌分別接種到濃度為300,600,800和1,000 [X 10、V/V)]的含有有機磷 農藥的選擇性培養液中，28'C培養3d，而后在平板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度 的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，28t:培養24h，再以此菌株為試驗菌株，反復重復上述試 驗。選取目前生產中常用的有機磷農藥樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷作為目標農藥。
(4) 降解菌的培養特征及生理生化鑒定-
降解菌的鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(ninthedition)進行。
(5) 對分離篩選的菌種進行性能檢測
a. 菌株對有機磷耐受能力的測定
分別制各甲胺磷含量為400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800 mg/L PSB液體培養基， 接種培養5-7d，觀察記錄其生長情況。
b. 菌株對有機磷的降解率的測定
以目標農藥有機磷作為唯一的碳源，配制含有目標農藥的500mg/L和1 000mg/LPSB 培養液，接種菌液l mL于125mL的培養液中，同時設有不接種菌的兩種濃度的空白對照 和只接種菌而小加農藥的對照，以消除水解和光解等因素引起目標農藥減少的影響，在與 前述條件相同的培養條件下，培養7d取樣用氣相色譜測定細菌對目標農藥的降解率。
c. 菌株降解有機磷農藥降解譜的測定.-
為探討菌株降解有機磷農藥的降解譜，選取目前生產中常用的有機磷農藥樂果、毒死 啤、三唑磷、辛硫磷作為目標農藥，按照b.的方法進行試驗，培養7d取樣用氣相色譜測定 細菌對目標農藥的降解率。
具體實施例方式
為了進一步詳細描述本發明，如下提供了制備本發明的組合物的實施例，然而應當理解， 本發明的范圍不因這些實施例而受到限制。 實施例1
1. 樣品采集
用無菌取樣瓶采集沿海或近外海捕撈漁場的水樣或泥樣，放入20-4(TC的恒溫箱中 恒溫0.5-1.5小時恒溫箱中待用；
2. 分離篩選
水樣中加入不同濃度的有機磷農藥，搖勻，靜置30min后在營養瓊脂平板上涂布， 25-3(TC培養48-72h，從有菌落生長的有機磷農藥濃度最高的平板上挑選不同形態的菌 落接種到營養瓊脂斜面上。選取目前生產中常用的有機磷農藥樂果、毒死啤、三唑磷、 辛硫磷作為目標農藥。
3. 降解菌的富集培養
將所挑選的耐藥菌分別接種到濃度為300、 600、 800和1,000 [X10—、V/V)]的有機 磷農藥(樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷)選擇性培養液中，28。C培養3d，而后在平 板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，28'C培養 24h，再以此菌株為試驗菌株，反復重復上述試驗。
4. 降解菌的培養特征及生理生化鑒定
降解菌的鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(第九版)進行。
5. 對分離篩選的菌種進行性能檢測
5.1菌株對有機磷耐受能力的測定 分別制各甲胺磷含量為400、 800、 1,600、 3，200、 6,400、 12,800 mg/L PSB液體培養基， 接種培養5-7d，觀察記錄其生長情況。 5.2菌株對有機磷的降解率的測定
以目標農藥有機磷作為唯一的碳源，配制含有目標農藥的500mg/L和1 000mg/LPSB 培養液，接種菌液lml于125ml的培養液中，同時設有不接種菌的兩種濃度的空白對照和 只接種菌而小加農藥的對照，以消除水解和光解等因素引起目標農藥減少的影響，在與前 述條件相同的培養條件下，培養7d取樣用氣相色譜測定細菌對目標農藥的降解率。
5.3菌株降解有機磷農藥降解譜的測定 為探討該菌株降解有機磷農藥的降解譜，選取目前生產中常用的有機磷農藥樂果、毒死啤、
三唑磷、辛硫磷作為目標農藥，按照5.2的方法進行試驗，培養7d取樣用氣相色譜測定細
菌對目標農藥的降解率。
權利要求
1.一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法，包括以下步驟(1)樣品采集用無菌取樣瓶采集沿海或近外海捕撈漁場的水樣或泥樣，放入恒溫箱中待用；(2)分離篩選水樣中加入不同濃度的有機磷農藥，搖勻，靜置在營養瓊脂平板上涂布、培養，從有菌落生長的有機磷農藥濃度最高的平板上挑選不同形態的菌落接種到營養瓊脂斜面上；(3)降解菌的富集培養將所挑選的耐藥菌接種到含有有機磷農藥的選擇性培養液中，培養，而后在平板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，培養，再以此菌株為試驗菌株，反復重復上述試驗。
2、 根據權利要求1所述的一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法，其特征在于，其中步驟(1)所述的恒溫條件為20-40。C的恒溫箱中恒溫0.5-1.5小時。
3、 根據權利要求1所述的一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法，其特征在于，其 中步驟(2)所述的有機磷農藥可以為樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷。
4、 根據權利要求1所述的一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法，其特征在于，其中性能檢測是進行下面各項指標的檢測菌株對有機磷耐受能力的測定、菌株對有機磷的降解率的測定和菌株降解有機磷農藥降解譜的測定。
全文摘要
本發明涉及一種快速篩選降解有機磷農藥海洋微生物的方法，包括(1)樣品采集；(2)分離篩選；(3)降解菌的富集培養；(4)降解菌的培養特征及生理生化鑒定；(5)對分離篩選的菌種進行性能檢測。本發明具有如下優點效率高，操作簡單，結果可靠，促進了從海洋微生物中篩選降解有機磷農藥的工作效率。
文檔編號C12N1/00GK101104843SQ20061010129
公開日2008年1月16日 申請日期2006年7月10日 優先權日2006年7月10日
發明者金彬明 申請人:溫州醫學院