專利名稱：南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物技術領域的核苷酸序列，特別是一種南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列。
背景技術：
隨著世界范圍內能源短缺和環境保護的需要，生物柴油(即脂肪酸單酯)可作為石油燃料的理想替代物，是一種清潔可再生的生物能源，屬于環境友好型綠色燃料，具有深遠的經濟效益與社會效益，其應用已經成為世界關注和研究的熱點。脂肪酶是甘油酯水解酶(EC3.1.1.3)，能夠將甘油三酯水解成為脂肪酸和甘油，也能夠催化動植物及廢棄物油脂進行?；D移反應，生成脂肪酸單酯，即生物柴油。在用生物酶法制備生物柴油的產業化進程中，高效且穩定的脂肪酶是降低成本、使之實現產業化的關鍵所在。在眾多脂肪酶中，CALB(Candida antarcticalipase B，南極假絲酵母脂肪酶B)對非水溶性的酰基轉移反應具有很強的催化活性，盡管現有的很多研究表明將CALB進行固定化或全細胞進行生物催化確實在一定程度上能提高酶的催化效率，但其催化效率并沒有達到理想的可以產業化的水平，所以尋求高效、穩定的脂肪酶成了目前研究的熱點，也是目前生物柴油研究所面臨的一個瓶頸。目前從理論上尋求高效穩定脂肪酶的方法有三種1)通過化學修飾提高脂肪酶的活性，但該方法對需要修飾的目標氨基酸不能做到特異的修飾。2)遵訓酶自身進化的規律來尋求更好的酶的方法隨機突變和DNA改組，能夠構建出多樣化的文庫，由于該方法需要通過表達和高通量的篩選來獲得具有特性的突變酶，存在繁重的工作量和較低的效率的問題。3)通過基于酶的結構與功能的關系的定點突變方法改變酶的活性和提高酶的穩定性，該方法具有簡單高效的特點。
始于1994年，學術界開始研究CALB的氨基酸序列和蛋白質三維空間結構(Structure.1994，2293-308)，研究提供了CALB完整編碼區的氨基酸序列及其信號肽序列，并且與其它脂肪酶的氨基酸序列同源性的比較表明CALB與其它脂肪酶沒有明顯的同源性。盡管對CALB進行了定向進化(Protein Engineering，Design and Selection，2004，17133-140)(《蛋白質工程、設計和選擇》雜志)，在一定程度上提高了CALB的水解活性和熱穩定性，但是尚未發現與本發明主題的酰基轉移活性有密切聯系文獻的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，本發明利用基因工程的辦法，將該基因在畢赤酵母中實現高效表達，以提高表達脂肪酶的含量和酰基轉移活力，從而間接降低發酵的成本。
本發明是通過以下技術方案實現的本發明按照畢赤酵母偏愛密碼子結構，通過化學方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了酰基轉移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
所述的編碼具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。所述的MuCALB1，是指南極假絲酵母脂肪酶氨基酸序列多肽的三個突變氨基酸位點分別是Va1210Ile、Ala281 Glu、Asn292 Tyr，是突變的CALB的氨基酸序列多肽。
根據所述的突變的CALB的氨基酸序列多肽，按照畢赤酵母偏愛密碼子的優先結構，設計并通過亞磷酸三酯法人工合成了CALB基因。這種體外使用核酸自動合成儀合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平上有三個位點不同、但具有相同功能和不同催化能力的核苷酸序列。
所述的中度嚴謹條件下，指核苷酸序列之間能在0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，pH7.0的2×SSC和0.1％SDS的條件下。
所述的化學方法，指亞磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
所述的人工合成，指在體外進行的、使用核酸自動合成儀合成核苷酸序列的方法。
所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
本發明的突變南極假絲酵母脂肪酶基因按如下畢赤酵母偏愛密碼子的優先結構設計見表1

表1用人工合成的方法獲得MuCALB1基因核苷酸編碼序列后，就可以用重組法來大批量獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
用如下在畢赤酵母中產生和表達的方法能夠獲得所述的MuCALB1基因，其方法步驟如下(1)將按畢赤酵母偏愛密碼子設計人工合成的編碼MuCALB1蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成突變南極假絲酵母脂肪酶基因在表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
本發明可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒、粘粒等。在生產本發明的脂肪酶多肽時，可以將脂肪酶編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成脂肪酶蛋白表達載體。
本發明所說“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
(2)將步驟(1)中的表達載體電擊轉入畢赤酵母，在28-30℃條件下，在抗生素平板上培養2-4天，獲得含有MuCALB1蛋白基因的重組細胞。
(3)再生重組細胞，獲得表達MuCALB1蛋白基因的重組酵母菌株。
所述的MuCALB1蛋白基因，指編碼具有與南極假絲酵母脂肪酶催化性質相同、催化酰基轉移活性提高的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-957位核苷酸序列。該術語還指能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列的同源性至少85％，較佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少98％的核苷酸序列。
本發明的“三個氨基酸位點的變異”指與SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，氨基酸序列多肽的三個位點Ile210、Glu281、Tyr292，更佳地有4個，較佳地至多3個，更佳地至多1個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發明根據南極假絲酵母的三維空間結構，設計了三個氨基酸位點的突變，并按照畢赤酵母偏愛密碼子的優先結構，人工合成了具有與野生型南極假絲酵母分泌的具有三個重要氨基酸位點突變的脂肪酶基因，并利用基因工程的辦法，使之在畢赤酵母中高度表達，氣相色譜測定表達脂肪酶的酰基轉移活力，提高了脂肪酶的表達量和酰基轉移活力，從而降低了工業發酵的成本，在工業上具有廣闊的產業化前景。
本發明根據南極假絲酵母脂肪酶CALB蛋白質的三維結構，設計了多個氨基酸位點的突變及不同突變位點的組合，實驗結果證明其中的一個有三個氨基酸位點突變的蛋白質的酰基轉移活力提高，然后按畢赤酵母偏愛密碼子對照表設計合成了該突變氨基酸的南極假絲酵母脂肪酶(MuCALB1)基因，全長為957bp，即為開放閱讀框，詳細序列見SEQ ID NO.1。據此推導出，除了一個終止密碼子外，共編碼318個氨基酸殘基，分子量為33.6KD，等電點(pI)為5.26，詳細序列見SEQ ID NO.2。
按畢赤酵母偏愛密碼子設計人工合成的MuCALB1基因序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與野生型南極假絲酵母CALB具有一定的同源性。在核苷酸水平上，它與野生型南極假絲酵母脂肪酶CALB的核苷酸序列(GenBankAccession No.Z30645)的全編碼序列具有一定的同源性，其中同源性較高的部分見同源比較(GAP)圖表2(相同的核苷酸在兩個序列之間用豎線符標出)在氨基酸水平上，它與野生型南極假絲酵母CALB(GenPept Accession No.P41365)氨基酸殘基有一定的相似性，見氨基酸序列同源比較(FASTA)圖表3(相同的核苷酸在兩個序列之間用豎線符標出)由此可見，設計合成的MuCALB1與野生型南極假絲酵母脂肪酶CALB在蛋白水平上存在較高的同源性，可以認為兩者在功能上也有很高相似性。
表278％identity in 281nt overlapQuery 133 ggtccacaatctttcgactctaactggattccattgtctactcaattgggttacactcca 192|||||||| || |||||||| |||||||| || | || || || ||||||||||| ||Sbjct 205 ggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccc 264Query 193 tgttggatttctccaccacctttcatgttgaacgacactcaagttaacactgaatacatg 252|| ||||| || || || || |||||| | |||||||| || || ||||| || ||||||Sbjct 265 tgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatg324Query 253 gttaacgctattactgctttgtacgctggttctggtaacaacaagttgccagttttgact312|| ||||| || || || | ||||||||||| || ||||||||| | || || | ||Sbjct 325 gtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacc384Query 313 tggtctcaaggtggtttggttgctcaatggggtttgactttcttcccatctattagatct372||||| || |||||| ||||||| || |||||| |||| |||||||| ||| || ||Sbjct 385 tggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtcc444Query 373 aaggttgatagattgatggcttttgctccagactacaaggg 413||||| ||| || | ||||| ||||| || |||||||||||Sbjct 445 aaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaaggg 485
Query按畢赤酵母偏愛密碼子設計人工合成和突變的MuCALB1基因的核酸序列sbjct南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的核酸序列(Z30645)表2按畢赤酵母偏愛密碼子設計人工合成的MuCALB1與野生型南極假絲酵母CALB的核苷酸序列同源比較(GAP)。(相同的核苷酸在兩個序列之間用豎線符標出)表398％identity in 317aa overlapQuery 2LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 61LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGSbjct 26 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 85Query 62 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 121YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSSbjct 86 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 145Query 122 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 181IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTSbjct 146 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 205Query 182 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNIQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 241NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKN+QAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSASbjct 206 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 265Query 242 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPEAAAIVAGPKQYCEPDLMPY 301LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAP AAAIVAGPKQ CEPDLMPYSbjct 266 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 325Query 302 ARPFAVGRRTCSGIVTP 318ARPFAVG+RTCSGIVTPSbjct 326 ARPFAVGKRTCSGIVTP 342Query按畢赤酵母密碼子偏愛設計人工合成和突變的MuCALB1的氨基酸序列Sbjct南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列(P41365)表3按畢赤酵母偏愛密碼子設計的MuCALB1與野生型南極假絲酵母CALB的氨基酸序列同源比較(FASTA)。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
具體實施例方式
為更好地理解本發明的技術方案，以下通過具體的實施例來進一步詳細說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1MuCALB1基因在畢赤酵母中的產生1.在保證閱讀框正確的前提下，將含有合成基因(MuCALB1)的pPICZαA質粒載體的大腸桿菌，接種到含Zeocin抗生素的LB培養基中。
2.在37℃的恒溫搖床上培養過夜，過夜的細菌按照分子克隆所提供的方法抽提質粒。
3.再采用電擊法(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)將其轉入畢赤酵母(如GSl15，或KM71)。
4.利用PCR方法分析確認畢赤酵母基因組中整合了目的基因MuCALB1。
實施例2MuCALB1基因在畢赤酵母細胞中的誘導表達1.將實施例1所獲得的含有MuCALB1基因的重組酵母細胞用無菌牙簽挑取，接種于25mlBMGY培養基中，28℃，250rpm振蕩培養至光密度值OD600＝2-6(一般需要16-18小時)，使細胞處于對數生長期。
2.培養細胞在室溫下1500-3000g離心5min，棄上清。
3.菌體用BMMY培養基懸浮，使菌液的OD600＝1.0，菌液在28℃，250rpm繼續振蕩培養，每隔24小時加入純甲醇至終濃度是0.5％，以補充揮發的甲醇來保證正常誘導目的基因的表達。
4.按照時間點(0，6，12，24，48，72，96小時)分別取出1ml培養液，測定OD600。
5.各時間點取樣在室溫下12000rpm離心2-3分鐘，測定上清水解對硝基苯酚葵酸酯的活力取4μl表達上清加至對硝基苯酚酯測定脂肪酶活反應體系含192μl 1M TrisCl，pH8.0，4μl 25mM對硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)，混勻室溫反應10min，加100μl無水乙醇終止反應，反應生成的對硝基苯酚是黃色物質，從而確定上清中表達脂肪酶。同時終止反應后，測光吸收A405nm，根據對硝基苯酚標準濃度的光吸收A405nm曲線計算反應體系生成的對硝基苯酚，再計算樣品每分鐘分解硝基苯酚葵酸酯產生對硝基苯酚的μg數，即酶活力單位(U)。根據OD600和水解酶活力(U)繪制重組脂肪酶酵母菌的生長曲線。結果表明重組脂肪酶酵母菌在誘導表達48小時后，酶活力達到最高1.5×103U/ml，光密度值OD600是10.8。
6.菌株的擴大培養根據生長曲線，大量發酵重組酵母以制備脂肪酶。
7.發酵培養液在4℃，1500-3000g離心5min，取上清，在上清中加入4倍體積的預冷丙酮，在低溫攪拌20min，然后4℃，9000g離心20min，棄上清，濃縮的蛋白在冷凍干燥器中進行干燥，將干粉置于-20℃保存備用。
實施例3MuCALB1誘導表達產物的鑒定1.將實施例2中獲得的濃縮脂肪酶進行SDS-PAGE電泳分析，初步確定了在培養液中有目的蛋白的表達。
2.將實施例2中獲得的濃縮脂肪酶進行催化?；D移活力實驗，利用氣相色譜測定轉化率。
3.所述的催化酯基轉移活力實驗的方法體系如下在0.339g的大豆油底物中，加入1/10質量的濃縮脂肪酶催化劑，加入3.6ml的有機試劑無水正庚烷，再加入48.5ul的無水甲醇(分三次加，時間間隔5小時)，在55℃，200rpm的恒溫搖床下反應24小時，用氣相色譜測定?；D移活力。同時，以野生型南極假絲酵母脂肪酶CALB作為對照實驗。
4.氣相色譜測定酯基轉移活力的方法如下取?；D移反應產物500ul于12000rpm離心10min，取292.5ul上清，加入7.5ul40mM的標品十七烷酸甲酯，充分混勻后進樣。色譜柱是HP-5柱，柱溫320℃，氮氣流速3.0 mL/min，進樣量3μL，靈敏度為AUFS＝1.0。根據色譜峰面積計算轉化率來確定酰基轉移酶的活力。轉化率計算公式轉化率＝各脂肪酸甲酯峰面積/(97.5×十七烷酸甲酯峰面積×3)。
5.測定結果表明野生型CALB對大豆油的轉化率大小是9.8％，而突變型MuCALB1的轉化率則達到30.2％，突變型MuCALB1的轉化率是野生型CALB的3.08倍，酰基轉移活力的提高對解決酶法制備生物柴油中轉化率低的問題具有重要意義。
本發明涉及的序列和記號分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大學<120>南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列<140>
<141>2006-11-21<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>957<212>DNA<213>人工合成<400>11 atgttgcctt ctggttctga ccctgctttt tctcaaccaa agtctgtttt ggatgctggt61 ttgacttgtc aaggtgcttc tccatcttct gtttctaaac caattttgtt ggttccaggt121actggtacta ctggtccaca atctttcgac tctaactgga ttccattgtc tactcaattg181ggttacactc catgttggat ttctccacca cctttcatgt tgaacgacac tcaagttaac241actgaataca tggttaacgc tattactgct ttgtacgctg gttctggtaa caacaagttg301ccagttttga cttggtctca aggtggtttg gttgctcaat ggggtttgac tttcttccca361tctattagat ctaaggttga tagattgatg gcttttgctc cagactacaa gggtactgtt421ttggctggtc ctttggatgc tttggctgtt tctgctccat ctgtttggca acaaactact481ggttctgctt tgactactgc tttgagaaac gctggtggtt tgactcaaat tgttccaact541actaacttgt actctgctac tgacgaaatt gttcaacctc aagtttctaa ctctccattg601gactcttctt acttgttcaa cggtaagaac attcaagctc aagctgtttg tggtccattg661ttcgttattg accatgctgg ttctttgact tctcaattct cttacgttgt tggtagatct721gctttgagat ctactactgg tcaagctaga tctgctgact atggtattac tgactgtaac781cctttgccag ctaatgattt gactccagaa caaaaggttg ctgctgctgc tttgttggct
841ccagaagctg ctgctattgt tgctggtcca aagcaatact gtgaaccaga cttgatgcca901tacgctagac catttgctgt tggtagaaga acttgttctg gtattgttac tccataaSEQ ID NO.2的信息<210>2<211>318<212>PRT<213>人工序列<400>21 MLPSGSDPAF SQPKSVLDAG LTCQGASPSS VSKPILLVPG TGTTGPQSFDSNWIPLSTQL61 GYTPCWISPP PFMLNDTQVN TEYMVNAITA LYAGSGNNKL PVLTWSQGGLVAQWGLTFFP121 SIRSKYDRLM AFAPDYKGTV LAGPLDALAV SAPSVWQQTT GSALTTALRNAGGLTQIVPT181 TNLYSATDEI VQPQVSNSPL DSSYLFNGKN IQAQAVCGPL FVIDHAGSLTSQFSYVVGRS241 ALRSTTGQAR SADYGITDCN PLPANDLTPE QKVAAAALLA PEAAAIVAGPKQYCEPDLMP301YARPFAVGRR TCSGIVTP
權利要求
1.一種南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于，按照畢赤酵母偏愛密碼子結構，通過化學方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了?；D移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交。
2.根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的編碼具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。
3.根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的MuCALB1，是指南極假絲酵母脂肪酶氨基酸序列多肽的三個突變氨基酸位點分別是Val210 Ile、Ala281 Glu、Asn292 Tyr，是突變的CALB的氨基酸序列多肽。
4.根據權利要求3所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，根據所述的突變的CALB的氨基酸序列多肽，按照畢赤酵母偏愛密碼子的優先結構，設計并通過亞磷酸三酯法人工合成了CALB基因。
5.根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的中度嚴謹條件下，指核苷酸序列之間能在0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，pH7.0的2×SSC和0.1％SDS的條件下。
6.根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的化學方法，指亞磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
7.根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的人工合成，指在體外進行的、使用核酸自動合成儀合成核苷酸序列的方法。
8.根據權利要求1或者3或者5所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
9.根據權利要求1或者2或者3所述的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，用如下在畢赤酵母中產生和表達的方法能夠獲得所述的MuCALB1基因(1)將按畢赤酵母偏愛密碼子設計人工合成的編碼MuCALB1蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成南極假絲酵母脂肪酶基因表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第1-957位的核苷酸序列雜交；(2)將步驟(1)中的表達載體電擊轉入畢赤酵母，在28-30℃條件下，在抗生素平板上培養2-4天，獲得含有CALB蛋白基因的重組細胞；(3)再生重組細胞，獲得表達CALB蛋白基因的重組酵母菌株。
全文摘要
本發明涉及的是一種分子生物技術領域的南極假絲酵母脂肪酶的核苷酸序列。按照畢赤酵母偏愛密碼子結構，通過化學方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，編碼具有與野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了?；D移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQID NO.1中從核苷酸第1－957位的核苷酸序列雜交。所述的編碼具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第1－957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。本發明其基因在畢赤酵母細胞中高效表達的脂肪酶量達到21.6mg/L，酰基轉移活力轉化率是野生型CALB的3.08倍，為酶法制備生物柴油中?；D移酶活力低的問題具有重要意義。
文檔編號C12N1/19GK1986558SQ200610147229
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者唐克軒, 姚紅艷, 王絳 申請人:上海交通大學