基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測(cè)毒死蜱的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

毒死蜱是1965年美國陶氏化學(xué)公司研制成功的一種高效光譜殺蟲劑，商品名稱是樂斯本，它屬于雜環(huán)類有機(jī)磷農(nóng)藥，40年來已成為一種最大噸位的有機(jī)磷農(nóng)藥?，F(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于防治水稻、麥類、蔬菜、花卉等作物的害蟲。毒死蜱是一種高效、中毒、廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑，它的毒性不是很強(qiáng)，但對(duì)人體的皮膚有強(qiáng)烈的刺激作用，進(jìn)入眼中對(duì)眼睛也有一定的損傷。少量毒死蜱在高等動(dòng)物體內(nèi)可以快速降解為無毒物質(zhì)。從作用特性上看毒死蜱是屬于神經(jīng)性毒劑，它的殺毒機(jī)制是通過抑制生物體內(nèi)的神經(jīng)突觸AchE的活性，從而導(dǎo)致大量的AchE沉積下來，中斷神經(jīng)傳導(dǎo)，最終可以導(dǎo)致神經(jīng)麻痹，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致死亡。

目前，國內(nèi)外關(guān)于毒死蜱的檢測(cè)方法主要有：氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法，以及分子印跡技術(shù)。

氣相色譜法能滿足分析要求，但所用儀器通常較為昂貴且復(fù)雜，對(duì)操作人員的儀器操作技能要求比較高，與此同時(shí)樣品準(zhǔn)備耗時(shí)長、成本高；酶聯(lián)免疫法雖然較為快速簡(jiǎn)單，但抗干擾能力差，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物可能存在假陽性誤差，而且抗體的制備難度大，成本高；分子印跡技術(shù)雖然靈敏度高，反應(yīng)速度快，選擇性好，設(shè)備簡(jiǎn)單，但是它對(duì)反應(yīng)條件要求苛刻，所以這項(xiàng)技術(shù)仍然處于實(shí)驗(yàn)室階段，并沒有廣泛應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。因此十分有必要進(jìn)一步研究靈敏簡(jiǎn)便、易于操作、選擇性高且適用于實(shí)際樣品快速檢測(cè)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測(cè)毒死蜱，利用核酸適體的特異性識(shí)別及其與金納米粒子靜電吸附作用的優(yōu)勢(shì)，從而提供一種快速檢測(cè)毒死蜱的方法，達(dá)到快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)毒死蜱的殘留量。

技術(shù)問題：基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測(cè)毒死蜱的方法主要為下述原理：

巰基乙胺修飾的金納米粒子(AuNPs)帶正電性，適配體具有帶負(fù)電的磷酸骨架。分散的金納米粒子溶液呈現(xiàn)酒紅色，當(dāng)一定量的適配體加入到帶正電的金納米粒子溶液中，由于靜電吸附作用，導(dǎo)致金納米粒子發(fā)生團(tuán)聚，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。當(dāng)毒死蜱與毒死蜱適配體結(jié)合后就會(huì)形成適配體復(fù)合體，引起適配體的構(gòu)型發(fā)生變化，破壞適配體與金納米粒子之間的靜電吸附作用，金納米粒子不發(fā)生團(tuán)聚，顏色不改變。據(jù)此，可以對(duì)毒死蜱進(jìn)行定量檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

包括以下步驟：巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成；通過測(cè)定紫外可見吸收光譜觀察金納米粒子、核酸適配體和目標(biāo)物毒死蜱體系的反應(yīng)；利用目標(biāo)物與適配體的特異性結(jié)合檢測(cè)毒死蜱并進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。

(1)巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成

在避光的條件下，將400μL巰基乙胺鹽酸鹽(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌20min，注意避光，然后邊攪拌邊迅速加入新配置的NaBH₄溶液10mL(10mM)，繼續(xù)攪拌30min，最終制得酒紅色溶液，將所得溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液裝入棕色試劑瓶中，在4℃的冰箱中保存，備用。

(2)適配體金納米粒子比色檢測(cè)毒死蜱方法建立

向1.5mL離心管中加入20μL毒死蜱適配體(2nM)然后分別加入1μg/mL不同體積的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入蒸餾水稀釋至500μL體系，使得毒死蜱的終濃度分別為1,5,10,20,40,60ng/mL。漩渦混合8min后，再加入60μL金納米粒子(終濃度為0.077nM)，震蕩均勻，反應(yīng)10min，觀察所得到溶液的顏色，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的紫外可見吸收光譜，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

(3)利用目標(biāo)物與適配體的特異性結(jié)合檢測(cè)毒死蜱

向含有60μL AuNPs和2nM核酸適配體的混合體系中，分別加入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫條件下反應(yīng)8min后，測(cè)定該體系的紫外可見吸收光譜，AuNPs在535nm處的吸收值(A₅₃₅)將隨著毒死蜱濃度的不同而發(fā)生變化。分別以毒死蜱的濃度與A₅₃₅為橫縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

所用的毒死蜱的終濃度依次為：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL。本發(fā)明中，毒死蜱的檢出限為0.83ng/mL，線性范圍為1-110ng/mL。

(4)選擇性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定：

取7個(gè)1.5mL的離心管，編號(hào)為a～g，分別依次加入，a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸適配體和70ng/mL待測(cè)物質(zhì)，待測(cè)物質(zhì)依次有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結(jié)構(gòu)類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯)，測(cè)定體系在400～800nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。

(5)實(shí)際樣品的檢測(cè)：取蘋果進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)

稱取試樣10g(精確到0.01g)于20mL離心管中，加6g無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯，均質(zhì)2min，在5000r/min離心5min，上清液過濾于250mL容量瓶中，殘?jiān)尤?0mL乙酸乙酯再提取一次，過濾，合并濾液于250mL容量瓶中，備用。如權(quán)利要求4所述的方法，加入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立了基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測(cè)毒死蜱的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，能夠快速檢測(cè)毒死蜱，為今后的監(jiān)管提供了方便。

附圖說明

圖1不同體系的紫外可見吸收光譜：a AuNPs；b AuNPs和毒死蜱適配體；c AuNPs、毒死蜱、毒死蜱適配體；d AuNPs和毒死蜱

圖2不同濃度的毒死蜱(1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL)存在時(shí)金納米粒子的紫外可見吸收光譜，插圖為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3體系中加入不同的檢測(cè)物后A₅₃₅的變化：a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸適配體和70ng/mL待測(cè)物質(zhì)，待測(cè)物質(zhì)依次有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結(jié)構(gòu)類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯)

圖4金納米粒子與含有不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液1、5、10、30、50、70、100、150、200、250ng/mg的蘋果提取液體系的紫外可見吸收光譜和工作曲線圖。

具體實(shí)施方式

巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成

材料/試劑：四水合氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)硼氫化鈉(NaBH₄)巰基乙胺鹽酸鹽(CS)購于上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司

方法：實(shí)驗(yàn)所需的所有玻璃器皿用王水浸泡24h，用蒸餾水沖洗，并浸泡24h，烘干備用。巰基乙胺修飾的金納米粒子合成步驟具體如下：在避光的條件下，將400μL巰基乙胺鹽酸鹽(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌20min，注意避光，然后邊攪拌邊迅速加入新配置的NaBH4溶液10mL(10mM)，繼續(xù)攪拌30min，最終制得酒紅色溶液，將所得溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液裝入棕色試劑瓶中，在4℃的冰箱中保存，備用。

結(jié)果：得到酒紅色的巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液

由于金納米粒子溶液的體積會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)體系產(chǎn)生一定的影響，因此需要研究金納米粒子的體積的作用效果。

材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據(jù)文獻(xiàn)合成

方法：取6個(gè)1.5mL的離心管，標(biāo)號(hào)為a～f，向每個(gè)管中加入2nM的毒死蜱適配體，然后再分別加入：40、50、60、70、80、90μL金納米粒子溶液，反應(yīng)完全后，測(cè)定上述溶液的紫外可見吸收光譜，計(jì)算A₅₃₅的下降值。

結(jié)果：隨著金納米粒子溶液濃度的增加，A₅₃₅的下降值會(huì)先增大后降低，當(dāng)加入金納米粒子溶液體積為60μL時(shí)，該值達(dá)到最大，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象最明顯，因此，金納米粒子溶液的最佳體積為60μL。

除此之外，核酸適配體的濃度也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)體系產(chǎn)生一定的影響，因此需要研究適配體濃度的作用效果。材料/試劑：毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成

方法：取6個(gè)1.5mL的離心管，標(biāo)號(hào)為a～f，向每個(gè)管中加入60μL金納米粒子溶液，然后再分別加入：0.2、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0nM毒死蜱適配體，加水補(bǔ)齊至500μL，反應(yīng)一定時(shí)間后，測(cè)定上述溶液的紫外可見吸收光譜，同時(shí)，在另一組離心管中，加入50μL 1μg/mL毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液(終濃度100ng/mL)，向其中加入與上一組相同體積的毒死蜱適配體，渦旋一定時(shí)間使其充分結(jié)合，再加入60μL金納米粒子溶液并加水補(bǔ)齊至500μL，反應(yīng)一定時(shí)間后，測(cè)定紫外可見吸收光譜，將兩次得到的A₅₃₅做差值。

結(jié)果：毒死蜱適配體濃度在2nM以下時(shí)，差值逐漸增大，并在2nM時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)濃度大于2nM時(shí)，差值依然比較大，不過由于適配體濃度過高會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度，因此，適配體的終濃度選為2nM。

除此之外，金納米粒子與毒死蜱適配體反應(yīng)時(shí)間也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生作用效果，因此需要對(duì)其反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據(jù)文獻(xiàn)合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成方法：取一組1.5mL離心管中分別加入60μL金納米粒子溶液和20μL 50nM毒死蜱適配體，加水補(bǔ)至500μL體系，分別反應(yīng)不同的時(shí)間(1-8min)后，測(cè)定其紫外可見吸收光譜。

結(jié)果：分析可知，金納米粒子與毒死蜱適配體最佳反應(yīng)時(shí)間為7min。

除此之外，毒死蜱和毒死蜱適配體反應(yīng)時(shí)間也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生作用效果，因此需要對(duì)其反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據(jù)文獻(xiàn)合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；毒死蜱：購買于西格瑪奧德里奇試劑公司

方法：取一組1.5mL離心管，分別加入20μL毒死蜱適配體，50μL毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)離心管渦旋混合不同的時(shí)間(1-10min)，分別加入金納米粒子溶液60μL，并用水補(bǔ)齊至500μL體系，反應(yīng)7min后測(cè)定其紫外可見吸收光譜。

結(jié)果：分析可知，毒死蜱與毒死蜱適配體的最佳反應(yīng)時(shí)間為8min。

該方法用于毒死蜱檢測(cè)：

材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據(jù)文獻(xiàn)合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；毒死蜱購自西格瑪奧德里奇試劑公司；蘋果購自于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)

方法：

(1)利用適配體金納米粒子比色法檢測(cè)毒死蜱：向含有60μL金納米粒子溶液,2nM核酸適配體的混合體系中，分別加入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫條件下反應(yīng)8min后，測(cè)定該體系的紫外可見吸收光譜，金納米粒子在535nm處的吸光度值將隨著毒死蜱濃度的不同而發(fā)生變化。

(2)所用的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL，通過測(cè)定金納米粒子在535nm處的吸光度值A(chǔ)₅₃₅，根據(jù)A₅₃₅與毒死蜱的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)實(shí)際樣品的檢測(cè)：取蘋果進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)

稱取試樣10g(精確到0.01g)于20mL離心管中，加6g無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯，均質(zhì)2min，在5000r/min離心5min，上清液過濾于250mL容量瓶中，殘?jiān)尤?0mL乙酸乙酯再提取一次，過濾，合并濾液于250mL容量瓶中，備用。如權(quán)利要求4所述的方法，加入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

(4)實(shí)驗(yàn)體系的驗(yàn)證：

選擇性實(shí)驗(yàn)：

取8個(gè)1.5mL的離心管，編號(hào)為a～h，分別依次加入，a～h管(60μL金納米粒子溶液,2nM核酸適配體,70ng/mL待測(cè)物質(zhì),待測(cè)物質(zhì)依次為有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結(jié)構(gòu)類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯和毒死蜱),測(cè)定上述溶液的在535nm處的吸光度值A(chǔ)₅₃₅。

結(jié)果：分別以毒死蜱的濃度和A₅₃₅為橫縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢出限為0.83ng/mL，線性范圍為1-110ng/mL。

本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)毒死蜱的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見下表

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學(xué)

<120> 基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測(cè)毒死蜱

<160> 1

<210> 1

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgccacgt ccgcaagctt agggttacgc ctgcagcgat tcttgatcgc gctgctggta

atccttcttt aagcttggca cccgcatcgt 90