專利名稱：一種重組酵母Pp420D生產漆酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種工業用酶制劑的制備方法，特別涉及以酵母基因工程菌高密度發酵法制備工業用酶制劑的方法，確切地說是一種重組酵母Pp420D生產漆酶的方法。
背景技術：
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物氧化，同時伴隨有分子氧還原成水。漆酶廣泛存在于高等真菌(特別是擔子菌)中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、食品風味改良、飼料營養改善、人工合成染料脫色、紡織纖維軟化細化、新型藥物開發、生物傳感器制造及新型能源開發等領域具有潛在重要應用價值[洪宇植，肖亞中，房偉等(2005)Trametes sp.AH28-2漆酶A的誘導合成及其基因5′-端調控區的克隆與分析.生物工程學報21547-552；Xiao YZ，Hong YZ，Li JF et al(2006)Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp.AH28-2 and analyses of their differentialexpression.Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-005-0188-2]，近年來成為國際酶工程學和環境科學交叉領域研究的一個熱點。
真菌漆酶的產業化應用需要大量廉價的酶制劑。然而，多數野生真菌的漆酶產量普遍低下，且液態發酵生產過程通常需要芳香類化合物誘導。毒性誘導物的使用使得發酵液凈化處理難度大，易造成環境污染，酶的生產成本高。
重組表達是現代酶制劑和稀有蛋白生產普遍采用的生物技術。有一些漆酶同工酶成功獲得異源活性表達，宿主菌主要為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryze)等，表1概括了近年來國際上漆酶重組表達的情況。在這些研究中，多數重組漆酶的得率較低(一般低于10×104U/L)，或者發酵周期太長，尚難以滿足工業應用的需要。
表1漆酶重組表達情況

*檢測底物為愈創木酚，其余的為ABTS(2，2′-連氮基-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])。

發明內容
本發明使用的基因工程菌株酵母Pp420D(Pichia pastoris Pp420D)由申請人自主構建。系統研究了漆酶發酵生產的工藝，包括發酵培養基配制、滅菌、接種、種液制備和發酵培養以及后處理。所述的發酵培養就是將制備的種液接種在經滅菌的pH4.0～7.0的發酵培養基中，于25～31℃條件下培養20～30小時，維持溶氧25～35％，然后按每升發酵培養基每小時添加12～25mL營養液的速度流加甲醇營養液，于18～28℃條件下繼續培養7～10天后進行后處理；所述的培養基為每升水中含30～50g甘油、10～25g K2SO4、10～20gMgSO4·7H2O、3～5g KOH、0.5～1.5g CaSO4、20～35mL 85％的H3PO4；所述的甲醇營養液為每升甲醇中含1.0～1.5vt％(體積百分比，下同)的微量元素母液，微量元素母液為每升水中含40～80g FeSO4·7H2O、15～30g ZnCl2、3～9g CuSO4·5H2O、2～4g MgSO4·7H2O、0.3～0.6gCoCl2、0.1～0.4g生物素、0.1～0.3g Na2MoO4、0.01～0.03g H3BO3、0.06～0.1g NaI、3～7mL濃H2SO4。
在發酵培養過程中流加甲醇營養液時，優選每升發酵培養基每小時添加16～20mL營養液的流加速度。
發酵培養基優選每升水中含40g甘油、18g K2SO4、15g MgSO4·7H2O、4g KOH、1gCaSO4、27mL 85％的H3PO4。
甲醇營養液優選每升甲醇中含1.2vt％的微量元素母液。
微量元素母液優選每升水中含65g FeSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2gNa2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL濃H2SO4。
所述后處理是指發酵培養結束后漆酶的分離與純化。
過濾分離得到的發酵液即是漆酶粗制劑。漆酶產量高達2.0×105U/L(ABTS法)。粗酶制劑加水稀釋后可直接用于紙漿漂白、染料脫色、纖維軟化、飼料加工等，也可以濃縮、凍干后貯存。分離得到的菌體可加工蛋白飼料。
當用于食品、飲料或生物傳感器時應對漆酶粗制劑進行純化。純化過程在4～10℃條件下進行，首先將漆酶粗制劑濃縮，然后溶于緩沖溶液中，離心分離后上清液用離子交換樹脂純化。
利用重組酵母Pp420D生產漆酶成本低廉，發酵工藝成熟，能進行大規模生產。且在漆酶生產過程中無需毒性芳香化合物誘導，發酵液后處理簡單，對環境無毒害作用。
漆酶生產周期短、產量高，漆酶酶活在2.0×105U/L(ABTS法)以上。
由申請人自主構建的漆酶生產菌株重組酵母Pp420D(Pichia pastoris Pp420D，分類名畢赤酶母)已于2006年04月04日送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNOM206031。
具體實施例方式
(一)、培養基制備1、種子培養基(1L)13.4g酵母氮素(YNB，無氨基酸)、10g甘油、0.4mg生物素。過濾除菌。
2、發酵培養基(1L)40g甘油、18.2g K2SO4、14.9g MgSO4·7H2O、4.1g KOH、0.93gCaSO4、26.7mL H3PO4(85％)。121℃高溫滅菌20min，或者過濾除菌(孔徑0.45μm)。
3、微量元素母液(1L)65g FeSO4·7H2O、20g ZnCl2、6.0g CuSO4·5H2O、3.0gMgSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2g Na2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL濃H2SO4。過濾除菌。
4、甲醇營養液在1L甲醇中加入1.2vt％的無菌的微量元素母液。
(二)、種液制備接種酵母Pp420D到已滅菌的種子培養基中，25～31℃、150～300r/min培養16～24小時，至菌懸液在600nm處的光吸收OD600＝2～10。酶活測定方法參考文獻[Liu W，Chao Y，Liu S et al(2003)Molecular cloning and characterization of laccase gene from the basidiomycete Fome lingosus andexpression in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol 63174-181]。
(三)、發酵產酶1、將種液按5～15％體積分數接種于已滅菌的發酵培養基中，25～31℃培養，流加氨水維持pH4.0～7.0，自動調節轉速使溶氧維持在20～35％。
2、20～30小時后，按每升發酵培養基每小時添加15～25mL營養液的速度流加甲醇營養液，同時調節溫度至18～28℃，維持溶氧30％繼續發酵7～10天，當菌體光密度OD600達500以上、漆酶酶活超過2.0×105U/L(ABTS法)時，發酵培養結束。
(四)、酶制劑制備1、酶活力達到高峰時下罐并收集發酵液，十層紗布過濾(或4000～10000×g離心10～20min)除去菌體，即得到漆酶粗制劑(可根據需要超濾濃縮或加水稀釋，用于紙漿漂白、工業染料脫色、廢水處理、纖維軟化、飼料加工等領域)。菌體可加工成蛋白類飼料。
2、粗酶制劑依次按下述步驟可獲得純酶，所有操作在4～10℃進行①粗制劑超濾濃縮10～50倍，在10mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH8.0)中透析3～6h，然后10000×g離心10min。②上清液上預先用透析液平衡的DEAE-Sepharose FF離子交換柱，并用0.3mol/L的硫酸銨進行線性洗脫，活性組分用滅菌水(或去離子水)稀釋并超濾脫鹽，即可獲得純酶制劑(純酶制劑除了可用于上述粗酶的應用領域外，還能用于食品和飲料工業、生物傳感器等)。
權利要求
1.一種重組酵母Pp420D生產漆酶的方法，包括培養基配制、滅菌、接種、種液制備和發酵培養以及后處理，其特征在于所述的發酵培養就是將制備的種液接種在經滅菌的pH4.0～7.0的發酵培養基中，于25～31℃條件下培養20～30小時，維持溶氧25～35％，然后按每升發酵培養基每小時添加12～25mL營養液的速度流加甲醇營養液，于18～28℃條件下繼續培養7～10天后進行后處理；所述的發酵培養基為每升水中含30～50g甘油、10～25g K2SO4、10～20g MgSO4·7H2O、3～5g KOH、0.5～1.5g CaSO4、20～35mL 85％的H3PO4；所述的甲醇營養液為每升甲醇中含1.0～1.5vt％的微量元素母液，微量元素母液為每升水中含40～80g FeSO4·7H2O、15～30g ZnCl2、3～9g CuSO4·5H2O、2～4g MgSO4·7H2O、0.3～0.6gCoCl2、0.1～0.4g生物素、0.1～0.3g Na2MoO4、0.01～0.03g H3BO3、0.06～0.1g NaI、3～7mL濃H2SO4。
2.根據權利要求1所述的生產漆酶的方法，其特征在于所述的發酵培養基為每升水中含40g甘油、18g K2SO4、15g MgSO4·7H2O、4g KOH、1g CaSO4、27mL 85％的H3PO4。
3.根據權利要求1或2所述的生產漆酶的方法，其特征在于按每升發酵培養基每小時添加16～20mL營養液的速度流加甲醇營養液。
4.根據權利要求3所述的生產漆酶的方法，其特征在于所述的甲醇營養液為每升甲醇中含1.2vt％的微量元素母液。
5.根據權利要求1或4所述的漆酶的方法，其特征在于所述的微量元素母液為每升水中含65g FeSO4·7H2O、20g ZnCl2、6g CuSO4·5H2O、3g MgSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2g Na2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL濃H2SO4。
全文摘要
一種重組酵母Pp420D生產漆酶的方法，由申請人自主構建的基因工程菌株酵母Pp420D制備種液后接種在培養基上于25～31℃條件培養20～30小時，維持溶氧25～35％，然后按每升發酵培養基每小時添加12～25mL營養液的速度流加甲醇營養液，于18～28℃條件下繼續培養7～10天后過濾分離，發酵液即是漆酶粗制劑，添酶酶活超過2.0×10
文檔編號C12N9/02GK1952111SQ200610147190
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月9日 優先權日2006年4月19日
發明者肖亞中, 洪宇植, 周宏敏, 李劍鳳 申請人:安徽大學