專利名稱：一種凝血酶的提取分離方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，更具體地說涉及一種凝血酶的提取分離方法。
背景技術：
凝血酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，它催化纖維蛋白原中血纖維肽A和B的斷裂，使之變為不溶性的血纖維蛋白，從而促使了血液的凝固。國內外對其作了大量的研究，并已作為一種新型速效局部止血藥，應用于臨床。一般提取分離方法是乙醇、丙酮和乙醚等的有機溶劑法，檸檬酸鋇吸附法和氫氧化鎂吸附法等。它們將其制備成凝血酶或凝血酶原的粗制品，然后再通過離子交換層析、凝膠層析和親和層析等方法將其純化、凍干獲得了純度較高的凝血酶，但是由于其制備工藝流程復雜，技術要求高，成本昂貴，不易廣泛使用。

發明內容
本發明的目的是提供一種凝血酶的提取分離方法，采用CaCl2激活凝血酶原成為凝血酶的同時加入(NH4)2SO4，使其生成CaSO4沉淀吸附凝血酶，以簡化其生產工藝流程，縮短后續純化的周期和降低成本。
本發明有下述順序的步驟a、以成牛血液或豬血液為原料，在此血液中加入3.8％的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，攪拌均勻，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得血漿；b、將獲得的血漿用去離子水稀釋9～10倍(V/V)，用2mol/L醋酸調節pH值為5.30，在4～5℃下，靜置10～12小時，再用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，獲得凝血酶原沉淀；c、將獲得的凝血酶原沉淀，用含1.5％～2％CaCl2(W/V)的去離子水溶介凝血酶原，在4～5℃下放置1.5小時，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物，獲得上清液；d、將獲得的上清液放在37℃水浴中攪拌，按體積加入10～15％(NH4)2SO4(W/V)，生成CaSO4沉淀吸附溶液中的凝血酶，靜置30分鐘左右，用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，收集沉淀物；e、將收集的沉淀物用pH值為7.30的0.9％(W/V)生理鹽水洗脫，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物獲得凝血酶溶液；f、將獲得的凝血酶溶液用超濾器對其進行濃縮，冷凍干燥，獲得白色的凝血酶凍干粉。
本發明的優點是提取方法簡便易行，易于工業化生產。在用CaCl2激活凝血酶原成為凝血酶的同時，加入(NH4)2SO4使其生成CaSO4沉淀吸附凝血酶，不通過離子交換層析和親和層析等復雜步驟，而直接經過洗脫，超濾和凍干步驟，這樣節省了成本和提取時間，由原來約需的7天時間縮短到2～3天。每立升血液可獲得凍干凝血酶粉0.7g左右，其比活力約為100U/mg(蛋白)。
具體實施例方式
實施例1本發明有下述順序步驟a、首先取牛血液1000mL為原料，在此血液中加入3.8％的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，攪拌均勻，在4℃以下用4000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得血漿。
b、用去離子水將獲得的血漿稀釋9倍(V/V)，用2mol/L醋酸調節pH值為5.30，在4℃下，靜置10小時，再用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，獲得凝血酶原沉淀。
c、將獲得的凝血酶原沉淀，用含1.5％CaCl2(W/V)的去離子水300毫升溶介凝血酶原，在4℃下放置1.5小時，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物，獲得上清液。
d、將獲得的上清液置于37℃水浴中攪拌，在攪拌的同時，緩慢地按體積加入10％的(NH4)2SO4(W/V)，使其與Ca++起化學反應，生成CaSO4沉淀 ，吸附溶液中的凝血酶，靜置30分鐘左右，用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，收集沉淀物。
e、將收集的沉淀物用100毫升pH值為7.30的0.9％生理鹽水(W/V)洗脫，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物獲得凝血酶溶液。
f、將獲得的凝血酶溶液用超濾器對其進行濃縮，并去掉Ca++，NH+4離子，部分雜蛋白和雜菌等。冷凍干燥，就可獲得白色的凝血酶凍干粉。
上述的CaCl2和(NH4)2SO4的順序必須先加入CaCl2激活凝血酶原，然后加入(NH4)2SO4使其生成CaSO4沉淀才能吸附凝血酶。
實施例2本發明有下述順序步驟a、首先取牛血液1000mL為原料，在此血液中加入3.8％的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，攪拌均勻，在5℃以下用4000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得血漿。
b、用去離子水將獲得的血漿稀釋10倍(V/V)，用2mol/L醋酸調節pH值為5.30，在5℃下，靜置12小時，再用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，獲得凝血酶原沉淀。
c、將獲得的凝血酶原沉淀，用含2.0％CaCl2(W/V)的去離子水300毫升溶介凝血酶原，在5℃下放置1.5小時，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物，獲得上清液。
d、將獲得的上清液置于37℃水浴中攪拌，在攪拌的同時，緩慢地按體積加入15％的(NH4)2SO4(W/V)，使其與Ca++起化學反應，生成CaSO4沉淀 ，吸附溶液中的凝血酶，靜置30分鐘左右，用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，收集沉淀物。
e、將收集的沉淀物用100毫升pH值為7.30的0.9％生理鹽水(W/V)洗脫，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物獲得凝血酶溶液。
f、將獲得的凝血酶溶液用超濾器對其進行濃縮，并去掉Ca++，NH+4離子，部分雜蛋白和雜菌等。冷凍干燥，就可獲得白色的凝血酶凍干粉。
實施例3本發明有下述順序步驟a、首先取牛血液1000mL為原料，在此血液中加入3.8％的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，攪拌均勻，在4℃以下用4000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得血漿。
b、用去離子水將獲得的血漿稀釋9倍(V/V)，用2mol/L醋酸調節pH值為5.30，在4℃下，靜置11小時，再用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，獲得凝血酶原沉淀。
c、將獲得的凝血酶原沉淀，用含1.8％CaCl2(W/V)的去離子水300毫升溶介凝血酶原，在4℃下放置1.5小時，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物，獲得上清液。
d、將獲得的上清液置于37℃水浴中攪拌，在攪拌的同時，緩慢地按體積加入13％的(NH4)2SO4(W/V)，使其與Ca++起化學反應，生成CaSO4沉淀 ，吸附溶液中的凝血酶，靜置30分鐘左右，用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，收集沉淀物。
e、將收集的沉淀物用100毫升pH值為7.30的0.9％生理鹽水(W/V)洗脫，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物獲得凝血酶溶液。
f、將獲得的凝血酶溶液用超濾器對其進行濃縮，并去掉Ca++，NH+4離子，部分雜蛋白和雜菌等。冷凍干燥，就可獲得白色的凝血酶凍干粉。
實施例4取豬血液1000mL為原料，該實施例的方法與實施例1相同，所不同的是原料為豬血，最后也獲得白色的凝血酶凍干粉。
實施例5取豬血液1000mL為原料，該實施例的方法與實施例2相同，所不同的是原料為豬血，最后也獲得白色的凝血酶凍干粉。
最后冷凍干燥所得到的凝血酶是一種白色或類白色的凍干粉末，溶于水，水溶液澄清透明，但在室溫下極易失活。凍干粉貯存在4℃左右較穩定。
權利要求
1.一種凝血酶的提取分離方法，該方法有下述順序的步驟a、以成牛血液或豬血液為原料，在此血液中加入3.8％的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，攪拌均勻，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得血漿；b、將獲得的血漿用去離子水稀釋9～10倍(V/V)，用2mol/L醋酸調節pH值為5.30，在4～5℃下，靜置10～12小時，再用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，獲得凝血酶原沉淀；c、將獲得的凝血酶原沉淀，用含1.5％～2.0％CaCl2(W/V)的去離子水溶介凝血酶原，在4～5℃下放置1.5小時，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物，獲得上清液；d、將獲得的上清液放在37℃水浴中攪拌，按體積加入10～15％(NH4)2SO4(W/V)，生成CaSO4沉淀吸附溶液中的凝血酶，靜置30分鐘，用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去上清液，收集沉淀物；e、將收集的沉淀物用pH值為7.30的0.9％生理鹽水(W/V)洗脫，然后用4000轉/分鐘，離心20分鐘，沉降后棄去沉淀物獲得凝血酶溶液；f、將獲得的凝血酶溶液用超濾器對其進行濃縮，冷凍干燥，獲得白色的凝血酶凍干粉。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術領域，更具體地說涉及一種凝血酶的提取分離方法。本發明是采用CaCl
文檔編號C12N9/74GK101067132SQ20061010494
公開日2007年11月7日 申請日期2006年11月17日 優先權日2006年11月17日
發明者馬忠仁, 印明善, 馮玉萍, 李明生 申請人:馬忠仁, 印明善