專利名稱：：產生清潔味道的酶制劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用酶制劑處理底物的方法、新穎的酶制劑和用于制備酶制劑的過程。本發明還涉及乳糖酶。
背景技術：
：酶改善食品級別產物的化學性質、物理化學性質或感官覺(organoleptic)性質的用途是廣泛的。在對牛奶和其它動物衍生的底物的加工中，酶的使用使最終產物增加了顯著的價值。例子是用乳酸酶孵育使得奶能被乳糖不耐受個體接受，對酪蛋白和乳清蛋白的蛋白水解來減輕變應原性，并促進泡沫特性，使用磷脂酶A2修飾卵磷脂來改善烘焙性能并穩定蛋黃醬，對肉和魚制品使用轉谷氨酰胺酶來改善硬度和彈性，以及通過添加葡萄糖氧化酶從蛋制品或搓碎的乳酪中去除氧。另外，酶處理被用于增強多種動物衍生食品的香味。例如，蛋白酶被用于加速魚和肉提取物中的香味發生。另外，在乳酪中加速香味發生是公知的目標。盡管EMC(經酶改良的乳酪)是其中最初使用多種脂酶的成熟制品，但是通過添加少量的胞外蛋白酶(exoprotease)、脂酶或酯酶來加速乳酪老化中涉及的細微的味道改變是更近期的發展。本發明還涉及乳糖酶。乳糖酶或j8-半乳糖苷酶(E.C:3.2丄23)是催化乳糖(一種二糖)水解為其組分——單糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中，更特別地存在于奶、脫脂奶、奶油和其它乳制品中。天然存在的乳糖酶對乳糖的降解發生在人體(和其它哺乳動物)腸壁中。乳糖在缺乏乳糖酶的大部分種群中引起的營養和功能問題是公知的，并且被描述過。這類種群的成員不能夠水解乳糖，乳糖在這類情況下進入大腸，在那里導致脫水、弱的鈣吸收、腹瀉、腸胃氣脹、噯氣和痛性痙攣(cramp)，甚至在嚴重的情況下導致水樣爆炸性腹瀉(wateryexplosivediarrhoea)0乳糖酶的一種重要的工業應用是生產供乳糖不耐受個體用的、乳糖經水解的乳制品。這類經水解的乳制品包括巴氏滅菌奶、UHT-奶和從其所有或部分的最初組分經過或不經過中間加工步驟(如蛋白質水解)重建的奶。用乳糖酶的處理可以在對奶進行熱處理之前或之后進行。可以通過向奶中添加所述酶進行乳糖酶處理。乳糖的可溶性特性使其可導致結晶，導致砂質(sandy)或砂樣(gritty)結構。這類不期望的結構可存在于一些乳制品(如煉乳、淡奶、奶粉、冰凍奶、冰激凌)中和具有高乳含量的糖果制品中。乳糖酶對乳糖的完全或部分水解解決了該問題，提供了具有均一質地的制品，且使得消費者更能接受。乳糖酶的另一工業應用是提高含乳糖制品如奶或酸奶中的甜味。這類制品中，乳糖的水解產生了葡萄糖，從而導致甜味提高。乳糖酶的另一工業應用是水解含有乳成分的乳糖制品如面包。將乳糖添加進這類制品中以增加香味、保持水分、提供褐色和改善烘烤特性。在例如增強外皮顏色發生、改善香味和風味、改變結構、延長保質期(shdflife)和增強面包結構的方面，經水解的乳糖糖漿是有希望的。發酵的乳制品(如酸奶)中，通過乳糖酶進行的乳糖水解將增加甜味。然而，當在開始發酵加工前添加乳糖酶時，其可能提高酸發生的速率，從而減少加工時間。對奶或奶衍生制品(如乳清)的乳糖酶處理使得這類制品適用于在針對乳糖不耐受動物(如貓)的動物飼料和寵物飼料中應用。乳糖水解允許制造更高濃度的乳清，同時預防與前文針對乳糖缺陷患者所述相似的腸道問題。經乳糖酶水解的乳清被濃縮，產生含70-75。％固體的糖漿，其被用作為冰激凌、烘焙制品和糖果制品中的食物成分。乳糖酶已經被描述過，其分離自大量生物，包括微生物。乳糖酶通常是微生物如《/w_yveram_ycas禾口萬ac/〃w的細胞內成分。《/w;;veram_yc&s和特別是I/ragz'fo和K/acto，和其它酵母如Ca"AJa、7brw/a禾QTbrw/o;^;屬的酵母是酵母酶乳糖酶的常見來源，而AcoagM/a^或S">ct//a"s是細菌乳糖酶的公知來源。可以獲得來自這些生物的若干種商業乳糖酶制劑，如Maxilact(來自尺/acfc，由DSM,Deflt，荷蘭生產)。所有這些乳糖酶是7所謂的中性乳糖酶，因為它們具有pH-6和pH-8之間的pH最適度。若干禾中生物如JwergW/Mm'ger禾口^sperg77ws能夠生產細胞夕卜乳糖酷，US專利5,736,374描述了這類乳糖酶的一個例子，其由Aspe/^z7//1^oo^e生產。乳糖酶的特性如pH和溫度最適度在物種之間變化。然而，通常，被分泌的乳糖酶顯示pH=3.5到pH=5.0的較低pH最適度；而細胞內乳糖酶通常顯示在pH=6.0到pH=7.5區域內的較高pH最適度，但是這些一般規則有例外發生。對中性或酸性乳酸酶的選擇取決于應用中的pH模式。在中性pH的應用中，中性乳酸酶通常是優選的；這類應用包括奶、冰激凌、乳清、乳酪、酸奶、奶粉等。酸性乳酸酶更適合于在酸性范圍內應用。合適的乳酸酶濃度取決于最初的乳糖濃度，所需的水解程度、pH、溫度和水解時間。盡管酶處理的目的在于改善食品的功能性和/或味道模式，但是偶然地，酶處理可能具有意外的和不希望的副作用。不希望的副作用的一個例子是酶處理導致的異味的發生。Mettallet.al，TheAustralianJournalofDairyTechnology,(1991)，46-48描述了用乳糖酶處理乳時發生異味的問題。根據該出版物，高水平的蛋白酶會導致異味的快速產生。因此生產操作被最優化，以使得蛋白水解副活性最小化，從而降低異味形成的風險。針對《衍生的乳糖酶的純化操作的一個例子被描述于WO02/081673中。人們發現，甚至具有低蛋白酶活性的乳糖酶制劑仍然能夠引起異味形成。在來自酵母細胞質的中性乳糖酶的情況下尤其如此。與乳糖酶制劑使用相關的異味形成對于乳糖水解的UHT奶來說是特別關鍵的。用于該情況的乳糖酶是中性乳糖酶，因為它們具有對奶來說良好的pH最適度。UHT奶接受高熱處理，以獲得室溫下若干月的保質期。冰箱外的長時間儲存使得這些制品特別容易形成異味即使是非常慢的異味形成速率也能夠在幾個月的儲存后導致顯著的異味形成，使得產物對消費沒有吸引力。
發明內容目前，我們驚奇地發現，用酶制劑處理底物時，酶制劑中作為污染副活性存在的芳基硫酸酯酶(即便是非常低的水平)能夠在產物中導致異味的強烈發生，而使用沒有芳基硫酸酯酶活性或有降低的芳基硫酸酯酶活性的酶制劑則導致異味發生的強烈減少。因此，本發明提供了一種工藝，在一個方面，包括用酶制劑處理底物的工藝，其中所述酶制劑基本不含芳基硫酸酯酶。本發明其它方面還提供了基本不含芳基硫酸酯酶的酶制劑。本發明在一個具體的方法還提供了相對于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40個單位的芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶。根據本發明的乳糖酶制劑可有利地用于食品和飼料制品中，以水解乳糖，而不形成異味化合物。我們驚奇地發現芳基硫酸酯酶是負責異味形成的決定性酶活性。我們通過對UHT奶添加芳香族硫酸酯酶發現了確定的證據，所述添加導致該單種酶能夠模擬通常在乳糖酶處理的UHT奶中觀察到的異味。雖然不希望受任何科學理論束縛，但是我們相信芳香族硫酸酯酶對代謝綴合物(尤其是用硫酸酯基團取代的烷基苯酚)的水解是導致異味發生的機制。因此，根據本發明的酶制劑特別有利于處理含有用硫酸酯基團取代的烷基苯酚的底物。發明詳述本發明的一個方面提供了相對于每NLU乳糖酶活性而言包含少于40單位芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶。優選地，該乳糖酶相對于每NLU乳糖酶活性而言包含少于30個單位的芳基硫酸酯酶活性，更優選地相對于每NLU乳糖酶活性而言少于20單位的芳基硫酸酯酶活性，最優選地相對于每NLU乳糖酶活性而言少于IO單位的芳基硫酸酯酶活性。芳基硫酸酯酶單位在實施例2中有定義，并針對以NLU表達的乳糖酶活性(也在實施例2中定義)對其進行了標準化。乳糖酶可以是細胞內或細胞外生產的乳糖酶。在一種優選的實施方案中，乳糖酶是細胞內生產的乳糖酶。在一種優選的實施方案中，乳糖酶是中性乳糖酶。中性乳糖酶具有pH=6和pH=8之間的pH最適度。中性乳糖酶制劑通常來自微生物的細胞質。對它們的生產包括微生物的(大規模)發酵，隨后是乳糖酶的分離。后者要求破壞細胞壁從而將酶從細胞質中釋放。若干種技術已經被用于獲得細胞裂解物，包括通過有機溶劑(如辛醇)、超聲波處理或弗氏細胞壓碎器(FrenchPressing)使細胞壁可透過。除乳糖酶外的其它酶(包括蛋白酶)同時從細胞質中被釋放。在一種優選的實施方案中，乳糖酶具有相對于每NLU乳糖酶活性而言少于0.5RFU/分鐘的蛋白酶活性。已經針對大量生物(包括微生物)描述了可以根據本發明的方法純化的細胞內乳糖酶，并從所述生物中分離出來。乳糖酶通常是微生物如K/wverawycas禾卩5ac/〃ws的細胞內成分。《/w7veram少c&s禾Q特另U是K/acto、《marxz'wtw禾口足yhagz'fo，禾口其它酵母如Cawcf/fia、7brw/a禾口7brw/o;^s屬的酵母是酵母酶乳糖酶的常見來源，而及co"gw/a朋或S"Vr"/^w是細菌乳糖酶的公知來源。可以獲得來自這些生物的若干種商業乳糖酶制劑，如Maxilact⑧(來自《./acto，由DSM生產)。所有這些乳糖酶是所謂的中性乳糖酶，因為它們具有pH=6和pH=8之間的pH最適度。已經針對多個物種描述了細胞內乳糖酶，對它們中的若干種而言，它們的氨基酸序列和/或DNA序列是已知的。序列信息可由公眾在序列數據庫中獲得，例如在GenBank(Bethesda，MarylandUSA)、EuropeanMolecularBiologyLaboratory'sEuropeanBioinformaticsInstitute(EMBL誦BankinHinxton，UK)、theDNADataBankofJapan(Mishima,曰本)禾口theSwissprot(瑞士)中獲得。可以根據基因和/或蛋白質序列中的同源性在基因組中鑒定乳糖酶。細胞內酶的粗制劑的特征在于存在若干種僅存在于細胞的細胞質中的酶，例如涉及細胞中心代謝的酶，包括涉及糖酵解的酶。細胞外乳糖酶也已經被描述過。它們通常因為含有稱作前導序列的肽序列而被認為是細胞外酶。所述前導序列以某些方式被生產酶的細胞識別為所述酶應當被輸送至細胞外的信號。在分泌期間，前導序列通常被去除。已經針對多種物種描述了細胞外乳糖酶，例如oo^"細胞外乳糖酶的粗制劑特征在于不存在細胞內酶并且存在典型的細胞外酶，如蛋白酶。人們發現細胞外酶的種類隨生物而不同，它們對于所述生物來說是典型的。因為發酵或加工期間的細胞裂解，故而這類細胞外酶制劑中可存在低水平的細胞內酶。因此，可以根據乳糖酶與其它己知乳糖酶的氨基酸序列比較為基礎，將其分類為細胞外或細胞內的。原則上，細胞內乳糖酶可以與前導序列一起提供。這可能導致乳糖酶從細胞中分泌進入培養基。在存在典型的細胞外酶和不存在或以低水平存在典型的細胞內酶時，這類酶的粗制劑的特征將在于基于其氨基酸序列被歸類為細胞內的乳糖酶。本發明使用的優選的細胞內乳糖酶為具有http:〃www.ebi.uniprot.org/entry/BGAL—KLULA所述的氨基酸序列的K/acfo乳糖酶，或具有與尺/acto的氨基酸序列至少90%、優選至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http:〃www.ebi.uniprot.org/entry/Q6QTF4—KLUMA所述氨基酸序列的Km^jdam^乳糖酶，或具有與AT./acto的氨基酸序列至少90%、優選至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。具有http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=031341—BACCI&pager.offset=0http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=Q45092—BACCI&pager.offset=0http:〃www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.doproteinId=Q45093_BACCI&pager.offset=0中所述氨基酸序列的及"Vcw/ara乳糖酶，或具有與5.cz'mz/fl似的氨基酸序列至少90%、優選至少95%相同的氨基酸序列的乳糖酶。術語"同源性"或"相同性百分比"在本文可互換使用。在本文中定義為了確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，將序列就最佳比較的目的進行比對(例如可向第一條氨基酸或核酸序列中引入缺口，用于與第二氨基酸或核酸序列的最佳比對)。然后比較相應的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當第一條序列中的一個位置與第二序列中相應位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸一樣時，分子在該位置上是相同的。兩條序列間的相同性百分比是序列共享的相同位置數的函數(即相同性％=相同位置數/位置總數(即重疊位置)x100)。優選地，所述兩條序列是相同長度。技術人員應當明白下述事實可獲得若干種不同的計算機程序來測定兩個序列間的同源性。例如，兩個序列間序列的比較和相同性百分比的測定可以使用數學算法完成。在一種優選的實施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來確定兩條氨基酸序列之間的相同性百分比，所述算法已被整合進GCC軟件包中的GAP程序中(可得自http:〃www.gcg.com)，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，和16、14、12、10、8、或4的缺口權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重。技術人員應當明白，所有這些不同的算法會產生輕微差異的結果，但是使用不同的算法時兩個序列的總體相同性百分比不會顯著改變。對細胞內乳糖酶的制備需要破壞細胞以釋放乳糖酶。同時，其它細胞質酶被釋放。通過副活性對乳糖酶活性的比例來確定乳糖酶工業制劑的品質。特別地，蛋白酶是關鍵的副酶，因為已知它們將導致應用中不需要的副作用，例如奶中的乳凝塊或異味形成。異味形成在具有長保質期并儲存于室溫下的制品中特別關鍵。一種這樣的制品為UHT奶，異味形成是乳糖酶水解的UHT奶的一個已知問題。UHT奶對異味形成非常敏感；當乳糖酶制劑不在UHT奶中產生異味時，其通常也不在其它應用中產生異味。在奶(特別是UHT奶)中與異味形成相關的化合物與蛋白質水解和Maillard反應二者相關(Valeroetal(2001)FoodChem.72,51-58)。乳糖酶制劑中作為副活性存在的任何蛋白酶可能增強異味形成；需要何種水平的蛋白酶是不清楚的，但是在數月的儲存時間下，即便是非常低的蛋白質水解活性也可能是很重要的。UHT奶對異味形成非常敏感；當乳糖酶制劑不在UHT奶中產生異味時，除所述異味以外(如例如Valeroetal(2001)FoodChem.72，51-58中所述)，其通常也不會在其它應用中產生異味。因此，UHT應用是關于乳糖酶制劑的異味潛能評價其品質的一種好方法。因為蛋白酶至少部分地負責異味形成，所以人們已努力降低乳糖酶制品的蛋白酶水平。然而，我們已經發現蛋白酶水平的降低不能導致UHT奶中異味形成的完全去除。我們已經驚奇地發現，芳基硫酸酯酶是負責異味形成的一種決定性的酶活性。我們已經發現了確定的證據向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶，這導致該單種酶能夠模擬通常在經乳糖酶處理過的UHT奶中觀察到的異味。根據本發明，公開了從乳糖酶中去除芳基硫酸酯酶的色譜工藝，所述乳糖酶優選來自《/acto。我們進行了對多種UHT奶樣品的詳細的感覺分析，所述樣品不含有異味或不含有顯著水平的異味(實施例1)。這些感覺分析與樣品化學組成的詳細分析組合起來。若干種化合物被鑒定為關鍵性香味化合物，它們中的大部分先前已經被描述為與UHT奶相關。令人驚奇的是，對甲酚也被鑒定為關鍵性的異味化合物。該化合物之前未被描述為UHT奶中的異味化合物(Valeroetal(2001)FoodChem.72，51-58)。其可由芳基硫酸酯酶從其硫酸酯綴合物產生，所述硫酸酯綴合物以非常低的量(ppb水平)存在于奶中(V.Lopez,R.C.LindsayJAgric.FoodChem.(1993),41,446-454;M.Killic&R.C.Lindsay,JDairySci(2005)88，7-12;MKilic&R.C.LindsayJAgricFoodChem(2005)53，1707-1712)。我們驚奇地發現芳基硫酸酯酶是乳糖酶制劑中的一種酶活性，并負責異味形成。我們這樣證實了上述內容向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶，我們發現該單種酶的確能夠模擬通常在乳糖酶處理過的UHT奶中觀察到的異味。我們隨后開發了一種從乳糖酶中去除芳基硫酸酯酶的色譜方法，所述乳糖酶來自K/flcto。如從品嘗小組試驗(trialswithtastepanels)中所概括的，我們發現對芳基硫酸酯酶的去除也導致UHT奶中異味形成的去除。最終的乳糖酶產物中芳基硫酸酯酶水平<20單位芳基硫酸酯酶，優選<10單位芳基硫酸酯酶，進一步更優選地<8單位芳基硫酸酯酶，最優選地0單位芳基硫酸酯酶。芳基硫酸酯酶單位在實施例2中有定義，并針對乳糖酶活性對其了標準化，所述乳糖酶活性以NLU表達，并也在實施例2中定義過。已經描述了(例如在WO02/081673中)若干種用于乳糖酶的純化途徑，但是這些純化方法不旨在去除芳基硫酸酯酶。本文結果顯示均來自《/acto的芳基硫酸酯酶和乳糖酶在離子交換(Q-瓊脂糖)和疏水性相互作用(丁基-瓊脂糖)色譜上具有非常相似的洗脫行為。因此，我們認為，已描述過的現有技術途徑不能產生不含芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶制劑。除了降低乳糖酶制劑中芳基硫酸酯酶水平外，還存在從乳糖酶制劑中降低或消除芳基硫酸酯酶活性的其它方式。它們是l)向生長培養基中添加硫酸酯。已知硫酸酯能抑制芳基硫酸酯酶表達(Beiletal.(1995)Eur.J.Biochem.229，385-394)，因此預料到向培養基中添加硫酸酯會降低芳基硫酸酯酶水平；2)使用例如本領域技術人員己知的分子生物學技術，通過隨機誘變技術或定點手段，從生物的基因組中消除或打斷芳基硫酸酯酶基因，3)篩選和選擇是芳基硫酸酯酶活性的天然低生產者或不生產者的菌株，4)添加酶的抑制劑。例如已知某些種類的芳基硫酸酯酶能被磷酸根離子抑制。代謝綴合物如硫酸酯、葡糖苷酸和磷酸鹽存在于來自多種物種的奶中，包括牛奶(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454;Killicetal(2005)JDairySci88，7-12)。代謝綴合是被廣泛接受的在哺乳動物中解毒并增強外來物質水溶性的手段。綴合物最有效地由肝和腎形成，它們主要在尿和膽汁中消除之前在血流中循環。己經在來自例如牛、山羊和綿羊的乳中發現了烷基苯酚和多種其它化合物的綴合物(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454)。代謝綴合物的性質和多樣性是非常寬泛的，其包括苯硫酚、苯酚、o-甲酚和p-甲酚。綴合能夠導致硫酸、磷酸或葡糖苷酸基團的附著。這些基團可以由酶(如芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶和葡糖苷酸酯酶)從綴合物中釋放，導致毒素化合物的釋放。已經在來自牛、綿羊和山羊的奶中證實了若干類型綴合物的存在；綴合物的相對豐度在制劑之間有所變化，并至少部分是物種相關的(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41,446-454)。在牛奶中，硫酸酯綴合物被證明為是最豐富的綴合物，但是在綿羊乳中，磷酸酯綴合物比硫酸酯更豐富(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41，446-454)。在本申請中展示出存在于奶中的綴合物是中性乳糖酶制劑中副活性的底物。已知這些綴合物的濃度水平對一個物種而言可隨時間變化(Kilicetal，(2005)JdairySci88，7-12)和在物種間變化(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem41，446-454)。我們預計，這可能影響對乳糖酶制劑的要求。例如，我們預計，對于山羊奶(其中磷酸酯綴合物非常豐富)而言，對乳糖制劑中磷酸酯酶水平的耐受與將相同的乳糖酶制劑用于牛奶(具有非常低的磷酸酯綴合物水平)的情況相比要低得多。在該方面，細胞內乳糖酶或細胞外乳糖酶制劑之間不存在差異。另一方面，本發明提供了用酶制劑處理底物的工藝。所述酶制劑優選地不含芳基硫酸酯酶。本文使用的基本不含芳基硫酸酯酶的酶制劑可包括下述任何酶制劑，其中不存在或以足夠低的水平存在芳基硫酸酯酶活性，所述足夠低的水平使得在相關的生產過程中使用有效劑量的期望酶活性時，在所述生產過程中不發生與陰性感官效果相關的(associatednegativeorganolepticeffects)可觀察到的烷基苯酚硫酸鹽分解。本文使用的基本不含芳基硫酸酯酶的酶制劑可包括下述酶制劑，其中芳基硫酸酯酶活性除以感興趣的酶活性的比值低于特定值。優選的比值可根據使用的酶和應用變化。芳基硫酸酯酶活性表示如針對EC3丄6.1所述的、能夠將苯酚硫酸酯切割為苯酚和硫酸部分的硫酸酯水解酶活性。芳基硫酸酯酶單位的定義在本申請的材料和方法章節(和實施例2)中提供。其它酶的活性也可以參見本申請的材料與方法章節。在本發明的另一方面，本發明提供了包含羧肽酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每單位羧肽酶(CPG)而言少于10000個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。優選地，所述酶制劑含有相對每羧肽酶單位(CPG)而言少于5000個單位、更優選地少于1000個單位、更優選地少于500個單位、更優選地少于100個單位、更優選地少于50個單位、更優選地少于10個單位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本發明提供了包含脯氨酸特異蛋白酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每單位脯氨酸蛋白酶(PPU)而言少于300*10E3個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。優選地，所述酶制劑含有相對每個蛋白酶單位(PPU)而言少于100*10E3個單位、優選地少于50*10E3個單位、優選地少于10*10E3個單位、優選地少于5000個單位的芳基硫酸酯酶。另一方面，本發明提供了包含(中性)乳糖酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每NLU乳糖酶活性而言少于40個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。優選地，所述酶制劑含有相對每NLU乳糖酶活性而言少于30個單位的芳基硫酸酯酶活性、更優選地相對每NLU乳糖酶活性而言少于20個單位的芳基硫酸酯酶活性、最優選地相對每NLU乳糖酶活性而言少于10個單位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本發明提供了包含(酸性)乳糖酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每ALU乳糖酶活性而言少于40個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。優選地，所述酶制劑含有相對每ALU乳糖酶活性而言少于100個單位的芳基硫酸酯酶活性、更優選地相對每ALU乳糖酶活性而言少于30個單位的芳基硫酸酯酶活性、更優選地相對每ALU乳糖酶活性而言少于20個單位的芳基硫酸酯酶活性、最優選地相對每ALU乳糖酶活性而言少于10個單位的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本發明提供了包含氨肽酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每APU而言少于1000個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每APU而言少于300個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每APU而言少于100個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每APU而言少于30個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每APU而言少于10個單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。另一方面，本發明提供了包含酯酶和/或脂酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對每BGE而言少于10"0E6單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每BGE而言少于3*10E6單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每BGE而言少于1*10E6單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性、優選地相對每BGE而言少于300*10E3單位(ASU)的芳基硫酸酯酶活性。用基本不含芳基硫酸酯酶的酶制劑處理底物也可以包括下述底物處理，其中所述處理期間底物中芳基硫酸酯酶低于特定值。另一方面，本發明提供了用酶制劑處理底物的工藝，其中所述處理期間所述底物中芳基硫酸酯酶水平為每升底物至多500*10E3芳基硫酸酯酶單位，優選地每升底物至多250*10E3、優選地至多100*10E3、優選地至多50*10E3、優選地至多25*10E3芳基硫酸酯酶單位。我們發現當底物為奶(優選牛奶)時，將芳基硫酸酯酶水平維持在低于上述值是尤其有利的。基本不含芳基硫酸酯酶的酶制劑也可以包含通過純化粗酶制劑獲得的任何酶制劑，所述粗酶制劑含有感興趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶與感興趣的酶分離。因此，本發明還提供了用于制備酶制劑的工藝，所述工藝包括純化粗酶制劑，所述粗酶制劑含有感興趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶與所述感興趣的酶分離。該工藝可有利地包括用經純化的酶制劑處理底物。純化步驟具有下述效果芳基硫酸酯酶的活性相對于感興趣酶的活性而言被降低。優選地，所述純化導致芳基硫酸酯酶活性降低至少50%、優選地至少80%、更優選地至少90%、更優選地至少95%、更優選地至少99°丄技術人員應當明白這應理解為表示優選地(aAs,純/a^，純)/(aAs,a/aenz,粗)《0.5、優選地《0.2、優選地《0.1、優選地《0.05、優選地《0.01，其中aAS，=經純化的酶制劑中芳基硫酸酯酶的活性(單位/ml)aenz，=經純化的酶制劑中感興趣的酶的活性(單位/ml)aAS，ffl=粗酶制劑中芳基硫酸酯酶的活性(單位/ml)^-=粗酶制劑中感興趣的酶的活性(單位/ml)純化可以以任何合適的方式進行。在一種優選的實施方案中，純化是通過色譜進行。用于使用色譜純化酶制劑的工藝是本身己知的。根據存在的相關酶和相關芳基硫酸酯酶活性二者的分子特性，來選擇最適當的色譜分離方法。相關分子特性是等電點、疏水性、分子表面電荷分步、相關酶的分子量和副活性以及若干種其它蛋白質化學特征。在選擇適當的色譜分離工藝中使用這些特性的實踐背景可見于a.o.蛋白質純化手冊(由AmershamPharmaciaBiotech,nowadaysGEHealthcareBio-Sciences,Diegem,比利時出版)。合適的色譜分離方法包括離子交換色譜、親核色譜、尺寸排除色譜、疏水相互作用色譜等。對本發明而言，離子交換色譜或疏水相互作用色譜是優選的。在一種優選的實施方案中，純化優選在單一色譜分離步驟中進行。在單一色譜步驟中可以將酶活性有效地與污染的芳基硫酸酯酶活性分離的事實對于本發明工藝的工業應用性來說是尤其有利的。酶制劑可包含任何合適的酶。在一種優選的實施方案中，所述酶(在下文也稱作感興趣的酶)是乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。可以根據本發明使用的酶在下文中公開。用于所有酶的分類和命名的國際公認的流程由IUMB提供。針對EC成員的升級的IUMB文本可參見下述因特網站點-http:〃www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/l1/。在該系統中，酶由它們催化單一反應的事實定義。這意味著若干種不同的蛋白質均被描述為相同的酶，催化多于一種反應的蛋白質被作為多于一種酶處理。根據該系統，蛋白酶可以被再分為內切和外切蛋白酶。另外，存在所謂的二肽基肽酶和三肽基肽酶。內切蛋白酶是水解內部肽鍵的酶，外切蛋白酶水解與末端a-氨基相鄰的肽鍵("氨肽酶")，或末端羧基和次末端氨基酸之間的肽鍵("羧肽酶")。內切蛋白酶基于催化機制被分為亞-亞類。存在亞-亞類的絲氨酸內切蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸內切蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸內切蛋白酶(EC3.4.23)、金屬內切蛋白酶(EC3.4.24)和蘇氨酸內切蛋白酶(EC3.4.25)。典型地使乳凝塊用于乳酪生產的蛋白酶如凝乳酶(EC3.4.23.4)或粘膜胃蛋白酶(EC3.4.23.23)均屬于天冬氨酸內切蛋白酶的種類。在內切蛋白酶中，所謂的氨肽酶(EC3.4.1l)能夠連續地將單個氨基端氨基酸從蛋白質和肽底物上去除。在外切蛋白酶中，羧肽酶(EC3.4.16,3.4.17和3.4.18)可連續地將單個羧基端氨基酸從蛋白質和肽底物上去除。二肽基和三肽基肽酶(EC3.4.13、3.4.14和3.4.15)可以將二肽或三肽從肽或蛋白質的氨基端側或羧基端側切除。在本發明的一個實施方案中，酶是排除天冬氨酸內切蛋白酶(EC3.4.23的蛋白酶。作用于蛋白質或肽和尤其涉及本發明應用范圍的其它酶是o)肽酶(EC3.4.19)和能夠轉換氨基酸側基團的酶。用于這類轉化反應的底物可以是游離的氨基酸或與蛋白質或肽結合的氨基酸。后一類酶的例子是能夠選擇性水解與蛋白質結合的谷氨酰胺的7酰胺基的酶，即肽-谷氨酰胺酶(EC3.5.1.43和3.5.1.44)。能夠交聯蛋白質或肽的其它酶如轉谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)和蛋白質賴氨酸6-氧化酶(EC1.4.3.13)代表了典型的例子。乳糖酶(EC3.2丄23)是能夠分解乳糖的微生物i3-半乳糖苷酶，其與本申請的范圍特別相關。脂酶和酯酶與本申請的范圍特別相關，因為這些酶通常用于生產EMC's(EnzymeModifiedCheeses),并在加速乳酪老化具有增加的興趣。因此，脂酶和酯酶是要根據本發明的工藝被純化的主要候選者。根據IUMB系統，脂酶和酯酶屬于羧酸酯水解酶(EC3丄1)。盡管酯酶可作用于廣泛的底物，但是脂酶(EC3丄1.3)僅切割三酰基甘油。能夠從三酰基甘油上去除甲酸根、乙酸根、丙酸根或丁酸根的脂酶有時也稱作"酯酶"。在本申請中，術語"酯酶"是指能夠從三酰基甘油上有效地去除這類短鏈羧酸的酶。兩親酶例如脂酶或酯酶的回收任選地通過使用膽酸或其它食品級別的乳化劑被改善。用于測定脂酶和酯酶活性的方法在材料與方法章節中提供。工業可獲得的、食品級別的酶制劑典型地得自哺乳動物組織(例如來自胰腺的胰蛋白酶)或來自植物材料(例如來自番木瓜的木瓜蛋白酶)。在一個優選的實施方案中，酶得自微生物菌株，例如細菌(例如Bacillus的禾中)或酵母(例如Saccharomyces、Kluyveromyces或Pichia)或絲狀真菌。已知生產食品級別酶制劑的絲狀真菌為例如Aspergillus、Rhizomucor、Rhizopus、Trichoderma禾口Talaromyces。在本發明的實施方案中，酶制劑例如由絲狀真菌生產或來自絲狀真菌，所述絲狀真菌例如為Aspergillusniger或Aspergillusoryzae。本文使用這類酶制劑也包括例如由A.niger或由A.oryzae生產的自我克隆的酶制劑。可以使用真菌由微生物發酵工藝來生產感興趣的酶，所述真菌生產感興趣的蛋白酶并優選地將其分泌在發酵液中。在本領域中，這類發酵工藝是已知的，參閱例如WO02/45524。在現有技術的工藝中，也可以通過本領域已知的技術從發酵液中回收酶。第一步，可以通過離心或過濾將生產生物的細胞與發酵液分離。可以通過例如超濾來濃縮不含細胞的發酵液，隨后對其進行色譜純化。真菌菌株典型地生產多于一種芳基硫酸酯酶活性，使得不易在單一步驟中通過色譜從這些芳基硫酸酯酶活性中分離出相關的酶。另一復雜因素是特定微生物分泌的不同的酶活性(即選擇的酶活性以及多種芳基硫酸酯酶活性)具有密切接近的等電點。通過色譜分離期望的酶活性和污染的芳基硫酸酯酶活性時，藉此獲得的經純化的酶制劑可以被穩定化。當酶不由微生物分泌而是留在細胞內時，可以通過過濾或離心回收生產微生物，之后可以裂解剩下的細胞以釋放相關的酶活性。去除細胞碎片的另一過濾或離心步驟后，可以如上針對經分泌的酶所述濃縮并穩定液體級分。經純化的和液體的酶制劑可以被濃縮，并與已知的穩定劑(例如甘油或其它多元醇)混合。或者，可通過已知的沉淀和/或蒸發步驟和隨后的公知(噴霧)干燥技術從濃縮的酶溶液獲得所述制劑。根據本發明，可以用酶制劑處理底物。底物可以是任何合適的底物。優選地，所述底物為蛋白質性底物。蛋白質性底物可以是包含蛋白質的任何底物。在一個優選的實施方案中，底物含有乳蛋白，例如酪蛋白和/或乳清蛋白。優選的底物的例子為奶、乳衍生制品、經發酵的乳制品(例如酸奶)乳清和/或水解產物。底物也可以包含肉。通過蛋白質性底物蛋白質(優選地為動物衍生的底物蛋白質)的酶水解形成的任何產物可以用作水解產物。優選乳清蛋白水解產物、酪蛋白水解產物和脫脂乳水解產物。在一個優選的實施方案中，底物含有用硫酸酯基團取代的烷基苯酚。垸基苯酚表示其苯酚基團的至少一個芳香質子被替換為烷基。垸基的長度可以變化，并可以是帶分支的或被取代的。優選的垸基苯酚為甲基苯酚和乙基苯酚。烷基苯酚硫酸鹽表示在羥基上被硫酸鹽化綴合的烷基苯酚。芳基硫酸酯酶(EC3丄6.1)是能夠將烷基苯酚硫酸鹽切割為烷基苯酚和硫酸根部分的硫酸酯水解酶。對底物的處理可涉及其中底物與酶制劑接觸的任何過程。處理可涉及其中在存在酶制劑時孵育底物的任何過程。酶制劑可以以任何合適的方式被添加進底物中。所述過程可以是其中生產了制品(例如營養制品，優選地為乳制品)的任何過程。本文使用的乳制品包括含有乳蛋白(例如酪蛋白和/或乳清蛋白)的任何組合物。例子為乳衍生制品、經發酵的乳制品(例如酸奶)、煉乳、淡奶、奶粉、冰凍奶、冰激凌、乳清；和/或乳酪。制品也可以是水解產物。酶制劑可被用于制備任何合適的制品，例如營養制品，優選地為乳制PB口o本發明還涉及根據本發明的酶制劑用于預防或減少異味發生的用途。一方面，本發明提供了生產是芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的宿主細胞的工藝，所述工藝包括將生產芳基硫酸酯酶的培養物置于所述培養物部分被修飾的條件下，以形成芳基硫酸酯酶缺陷的宿主細胞，并分離所述宿主細胞。在一個優選的實施方案中使用誘變條件，優選地是隨機誘變條件，例如物理或化學誘變。在一個優選的實施方案中，使用重組遺傳操作技術，優選地使用一步基因打斷、標記物插入、定點誘變、缺失、RNA干擾、反義RNA。本發明還提供了通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)在有益于多肽表達的條件下，在營養培養基中培養芳基硫酸酯酶缺陷型宿主細胞(b)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(c)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。本發明還提供了通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)用表達載體轉化芳基硫酸酯酶缺陷型宿主細胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在有益于所述多肽表達的條件下，在營養培養基中培養所述宿主細胞，(C)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(d)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。本發明還提供了通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)在禁止芳基硫酸酯酶生產的營養培養基中和在有益于所述多肽表達的條件下，培養宿主細胞(b)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(c)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收多肽。本發明還提供了通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)用表達載體轉化宿主細胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在禁止生產芳基硫酸酯酶的營養培養基中和有益于所述多肽表達的條件下，培養所述宿主細胞，(c)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(d)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。在一個優選的實施方案中，所述多肽是酶。在一個優選的實施方案中，提供了用于制備酶制劑的工藝，所述工藝包括通過本文公開的工藝來制備酶，并從營養培養基或宿主細胞中回收酶制劑。進一步的公開在下文給出。發酵阻抑在一個優選的實施方案中，可以使用工業宿主菌株來生產酶制劑，所述菌株在限制或禁止生產芳基硫酸酯酶的生長培養基上培養。對Pseudomonasaeruginosa而言，已經描述了在含有過量硫酸鹽作為唯一的硫源的培養基上培養之后，不能檢測到顯著的芳基硫酸酯酶水平，而使用乙磺酸鹽作為唯一的硫源則導致生產顯著量的芳基硫酸酯酶活性(Beiletal.(1995)Eur.J.Biochem.229，385-394)。因此，可以想到，發酵培養基中硫酸鹽的過量也對工業上更重要的微生物中芳基硫酸酯酶活性的生產具有阻抑作用。因此，產酶生物在含有過量硫酸鹽作為硫源的培養基中的生長可導致優選的酶制品的生產，所述酶制品具有減少量的芳基硫酸酯酶活性。培養基中過量的硫酸鹽是指在微生物的生長完成后發酵液中仍然留有顯著量的游離硫酸鹽。本發明不要求硫酸鹽是生長培養基中唯一的硫源，只要在完全生長期期間，生長培養基中硫酸鹽的摩爾量高于任何其它含硫物質的摩爾量即可。另外，可以使用半胱氨酸或硫氰酸代替硫酸鹽作為芳基硫酸酯酶活性阻抑中優選的硫源。另外，在洗滌、儲存和其它下游加工步驟期間的所有溶液中，具有顯著量的硫酸鹽或另一阻抑硫源，用于防止發酵液中芳基硫酸酯酶活性的脫阻抑(甚至在發酵結束后)也是適當的。經典的菌株改進可以通過使用重組基因操作技術的遺傳工程，或對宿主進行誘變，或二者兼有，來獲得芳基硫酸酯酶缺陷菌株。對本發明的芳基硫酸酯酶的編碼基因的修飾或滅活可如下進行對親本細胞進行誘變，并選出下述突變體細胞，所述突變體細胞中表達芳基硫酸酯酶的能力與親本細胞相比被降低。誘變(其可以是特異的或隨機的)可以例如通過使用合適的物理或化學誘變劑、通過使用合適的寡核苷酸、或通過將DNA序列進行PCR產生的誘變來進行。另外，誘變可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行。適用于本發明目的的物理或化學誘變劑包括7或紫外(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲垸磺酸酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。使用這類試劑時，通常如下進行誘變在存在所選的誘變劑時在合適的條件下孵育待誘變的親本細胞，并選擇顯示降低的所述基因表達的突變體細胞。或者，可以使用遺傳技術(如雜交或交配和原生質體融合或誘導遺傳多樣性的任何其它的經典遺傳技術)來分離這類菌株。隨后可通過監測芳基硫酸酯酶的表達水平，選出獲得的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株。任選地，隨后通過測量要表達的給定的感興趣基因在宿主細胞中的表達水平，來選出芳基硫酸酯酶缺陷型菌株。可以通過直接測量培養液、培養上清液、通透化的細胞或細胞裂解物中的芳基硫酸酯酶活性，對具有降低的芳基硫酸酯酶活性的菌株進23行選擇。為了測量芳基硫酸酯酶活性，可能任選地將工業生產菌株的細胞通透化，用熒光底物(例如4-甲基傘形酮-硫酸酯(MUS))孵育直到底物被細胞吸收，并通過測量熒光的減少篩選具有更低的芳基硫酸酯酶活性的細胞。這類測量可以使用常規的熒光劑在個體培養物中直接進行，或優選地通過流式細胞儀以下述方式進行具有低熒光的細胞可以被選出并用于進一步的培養。這類步驟中使用的細胞可以在與熒光底物孵育之前被誘變或不被誘變。或者，可以通過選擇下述菌株來分離具有降低的芳基硫酸酯酶活性的菌株，所述菌株不能在以烷基酯的硫酸酯(例如甲苯基硫酸酯或乙磺酸鹽)作為唯一硫源的生長培養基中生長。對根據本發明的合適菌株的分離可能需要應用若干輪經典的遺傳技術，特別是在對不是單倍體，而是二倍體、非整倍體或具有不同的倍性的工業生產菌株中，例如許多工業酵母菌株的情況，或是含有編碼芳基硫酸酯酶的多個基因的工業生產菌株的情況，例如真菌的情況。重組DNA技術或者，可以使用重組DNA技術來構建具有降低量的芳基硫酸酯酶活性的工業生產菌株。用于基因滅活或基因打斷的若干種技術被描述于本領域中，例如一步基因打斷、標記物插入、定點誘變、缺失、RNA干擾、反義RNA及其它，并均可用于降低、抑制或打斷芳基硫酸酯酶活性的合成，從而獲得具有降低的芳基硫酸酯酶活性的工業生產菌株。通過改變指導芳基硫酸酯酶基因表達的調控序列來滅活芳基硫酸酯酶也是本發明的部分。其一個例子是通過基因打斷降低啟動子活性。可以使用現代遺傳修飾技術，來獲得重組的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株，優選地通過打斷編碼芳基硫酸酯酶活性的基因，更優選地通過向編碼芳基硫酸酯酶活性的基因中插入標記物，最優選地通過從基因組中去除部分或所有的芳基硫酸酯酶編碼區來進行。已經針對許多不同的微生物描述了進行這類基因滅活的方法，這也是本領域技術人員已知的(參閱即EP357127)，并被描述于實施例8中。芳基硫酸酯酶在突變體細胞中的表達可藉此被降低或被消除。根據使用這些技術被修飾的宿主菌株，可以將所述步驟重復數次，以去除所有或大部分的芳基硫酸酯酶編碼序列。對宿主基因如芳基硫酸酯酶的修飾或滅活可以通過確定的反義技術，使用與所述基因核苷酸序列互補的核苷酸序列來進行。更特別地，可以通過引入與所述核苷酸序列互補的核苷酸序列來降低或消除基因的表達，所述被引入的核苷酸序列可以在細胞中被轉錄并能夠與細胞中產生的mRNA雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，被翻譯的蛋白質的量藉此被降低或消除。表達反義RNA的例子由Ngiametal.(Appl.Environ.Microbiol.66:775-782,2000)和Zrenneretal.(Planta190:247-252，1993)提供。對宿主基因的修飾、下調或滅活可以通過RNA干擾(RNAi)技術(FEMSMicrob.Lett.237:317-324,2004)獲得。更特別地，可如下降低或消除絲狀真菌細胞對基因的表達將表達要被影響的核苷酸序列的相同的有義和反義部分克隆在彼此之后，之間帶有核苷酸間隔，將其插入表達載體中，并將所述表達載體引入細胞中，在所述細胞中雙鏈RNA(dsRNA)可以被轉錄并隨后加工為能夠與靶mRNA雜交的較短siRNA。dsRNA被轉錄后，小(21-23)核苷酸siRNA片段的形成會導致要被影響的mRNA的定向降解。特異mRNA的消除可以是多種程度的。可以使用WO2005/05672和WO2005/026356中描述的RNA干擾技術來修飾、下調或滅活宿主基因。已經通過上述任何方法被修飾或滅活，并且使用前文定義的相同測定測量時，在相同的條件下培養時與親本細胞相比生產更少的芳基硫酸酯酶活性的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株可以具有另一核苷酸序列。通過經典遺傳技術或重組DNA技術分離或構建的這類具有降低的芳基硫酸酯酶活性的工業生產菌株可以用于相關的工業工業中，所述工業工藝要求最終產物缺乏異味。優選地，這些菌株被用于生產工業相關的酶。更優選地，這些菌株被用于生產食品工業中使用的酶，進一步更優選地，這些酶被用于加工乳制品。最優選地，具有降低的芳基硫酸酯酶活性的這些工業生產菌株被用于生產乳糖酶。宿主菌株合適的宿主菌株優選地是原核微生物，例如細菌，或更優選地是真核生物，例如真菌，例如酵母或絲狀真菌，或植物細胞。來自S""7/^屬的細菌非常適合用作宿主，因為它們能夠將蛋白質分泌進培養基中。適合作為宿主的其它細菌是來自^w/tom3;cas和尸化i^omoww的細菌。用于表達編碼感興趣的酶的DNA序列的優選酵母宿主細胞是fecdawA^^^一。更優選地，酵母宿主細胞選自SaccWom戸scere由'ae、^7w少vmmyces/acto(也已矢口為A7w_yveraw_yc&smarx/anusvar./acfc)、i/a"se"w/a/o/j7wor/力a、尸/c//a/as/or/j、7iarraiWa禾口然而，用于表達酶最優選地是絲狀真菌宿主細胞。優選的絲狀真菌宿主細胞選自Js/e尸g///1^、7>7.c/2odenwa、i^i^"n."m、Z)^戶oro^7'c/jM淤、Penicil/ium、爿crewowz't/m、7VeM廠c^/ora、7^ermoa5cws、Afyce/io//tora、5^ora/n'c/mm、7Tn'e/aWa禾卩Ta/araw少ces屬。更優選地，絲狀真菌宿主細胞是ylsp^gZ〃w51o_yzae、J5/ergz'〃M51sq/ae或ylspez-gi〃i^mV^w/<ms的禾中或是來自爿5perg77/as組(如RaperandFennell,TheGenusAspergillus,TheWilliams&WilkinsCompany,Baltimore,pp293-344，1965所定義)的種。這些包括但不限于A/e/^'〃M5wz'ger、y^/e^g〃/iwa麗won'、爿5perg/〃wsw'fifw/aws、爿^ergZ〃t^y"/ow/cw51、爿^ergz'〃two，ae禾卩爿5perg/〃tw_/cwt/m，以及7WcAode廠maree-e/、^Fksarz'w/wgrawZwearw/M、尸em'c/〃/畫cA，ogewwm、Jcremow'wma/"6amewse、7Vewms/oracr^ma、Afyce/z'op/itora^zez-mop/n7i/m、5^oro^7'c/wmce〃w/op/zz7w附、Z)z、^orofn'cAwmdz'morp/os/onim禾口77'e/avZa/e/rasWs的禾中。本發明的范圍內優選的工業生產菌株的例子是真菌，如^^ergz7/M的種(尤其是EP-A畫184,438和EP-A-284，603中所述的)和7WcWe畫的種；細菌如的種(尤其是EP-A-134,048和EP-A-253,455中所述的)，牛寺另U是Sac/〃M51swZ)"fc、5ac7'〃ws/z'cAew(/brm^、5acz7/ws謡少/o/一eybc&m1、/^wfitowowos5^cz'es;和酵母例如《/w"eram;;ces的種(尤其是EP-A-096，430中如《/^yveram;;cas/acfc和EP-A-301，670中所述的)，SaccAaram少c&s的禾中如')Sacc/aram^ycescerev/w'ae或尸Zc/n'a;as/on's、//awse打w/aj!o/戸orp/ia、Ca"rfWfl或yiamwifl印o/,.cflo本發明最優選地涉及《/"少vwom;;c^/"cfe對缺乏芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶的生產。適用于以工業設置生產給定多肽或酶的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株已經被分離，其中令人驚奇的是在相同的培養條件下，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株生產與它們來源的野生型菌株至少相同量的多肽或酶。優選地，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在模型反應中檢測時(參閱實施例2中的實驗信息)，具有少于50。％的可檢測細胞內或細胞外芳基硫酸酯酶活性的菌株。更優選地，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是具有少于50%的細胞內芳基硫酸酯酶活性的菌株。更優選地，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是具有下述細胞內芳基硫酸酯酶活性的菌株，在模型反應中檢測時，所述活性少于它們來源的野生型菌株細胞內芳基硫酸酯酶活性的25%、優選地少于10%、更優選地少于5%、更優選地少于1%，最優選地在所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株中不能檢測到芳基硫酸酯酶活性。在本申請中，K.lactis菌株CBS2359被作為可以在/acto培養物中獲得的野生型芳基硫酸酯酶水平的參照，作為可以在K/"cto培養物中獲得的野生型多肽水平的參照，和作為可以在《./flcto培養物中獲得的細胞內芳基硫酸酯酶活性的參照。芳基硫酸酯酶缺陷型《./acto菌株被定義為在相同培養條件下生產比K/""/s菌株CBS2359更少的芳基硫酸酯酶活性的菌株。優選地，所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在模型反應中檢測時，具有比CBS2359的細胞內芳基硫酸酯酶活性的50%更少的《./acfc菌株。更優選地，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型K/^to菌株是具有細胞內芳基硫酸酯酶活性的菌株，所述活性在模型反應中檢測時少于它們來源的K/actoCBS2359菌株的細胞內芳基硫酸酯酶活性的25%、優選地少于10%、更優選地少于5%、更優選地少于1%，最優選地在芳基硫酸酯酶缺陷型《./Mto菌株中不能檢測到所述芳基硫酸酯酶活性。根據本發明一個優選的實施方案，使用的芳基硫酸酯酶缺陷型K/"cfc菌株已經通過應用本申請中下文定義的方法獲得。用于檢測多肽的多種系統是技術人員已知的。檢測系統包括用于檢測多肽或酶活性的任何可能的測定。以舉例的方式，這些測定系統包括但不限于基于色度計、光度計、熒光計、濁度計、粘度計、免疫學、生物學、色譜的測定法和其它可用的測定法。優選地，如果生產的多肽是酶，則通過在模型反應(參閱實施例2)中測量其活性來測量生產的活性酶的量。根據另一個優選的實施方案，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的特征在于下述事實當用包含多肽編碼基因的表達構建體轉化該菌株時，所述菌株至少生產其來源的野生型菌株在相同的培養條件下會生產的多肽量，所述野生型菌株也已經用與芳基硫酸酯酶缺陷型菌株相同的表達構建體轉化。優選地，本發明的芳基硫酸酯酶缺陷型菌株是在相同的培養條件下，生產與它們來源的野生型菌株相同量或更多量的給定多肽。更優選地，在相同的培養條件下，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株生產比它們來源的野生型菌株更多的給定多肽。其它天然的或異源的多肽和其它序列的生產根據又一實施方案，本發明涉及在宿主細胞中轉錄核苷酸序列的方法，其中所述被轉錄的序列編碼期望的多肽或者是功能性核酸分子，所述方法包括(a)在營養培養基中培養宿主細胞，所述宿主細胞包含(i)啟動子、(ii)編碼多肽的下游核苷酸序列、(iii)翻譯終止信號和(iv)轉錄終止信號，(b)在宿主細胞中表達多肽，和(c)可選地，從營養培養基或宿主細胞中回收多肽。生產的多肽可以對蛋白酶降解敏感。在該情況下，應使用蛋白酶缺陷型的突變體宿主細胞。優選地，根據本發明的方法來生產芳基硫酸酯酶缺陷型的菌株。可以使用本領域已知的方法在營養培養基中生長或維持芳基硫酸酯酶菌株，所述營養培養基適用于生產所期望的多肽。例如，細胞可以被涂布在固體培養基上，在搖瓶中搖動，在實驗室或工業發酵罐中在合適的培養基中和允許多肽表達和/或分離的條件下以小規模或大規模發酵(包括連續的、分批的、補料分批的或固體狀態發酵)培養。培養在包含碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中，使用本領域己知的步驟(參閱例如Bennett&LaSure,eds.，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)進行。合適的培養基可得自商業供應商或可以使用(例如在美國典型培養物保藏中心的產品目錄中)公開的成分制備。如果多肽被分泌進營養培養基中，則多肽可直接從培養基中被回收。如果多肽不被分泌，則其可以從細胞裂解物中回收。可以通過本領域已知的方法來分離得到的多肽。例如，可以通過常規步驟(包括但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發或沉淀)從營養培養基中分離多肽。然后可以通過本領域已知的多種步驟對被分離的多肽進行進一步純化，所述步驟包括但不限于色譜(例如離子交換、親合力、疏水、色譜聚焦或尺寸排除)、電泳(例如準備的等電位聚焦)、差異溶解度(例如丙酮或硫酸銨沉淀)或萃取(例如離液劑、鹽或pH)。參閱例如Janson&Ryden,eds"ProteinPurification,VCHPublishers,NewYork,1989。可以使用本領域已知對多肽特異的方法檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如，可以使用酶測定來測定多肽的活性。針對許多酶的用于測定酶活性的步驟是本領域己知的。多肽可以是任何多肽，無論其對所述芳基硫酸酯酶菌株來說是天然的或是異源的。術語"異源多肽"在本文中定義為不由野生型菌株生產的多肽。術語"多肽"在本文中不旨在表示特異長度的被編碼產物，因此包括肽、寡肽和蛋白質。編碼異源多肽的核苷酸序列可以得自任何原核生物、真核生物或其它來源，并可以是合成的基因。本文結合給定來源使用術語"得自"應當表示多肽由所述來源生產或由細胞生產，所述細胞中插入了來自所述來源的基因。期望的多肽可以是抗體或其抗原結合部分、抗原、凝固因子、酶、肽激素或其變體、受體或其配體結合部分、調節蛋白、結構蛋白、報告子、轉運蛋白、細胞內蛋白質、涉及分泌過程的蛋白質、涉及折疊過程的蛋白質、陪伴分子、肽氨基酸運載體、糖基化因子或轉錄因子。多肽可以被細胞外分泌進培養基中。對特定的酶沒有限制。優選的酶公開于說明書和實施例的剩余部分。或者，多肽可以是細胞內蛋白質或酶，例如陪伴分子、蛋白酶或轉錄因子。其一個例子由Puntetal.(Appl.Microbiol.Biotechnol.50:447-454,1998)描述。如果該肽(例如陪伴分子、蛋白酶或轉錄因子)己知是蛋白質生產中的限制因素的話，這可用于例如促進宿主細胞作為蛋白質生產者的效率。在本發明的方法中，芳基硫酸酯酶缺陷型菌株也可以被用于重組生產對細胞來說是天然的多肽。天然的多肽例如可以如下被重組地生產將編碼多肽的基因置于不同的啟動子調控下以增強多肽的表達，通過使用信號序列加速感興趣的天然多肽被運輸出細胞，和提高通常由細胞生產的編碼多肽的基因的拷貝數。在術語"異源多肽"的范圍內，本發明還包括了對細胞來說是天然的多肽的重組生產，包括的程度是這類表達涉及對細胞不適內源的遺傳元件的使用，或內源序列元件的使用，所述內源序列元件己經被操作為以通常不發生在絲狀真菌細胞中的方式起作用。用于分離或克隆編碼異源多肽的核苷酸序列的技術是本領域己知的，并包括從基因組DNA中分離、從cDNA制備，或其組合。在本發明的方法中，異源多肽也可以包括融合的或雜交多肽，其中另一多肽融合在多肽或其片段的N端或C端。通過將編碼一個多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合來生產融合的多肽。用于生產融合多肽的技術是本領域已知的，并包括將編碼多肽的編碼序列連接使得它們符合讀碼框(inframe)并且融合肽的表達位于相同的啟動子和終止子的調控下。雜種肽可包含來自至少兩個不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，所述多肽中一個或多個可以對突變體真菌細胞是異源的。編碼感興趣的異源多肽的經分離的核苷酸序列可以以多種方式被操作，以提供多肽的表達。表達應當被理解為包括涉及多肽生產的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。編碼多肽的核苷酸序列被插入載體之前的修飾可以是期望的或必需的，取決于表達載體。使用克隆方法用于修飾核苷酸序列的技術是本領域公知的。編碼要生產的多肽的DNA序列可以與適當的DNA調節區可操作地連接，以確保所述DNA序列的高表達水平，以及優選地所述多肽的高分泌水平。如果待生產的多肽對所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株來說是天然的，則優選使用其天然的分泌信號。或者，如果待生產的多肽對芳基硫酸酯酶缺陷型菌株不是天然的，則優選制造融合構建體，即所述融合構建體包含與待表達的異源基因融合的A^w&7/mw/gw的葡萄糖淀粉酶基因。根據本發明一個優選的實施方案，使用^^wp7/船o^zm的a葡萄糖淀粉酶基因的調節區。根據本發明的一個更優選的實施方案，使用A的葡萄糖淀粉酶基因的調節區。根據本發明的一個更優選的實施方案，使用K乳糖酶基因的調節區。DNA構建體也可包含可選擇的標記物。或者，可選擇的標記物可存在于第二個DNA構建體上。通過舉例的方式，這些標記物包括但不限于amdS(乙酰胺酶基因)，營養缺陷型標記物基因如argB、trpC或pyrG和提供針對例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性的抗生素抗性基因。優選地，標記物基因是來自J^erg"/wm^/fo朋的乙酰胺酶基因。更優選地，來自m'^/a似的乙酰胺酶基因與gpdA啟動子融合。更優選地，來自^s/^^7/mm'山/a朋的乙酰胺酶基因與5^cc/wram_ycescerew'w'aeADH1啟動子融合。我們開發了一種用于獲得芳基硫酸酯酶缺陷型菌株的方法，所述菌株適用于生產高產量的多肽并可用作工業設定中的多肽生產者。所述多肽對所述芳基硫酸酯酶缺陷型菌株來說可以是同源的或異源的。在異源多肽或酶的情況下，應用本發明方法的野生型菌株可以被較早地轉化，以表達編碼說明書中較早描述的這類多肽或酶的基因。這類芳基硫酸酯酶缺陷型菌株至少生產它們來源的野生型菌株在相同的培養條件下生產的多肽量。或者，芳基硫酯酶缺陷型菌株的構建可以在用下述基因轉化之前進行，所述基因編碼說明書中較早描述的這類多肽或酶。根據本發明的一個實施方案，因此，在具有降低的芳基硫酸酯酶表型的本發明的宿主細胞中生產多肽，所述細胞是親本細胞的突變體，所述親本細胞適用于生產適用于食品工業的酶，其中所述親本細胞包含編碼芳基硫酸酯酶的一個或多個核苷酸序列，而在相同的條件下培養時突變體細胞產生比親本細胞更少的芳基硫酸酯酶活性。本發明一方面公開的優選的特征也適用于本發明的其它方面。本發明現在將根據以下的實施例闡述但不受其限制。圖例圖1:在TOPO載體中克隆尺/"c&芳基硫酸酯酶基因的5，-側翼圖2:在TOPO載體中克隆K/acto芳基硫酸酯酶基因的3'-側翼圖3:在TOPO載體中克隆缺乏SacII位點的《./ac^芳基硫酸酯酶基因的3'-側翼圖4:將5'-側翼和amdS選擇盒組合在一個質粒中圖5:將3'-側翼和amdS選擇盒組合在一個質粒中圖6:芳基硫酸酯酶敲除構建體的最終構建圖7:顯示使用Dabcyl-Edans作為底物的內切蛋白酶譜。材料和方法活性測定芳基硫酸酯酶:使用p-硝基苯硫酸酯(得自Sigma)作為底物測定芳基硫酸酯酶活性。為了進行活性測量，將0.5ml底物溶液(100mMNaPi緩沖液，pH6.5中20mMp-硝基苯基硫酸酯)與含有芳基硫酸酯酶活性的0.5ml樣品溶液混合。將溶液在37'C孵育3小時。然后通過添加1.5ml0.5MNaOH終止反應。針對空白實驗測定410nm處的OD(lcm光路長度)，所述空白實驗中添加水代替樣品溶液。制備一種溶液作為參照，所述溶液中在用NaOH終止反應后添加酶。從酶有活性三小時的溶液測定的0D4K)中減去該參照溶液的OD41Q。芳基硫酸酯酶單位(ASU)被表示為OD41Q*10E6/hr的改變。對于液體產物而言，芳基硫酸酯酶活性可以被表示為每ml產物的OD4H)"0E6/hr的改變。對固體產物而言，芳基硫酸酯酶活性可以被表示為每g產物的OD41。*10E6/hr的改變。當感興趣的酶的活性已知時，芳基硫酸酯酶活性也可以被表示為每個單位感興趣的酶活性的OD4H^10E6/hr的改變。活性測定酸性乳糖酶:在pH4.5和37'C下將酸性乳糖酶與o-酰基苯基-Z3-D-半乳糖吡喃糖苷(Fluka73660)孵育15分鐘，產生o-硝基苯酚。通過添加10%的碳酸鈉終止孵育。在420nm波長下測量產生的o-硝基苯酚的消光系數，并定量酸性乳糖酶活性。一個酸性乳糖酶單位(ALU)是在測試條件下每分鐘生產1微摩爾o-硝基苯酚的酶的量。活性測定脯氨酸特異的內切蛋白酶:對來自A/^gz7/w"Zgw的脯氨酸特異的內切蛋白酶的過量生產和色譜純化如WO02/45524中所述完成。使用CBZ-Gly-Pro-pNA(Bachem，Bubendorf，瑞士)作為底物，在37。C下擰檬酸/磷酸二鈉緩沖液，pH4.6中測試Am'gw脯氨酸特異的內切蛋白酶活性。在405nM處分光光度計監測反應產物。405nm處吸光度隨時間的提高是對酶活性的一個度量。在完全相同的條件下測定具有接近中性pH最適度的脯氨酸特異的內切蛋白酶的活性，但是在該情況下，該酶反應在pH7.0進行。在對脯氨酸特異的內切蛋白酶(具有接近中性pH的最適度)特異的條件下測定脯氨酸特異的二肽肽酶如DPPIV的活性，但是在該情況下使用Gly-Pro-pNA作為底物。脯氨酸蛋白酶單位(PPU)被定義為在特定的條件下和0.37mM底物濃度下，每分鐘釋放1pmolp-硝基苯胺的酶量。活性測定羧肽酶:來自A的羧肽酶PepG("CPG，，；DalDeganetal.,Appl.Env.Microbiol.58(1992)2144-2152)的活性使用合成的底物FA-Phe-Ala(Bachem,Bubendorf,瑞士)作為底物確定。該底物的酶水解(1.5mMFA-Phe-Ala，在pH4.5和37。C下)導致吸光度的降低，所述吸光度在340nm的波長下監測。一個單位(CPGU)是在測試條件下每分鐘將340nm處的光密度降低一個吸光度單位所需的酶的量。活性測定氨肽酶。使用合成底物X-pNA來測定氨肽酶的活性，所述合成底物中pNA表示p-硝基苯胺，'X'表示氨基酸殘基。因為不同的氨肽酶可能具有不同的選擇性，因此氨基酸殘基'X'的性質取決于測試的氨肽酶活性的切割偏好。因此，'X'表示特異的氨肽酶具有最高偏好的殘基。因為許多氨肽酶對Phe顯示最高反應性，所以Phe-pNA代表了優選的底物。多種X-pNA底物可得自Bachem(Bubendorf，瑞士)。該底物的酶水解(1.5mM，在pH6.5和37'C下)導致顏色發生，所述顏色發生在410nm的波長下被監測。一個單位(APU)是在測試條件下每分鐘將410nm處的光密度提高一個吸光度單位所需的酶量。活性測定酯酶/脂酶:酯酶和脂酶催化游離脂肪酸從三甘油釋放。在本測定中，使用三丁酸甘油酯用作底物。為了確定酯酶/脂酶活性，用氫氧化鈉將從三丁酸酯釋放的丁酸滴定至7.5的恒定pH。因此，為了維持pH恒定而在每個時間單位中使用的氫氧化鈉的量與酶樣品的酯酶活性成正比。使用輻射計pH-stat單元和以下的試劑進行測量。阿拉伯膠溶液在溫和攪拌下，在1L容量瓶中將100g阿拉伯膠(Sigma)和500mgThymol(ICN)連續溶解在約800ml去礦質水中。用水補充至一升并混合。將溶液在4000rpm離心15分鐘。得到的阿拉伯膠溶液可以在冰箱中保存2個月，但是應當在使用前至少一天制備。氫氧化鈉0.02mol/l:將含有0.01mol/LNaOH的安瓿內含物定量地轉移進含有水的500mL容量瓶中。用水補充至體積并混合。SDS/BSA溶液在溫和攪拌下，將1gSDS(Merck)和1gBSA(fractionV，Sigma)溶解在約40mL水中。防止形成泡沫。在SDS和BSA完全溶解后用水將體積補充至1升。僅使用新鮮制備的溶液。底物乳劑在600mL玻璃燒杯中稱重50g甘油三丁酸酯，并添加300mL阿拉伯膠溶液。通過用UltraTurmx以最大速度攪拌5分鐘制備乳劑。用NaOH0.5mol/L將pH調節至7.5。為了測試具體酶樣品的酯酶/脂酶活性，稱重約1g酶樣品并溶于SDS/BSA溶液中。該樣品溶液應當具有等于約0.2到0.8NBGE/ml的最終酶含量(參閱其它)。將樣品溶液置于冰上直到測量開始。通過將以下溶液依次轉移進入加熱的反應器中進行測量20mL底物乳劑、5.0mL水(在40'C預熱)并允許預熱15分鐘，然后通過添加5.0mL的對照樣品或樣品溶液開始測量，并開啟輻射計pH-stat單元的VIT90酯酶程序。酯酶/脂酶單位(NBGE)被定義為在4CTC的溫度下和pH7.5下，在以下的步驟中每分鐘從甘油三丁酸酯釋放1/miol游離脂肪酸的酶量。實施例實施例1鑒定UHT奶中的異味化合物在無菌條件下將MaxilactLG5000(DSM，荷蘭)添加至半脫脂的UHT奶(FriescheVlag,荷蘭)中，達到每升10,000和40,000NLU的水平，并在室溫下孵育4天。在參照實驗中不添加Maxilact。通過品嘗小組評估樣品之前，通過每升半脫脂乳添加40,000NLU并在室溫下孵育18小時來制備新鮮的乳糖酶水解的奶樣品。在NIZOFoodResearch(荷蘭)使用SOIR步驟進行樣品分析，所述SOIR步驟是NIZOFoodResearch的常用步驟，其包括感覺和化學分析。直接在制備好的樣品上進行感覺分析，并將每個乳樣品的等分試樣以小部分冰凍在一25C下，以用于進一步的化學分析。通過9名成員的受過培訓的小組進行感覺分析。參照樣品被描述為煮過的，其它樣品被歸類為不標準的UHT奶。描述異味的主要屬性為化學的、藥的、尿/不潔的和穩定的/糞便。在接近室溫時用同時高真空蒸餾分離揮發性化合物，產生樣品的水樣提取物。然后使用動態頂空法(dynamicheadspace)將揮發性化合物從水樣提取物中分離，并在吸附劑上收集。使經分離的化合物進入利用熱解吸附的氣相色譜中并在GC柱上分離。由兩個受過訓練的鑒定者評價GC流出物(GC-嗅覺)并以氣味術語描述(嗅覺檢查法)。通過在動態頂空取樣期間使用兩種不同的吹掃時間(30分鐘和24小時)進行一式兩份的高濃度和低濃度GC嗅覺分析。隨后通過質譜法鑒定了在嗅覺測量分析期間顯示的峰(化合物)，所述峰對應于乳糖酶處理的UHT樣品的異味特性。可解釋異味原因的感興趣的化合物被鑒定為l)酯(丁酸乙酯)；2)硫化合物(二甲基硫化物、二甲基三硫化物和苯并噻唑)；3)硫酯(硫代乙酸甲酯、硫代丁酸甲酯)；4)1-辛烯-3-醇；5)2-壬烯醛；6)1>大馬烯酮(1>damascenone);7)冰片和8)p-甲酚。p-甲酚可來自乳中的綴合物。與最討厭的感覺屬性"藥物"相關的唯一化合物為p-甲酚。使用GC分析，通過向樣品中添加標準量的p-甲酚來測定樣品中的p-甲酚濃度。UHT奶樣品(4天孵育)中p-甲酚的濃度被評估為每升12/xg。這明顯高于空氣和水分別為1ppb和2ppb的香味閾值(Haetal，(1991)JDairySci74,3267-3274)。這還在通常存在于牛奶中的p-甲酚濃度范圍內。結果被奶中的重組實驗證實，證實p-甲酚會帶來經乳糖處理的UHT奶中的藥物異味。實施例2測定芳基硫酸酯酶和/3-半乳糖苷酶活性。使用p-硝基苯硫基(得自Sigma)作為底物測定芳基硫酸酯酶活性。為了活性測量，將0.5ml底物溶液(100mMNaPi緩沖液，pH6.5中20mMp-硝基苯基硫酸酯)與含有芳基硫酸酯酶活性的0.5ml樣品溶液混合。將溶液在37-C孵育3小時。然后通過添加1.5ml0.5MNaOH終止反應。針對空白實驗測定410nm處的OD(lcm光路長度)，所述空白實驗中添加水代替樣品溶液。制備一種溶液作為參照，所述溶液中在用NaOH終止反應后添加酶。從酶有活性三小時的溶液測定的0D41Q中減去該參照溶液的0D41Q。硫酸酯酶單位被表達為0D41()*10E6/hr和每NLU的改變。如下文所述測定樣品溶液的乳糖酶活性。使用硝基苯基-b-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)作為底物，根據FCC(fourthed，July1996,p801-802:Lactase(neutral)jS-galactosidaseactivity)中所述的步驟將乳糖酶活性測定為中性乳糖酶單位(NLU)。實施例3向UHT奶中添加芳基硫酸酯酶使用可商業獲得的芳基硫酸酯酶(Sigma,Aerobacteraerogenes,typeVI;4.9mg蛋白質/ml;Sigma定義的3.9芳基硫酸酯酶單位/mg蛋白質)在乳中進行異味測試。在該實驗中，將50mlUHT奶(Campina,荷蘭)與1ml酶溶液在3(TC孵育。異味發生后聞嗅樣品。典型的異味(其也在實施例1中針對用乳糖酶孵育過的UHT奶描述過)在2小時的孵育后明顯是可觀的。孵育17小時后該氣味更加強烈。顯然，芳基硫酸酯酶產生了與乳糖酶相似的異味。根據實施例1中所述發現，這可通過乳中從綴合物p-甲苯基硫酸酯中釋放了p-甲酚來解釋。也進行了下述實驗，其中添加酸性磷酸酯酶(小麥胚，Sigma,40ml乳中如Sigma定義的6個磷酸酯酶單位)或葡糖醛酸糖苷酶(來自五.co/Z，Sigma，每40ml乳中如Sigma定義的6350個葡糖醛酸糖苷酶單位)代替芳基硫酸酯酶。在這些孵育中未發生典型的異味。這提示了硫酸酯綴合物是牛奶中異味形成最為重要的綴合物，這與文獻發現一致(Lopezetal(1993)JAgricFoodChem.41,446-454)。結果不完全排除其它異味化合物的存在，所述其它化合物可由葡糖醛酸糖苷酶或酸性磷酸酯酶產生，但是顯然這些化合物沒有達到高于香味閾值的水平。實施例4異味測試UHT奶步驟將半脫脂的UHT奶(Campina，荷蘭)與20,000NLU/L乳在3(TC孵育48小時。通過無菌濾器在無菌條件下添加乳糖酶，以防止細菌感染。48小時后由訓練過的小組品嘗乳，并與在相同條件下孵育但未添加乳糖酶的乳溶液比較。簡言之，通過在品嘗之前添加5000NLU/L奶并在30'C孵育2小時來制備參照溶液。該甜奶被品嘗小組用作參照溶液。小組如下對異味計分空白乳設定為'-'。含有可注意到的但是輕微異味的低異味產物給予，+，，而含有更高量異味的產物被表達為'++'或'+++'。'+++'的標記指示高水平的異味，感覺到非常讓人討厭。用于表征異味的術語與實施例1中公開的相同。實施例5純化Klactis乳糖酶去除芳基硫酸酯酶活性。將可商業獲得的K/acto乳糖酶MaxilactLX5000(DSM，荷蘭)用水稀釋10倍，并應用于在55mMKPi(pH7.0)中平衡的Q-瓊脂糖柱(AmershamBiosciences)上。持續上樣直到在柱的流出液中檢測到乳糖酶活性。然后用4倍體積的55mMKPj(pH7.0)洗滌柱，隨后用含有0.16MNaCl的65mMKPi(pH7.0)洗脫乳糖酶。收集級分并測試乳糖酶活性。合并含有乳糖酶的級分，并上樣于在含有1MNaS04的55mMKPj(pH7.0)中平衡的丁基瓊脂糖柱(AmershamBiosciences)上。在存在1MNaS04(pH7.0)時將乳糖酶上樣在柱上直到在柱的流出液中檢測到乳糖酶。用4倍體積的含1MNaS04的55mMKPi(pH7.0)洗脫柱。使用15倍體積的inear梯度洗脫乳糖酶，所述梯度從含1MNaSCU的55mMKP;(pH7.0)到55mMKPi(pH7.0)。通過UV檢測(280nm)監測洗脫譜。收集級分并測定乳糖酶活性。將含乳糖酶的級分合并，省略在乳糖酶峰值(OD280nm)降低至最大峰值50%后收集的級分。這些級分的省略對于防止乳糖酶制劑被芳基硫酸酯酶污染是關鍵性的。乳糖酶的洗脫部分與芳基硫酸酯酶的洗脫重疊。通過超濾，在10k道爾頓濾器上將產物濃縮和脫鹽，并通過添加甘油至50%w/w來保存。實施例6經純化的乳糖酶中的蛋白酶水平使用具有通式Glu(EDANS)-Ala-Ala-Xxx-Ala-Ala-Lys(DABCYL)的一系列底物測定蛋白酶活性。(Xxx:20個天然氨基酸之任一)。底物得自PEPSCAN(Lelystad,荷蘭)，并且是內部淬滅的熒光底物。當這類肽底物被切割時，產生熒光信號。因此，熒光的出現表示存在內切蛋白酶活性。通過向200Ml下述溶液中添加50/il酶在96孔微孔滴定板中測定內切蛋白酶活性，所述溶液含有100mMTris-Bis(pH6.7)中50的底物。將反應混合物于4(TC在使用Magellan4軟件的TECANGenius微孔滴定板讀數器中孵育10分鐘。隨時間跟蹤熒光的發生(激發濾光片340nm，發射濾光片492nm)。蛋白酶活性被定量為熒光線的斜率，其被表達為RFU/分鐘/NLU。(RFU:相對熒光單位，如Genius裝置所給出的)。如實施例2所述測定酶樣品的NLU單位。圖7顯示了在Q-瓊脂糖柱上純化LX5000時蛋白酶活性的巨大降低。Q-瓊脂糖后合并的級分(實施例4)具有與初始材料(LX5000)相比低至少5-10倍因數的蛋白質活性。對使用的每種底物的RFU/分鐘/NLU<0.5的乳糖酶樣品(見圖1)被定義為具有低水平蛋白酶活性的制劑。，實施例7未經純化的和經純化的乳糖酶的比較對若干種乳糖酶制劑進行實施例4中所述的異味測試。乳糖酶制劑的芳基硫酸酯酶含量不同。對于每種制劑而言，至少使用兩個樣品；個體樣品在芳基硫酸酯酶活性上不同，活性范圍在表1的右列中指出。異味測試的結果在表1中給出。明顯地，芳基硫酸酯酶的活性水平與異味形成相關，低水平的芳基硫酸酯酶(19或更少，見表1)不引起異味形成，而提高的水平導致增加的異味形成。還很明顯的是Q-瓊脂糖后的乳糖酶制劑仍然顯示異味發生，盡管蛋白酶水平較低(見實施例5)。表1:多種乳糖酶制劑的異味發生。h具有高芳基硫酸酯酶活性的級分，選自實施例4中所述Q-瓊脂糖洗脫級分。2:8個芳基硫酸酯酶單位(如實施例2中所定義的)的水平是測定的檢測界限。<8表示未觀察到芳基硫酸酯酶活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>乳糖酶實施例8含有芳基硫酸酯酶活性的不同商業酶制劑從不同來源生產并通過不同加工途徑回收的多種酶制品被收集，并使用材料與方法章節中所述的測定法分析其芳基硫酸酯酶活性。獲得的結果(見表2)表明得自多禾中微生物如^s/erg/〃t^o^zae、X/t/jveramjces/^/^a""rn的酶制劑能夠被芳基硫酸酯酶活性嚴重地污染。這些酶制劑可有利地通過本發明的方法被純化。表2多種商業酶制劑中的芳基硫酸酯酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實施例9使用離子交換色譜從來自Jwerg/〃wm'ggr的脯氨酸特異蛋白酶中色譜去除芳基硫酸酯酶活性為了從Aw/gw分泌的脯氨酸特異的內切蛋白酶(WO02/046381)中去除芳基硫酸酯酶副活性，篩選了大量的色譜樹脂。因為發現蛋白酶和主要的由A"/gw分泌的芳基硫酸酯酶活性的等電點分開約0.5個pH，所以對允許兩種活性被可接受地分離，甚至是在大規模、工業條件下的色譜分離的確定是相當苛求的。最后，選擇了陽離子交換SP瓊脂糖6FF和疏水相互作用(HIC)樹脂丁基瓊脂糖6FF(AmershamBiosciencesEurope)用于進一步測試。兩種樹脂均在Tricom5/100柱(CV二2，2ml)中被測試，其中使用受UNICORN3.20控制的AKTAExplorer100或受UNICORN3.21控制的AKTAPurifier與FRAC-950級分收集器的組合來進行。洗脫后使用材料與方法章節中所述的方法，針對所有產生的級分檢測脯氨酸特異性內切蛋白酶活性和芳基硫酸酯酶活性。表3:進行SP-瓊脂糖-6FF色譜的條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>將對產色肽Z-Gly-Pro-pNA(Bachem，Bubendorf，瑞士)顯示脯氨酸特異活性的級分合并后，比較粗酶制劑和經色譜純化的酶制劑的芳基硫酸酯酶活性。結果是在顯示確切相同的脯氨酸特異活性(9PPU/ml)的制劑中，芳基硫酸酯酶活性從粗制劑中的3800*10E3單位/ml被降低至經色譜純化的制劑中的少于30*10E3單位/ml。實施例10使用疏水性相互作用色譜從來自Aspergillusniger的脯氨酸特異蛋白酶中去除芳基硫酸酯酶活性在以下條件下進行HIC色譜法。使用具有10PPU/ml活性的來自A.niger的脯氨酸特異內切蛋白酶的透析濾過物作為初始材料。用含有2MNa2S04(pH4.2，G=121mS/cm)的20mM檸檬酸緩沖液對該透析濾過物稀釋兩倍，隨后在上樣于柱上之前通過過濾(0.2pm)滅菌。表4:進行實施例10的純化的條件。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>作為將酶上樣在柱上后顯著拖尾的結果，需要長洗滌步驟來獲得基線分離。最后，可以用緩沖液B從柱上洗脫脯氨酸特異的內切蛋白酶。合并含有脯氨酸特異的蛋白水解活性的級分。盡管被稀釋了，但是如果計算回原始的蛋白水解活性的話，該經純化的材料仍顯示顯著降低的芳基硫酸酯酶活性，這表明，使用該疏水相互作用色譜方案將脯氨酸特異的蛋白酶活性和芳基硫酸酯酶活性有效地分離。此處還展示出在顯示確切相同的脯氨酸特異活性(9PPU/ml)的制劑中，芳基硫酸酯酶活性從粗制劑中的3800*10E3單位/ml被降低至經色譜純化的制劑中的少于30*10E3單位/ml。實施例11經純化的來自A.的脯氨酸特異內切蛋白酶產生酪蛋白水解產物而無異味為了測試經色譜純化的脯氨酸特異內切蛋白酶的性能，使用經色譜純化的和未經色譜純化的脯氨酸特異內切蛋白酶，在完全相同的方案中制備兩種酪蛋白水解產物。向含有100g/L酪蛋白酸鈉(MurrayGoldbem,新西蘭)和水的溶液中，添加枯草桿菌蛋白酶(Protex八L;25毫升/克蛋白質)并在6(TC下和不經調節的pH中孵育4小時。形成的沉淀在攪拌時緩慢溶解。最后，獲得帶有小量沉淀的澄清溶液。然后將溶液的pH調節至pH4.5，并將液體等體積分開。向這些體積之一添加每克酪蛋白水解物1PPU的粗Aw&w脯氨酰內肽酶；向另一體積中添加1PPU的經色譜純化的Am'gw脯氨酰內肽酶。孵育在55T:持續9小時，然后對兩個溶液進行10kDa的超濾。在進一步熱滅活步驟(120°C,5秒)和冷卻周期后，由5人小組評價兩種液體的味道和氣味，所述5人受過對乳水解產物中的異味和臭氣味進行檢測和分級的訓練。該小組在其結論中是一致的用粗脯氨酸特異的內切蛋白酶制備的水解產物具有特征性的、"家禽樣"("bam-like")的氣味和用經色譜純化的脯氨酸特異內切蛋白酶制備的制劑中缺少的味道。表5:實施例ll和13的結果概括<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例12色譜法從來自J幼^gz7/^m'g^的羧肽酶中去除芳基硫酸酯酶活性因為羧肽酶(i.e.p.4.5)和主要的由A.niger分泌的芳基硫酸酯酶(5.0和5.4的i.e.p.'s)密切接近，因此色譜分離這兩種酶證實是非常困難的。然而，以下的步驟允許我們獲得不含芳基硫酸酯酶活性的純凈羧肽酶。最為重要的是該方法相對簡單，從而其可以以工業規模進行。再次使用SP-瓊脂糖FF樹脂。在以下條件下進行色譜法表6:進行實施例12的色譜法的優選的條件<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>將粗酶應用于柱上后，用緩沖液A洗滌柱，以去除未結合的/輕微結合的污染物。最后，用緩沖液B洗脫羧肽酶。收集含有對生色肽FA-Phe-Ala-OH(Bachem，Bubendorf，瑞士)水解的活性的峰。在含有相當的羧肽酶活性(2060CPG/g;見材料與方法中對活性的定義)的羧肽酶制劑中，芳基硫酸酯酶活性從粗酶中的31200*10E3單位/ml降低至經純化的制劑中的10*10E3單位/ml。實施例13來自A.iiiger的經純化的羧肽酶加速Goiida乳酪的老化而不產生異味。對將奶去標準化，并從NIZO收集。使用NIZO方法制造Gouda乳酪。大致為初始添加后，攪拌15-20分鐘。然后添加粗制凝乳酶(reimet)，攪拌3分鐘并靜置(約45-50分鐘)。使用漸進的增加標度(gradualincrease)切割凝塊。這會耗費10分鐘并具有8.5的最終速度。轉動葉片并以11的速度再攪拌IO分鐘。排水直到桶中剩余120L。在55。C添加36L(剩余體積的30%)水以達到桶中35.5-35.7°C的最終溫度，同時以16的速度攪拌。以16的速度攪拌60分鐘。收集凝乳并靜置15分鐘。將凝乳分裝于模子(重量)上，并將填充好的模子靜置30分鐘。在0.7bar按壓30分鐘(第一次按壓后添加乳酪編碼(code))，1.2bar按壓30分鐘，然后在1.7bar再按壓30分鐘。每次按壓后翻轉凝乳。按壓后去除壓力并將乳酪在模子中靜置(在鹽水室中于13"C下過夜)。將乳酪從模子中取出并進入鹽水中30個小時并翻轉兩次以確保均一的鹽水浸泡。在13°C、88%濕度下熟化。該方法標準化為1.05的脂肪比蛋白質比例(等于約0.85的脂肪對酪蛋白)。巴氏滅菌后，將乳泵進200L乳酪桶中。使用Delvo-TECUX21A(1.5U;DSMFoodSpecialities,Delft,荷蘭)作為初始培養物和Maxiren600(55IMCU/Lmilk;DSMFoodSpecialities,Delft,荷蘭)作為粗制凝乳酶。將乳酪在鹽水中浸泡26小時并在13°C、88%RH下熟化。經純化的和未經純化的PepG與粗制凝乳酶一起以200CPGU/升乳的水平添加。在6周和24周的熟化后，由內部小組對來自每個乳酪桶中的代表性乳酪樣品分級。這些會議以圓桌的模式進行，這意味著分級者被告知試驗的細節，然后討論他們的發現，所述發現隨后被總結。表7:實施例13的結果6周(n=7)對照年輕的Gouda乳酪，無異味，少量酸味和黃油味經純化的PepG更成熟的Gouda乳酪，農舍類型味道，強烈氣味和更飽滿的氣味。未經純化的PepG類似經純化的PepG乳酪，僅味道中和品嘗后有苦味記錄表8:實施例13的結果24周(n=6)對照成熟的Gouda乳酪，有點咸經純化的PepG具有強烈味道的乳酪，接觸到甜味未經純化的PepG非常辛辣味道的乳酪，農舍乳酪，不平衡，異味發現添加經純化的和未經純化的PepG均導致明顯的作用。使用未經46純化的PepG的乳酪中記錄到的苦味記錄和不平衡被用于得出PepG應當被純化的結論。實施例14-15在下文所述的實施例中，如文獻(Sambrooketal.(2000)"MolecularCloning:alaboratorymanual",thirdedition,ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NewYork禾卩Innisetal.(eds.)(1990)"PCRprotocols,aguidetomethodsandapplications"AcademicPress,SanDiego)中所述，進行標準的分子克隆技術，包括核酸的分離和純化、核酸的電泳、酶修飾、核酸的擴增和/或切割、五."http://的轉化等。實施例14構建Kluweromvceslactis的芳基硫酸酯酶敲除菌株分離Kluyveromyceslactis染色體DNA:用單個尺/actoCBS2359菌落接種100mlYEPD(1%酵母提取物；1%Bacto-蛋白胨；2%葡萄糖)搖瓶，并在3(TC于280rpm搖動下孵育24小時。使用計數腔計數細胞量，并使用對應于4.1*108個細胞的相應培養物用量。染色體DNA的提取使用Q-BIOgene提供的快速DNA離心試劑盒(Cat#6540-600)。使用酵母方案使用一個勻化步驟，所述步驟使用速度設定6.0的FastprepFP120勻漿器(BIO101Savant)40秒。隨后將樣品在冰上冷卻并隨后使用相同的條件再次勻化。使用NanodropND1000分光光度計測定提取的基因組DNA的純度和產率。發現提取物的濃度為114納克/微升。發現A260/280和A260/230比分別為1.57和0.77。5'和3'芳基硫酸酯酶側翼的PCR擴增5'側翼芳基硫酸酯酶引物DFS-15289(5W):TCGCCGCGGTTGTCAACTATATTAACTATGDFS-15290(5'—3，)GATAGATCATAGAGTAACAATTGG3'側翼芳基硫酸酯酶DFS-15291(5W):GCAACTGAAGGTGGTATCAATTGDFS-15292(5W):CACCCGCGGCACCAGATAATGGAGGTAG3'側翼SacII—芳基硫酸酯酶DFS-15291(5，~>3，)GCAACTGAAGGTGGTATCAATTGDFS-15340(5W):CGGCACCAGATAATGGAGGT使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes,EspooFinland)擴增芳基硫酸酯酶側翼。根據廠商說明書，用Milli-Q水將《./actoCBS2359基因組DNA稀釋100倍，并使用5ml在50ml的PCR母液中作為模板。HybaidMBS0.2GPCR塊使用以下程序PCR程序5'側翼芳基硫酸酯酶第l階段(l個循環)98°C30s第2階段GO個循環)98°C10s60。C30s72。C30s第3階段(1個循環)72°C10分鐘4°C保持PCR程序3'側翼芳基硫酸酯酶第l階段(l個循環)98°C30s第2階段GO個循環)98°C10s72。C30s72。C30s第3階段(1個循環)72°C10分鐘4°C保持PCR程序3'側翼SacII—芳基硫酸酯酶第l階段(l個循環)98°C30s第2階段GO個循環)98。C10s65。C30s72。C30s第3階段(1個循環)72°C10分鐘4°C保持芳基硫酸酯酶敲除載體的構建.-使用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen;Part.no.45-0245)，根據廠商說明書，將獲得的5'-、3'和3'Sacir芳基硫酸酯酶側翼PCR片段克隆進pCR-BluntII-TOPO載體中。根據廠商說明書，將TOPO克隆反應轉化進OneShotTOP10化學感受態E.coli(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。針對5，TOPO、3，TOPO和3，SacirTOPO分別使用Mw"I、SacII、JTcml和i>al;Mwwl、5"acl1、五coRI和￡boRV;Mwwl、五coRI、五coRV和&cn，根據限制性酶切模式分析選擇正確的克隆。AmdS盒分離自pKLACl載體(NewEnglandBiolabs)。pKLACl質粒被轉化進化學感受態的&m-A/cm-co/z'細胞(NewEnglandBiolabs;Cat.NoC2925H)中，并分離未甲基化的質粒。使用GeneElutePlasmidMidiPrepKit(Sigma;Cat.No.NA0200),從含有50mg/ml卡那霉素的過夜LBC培養物中分離5，TOPO、3'TOPO、3'SacirTOPO和pKLACl的大量質粒DNA。用Sa/I和處al消化pKLACl載體，用J^al和Wol消化5'TOPO載體。使用NucleospinExtractIIKit(MacheryNagel)根據廠商說明書純化消化產物。使用Quick連接試劑盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)，根據廠商說明書，將消化的amdS盒連接進^feal/^ol消化的5'TOPO載體中。根據廠商說明書，將連接混合物轉化至OneShotTOP10化學感受態五.co"(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。使用Mw"I、五coRI和&CI，根據限制性消化模式分析，選擇爭取的克隆。這得到以下的載體5'amdSTOPO載體(圖1)。使用GeneElutePlasmidMidiPrepKit(Sigma;Cat.No.NA0200)根據廠商說明書，從含有50mg/ml卡那霉素的過夜LBC培養物中分離大量5'amdSTOPO質粒。用Mm"I和消化5'amdSTOPO載體并用Mwwl和EcoRI消化3，SacirTOPO載體。借助于凝膠提取分離并純化MimI"coRI3'SacII—TOPO片段。根據廠商說明書，在含有SYBR安全DNA染料(Invitrogen;Cat.No.S33102)的TAE緩沖液中在1%瓊脂糖上進行電泳。使用黑暗讀數透照燈(ClareChemicalResearch;CatNo.DR-45M)使片段顯影，將其從凝膠上切除，并根據供應商的凝膠提取方案，使用NucleospinExtractII試劑盒(MacheryNagel;Cat.No.740609.250)，從瓊脂糖中提取。用和Acl消化5'amdSTOPO載體，并根據供應商的PCR純化方案使用NucleospinExtractII試劑盒(MacheryNagel)純化。隨后使用Shrimp堿性磷酸酶(Roche;Cat.No.1758250)根據廠商說明書將Munl/AscI消化的5'amdSTOPO載體脫磷酸化。根據廠商說明書，使用Quick連接試劑盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)，將MmwI/五coRI3，SacirTOPO片段連接進脫磷酸化的Munl/Ascl消化的5，amdSTOPO載體中。根據廠商說明書，將連接混合物轉化進化學感受態的dam-A/cm-五.co/Z細胞(NewEnglandBiolabs;Cat.NoC2925H)中。使用￡coRI和五t力RV，根據限制性消化模式分析選擇正確的克隆。這得到了以下的載體5'flmJS3，SacirTOPO載體。根據廠商說明書，使用GeneElutePlasmidMidiPrep試劑盒(Sigma;Cat.No.NA0200),從含50mg/ml卡那霉素的過夜LBC培養物中分離大量的3，SacirTOPO載體。用^&al消化5'amdS3'Sacir載體。用^&al和5^el消化3，TOPO載體。根據廠商說明書，使用NucleospinExtractII試劑盒(MacheryNagel)純化消化產物。如上所述借助于凝膠提取分離^"IA^el3'TOPO片段。根據廠商說明書使用Shrimp堿性磷酸酶，Roche(Cat.No.1758250)將消化的5'amdS3，Sacir載體去磷酸化。根據廠商說明書，使用Quick連接試劑盒(NewEnglandBiolabs;Cat.No.M2200S)將J^alAS^el3，片段，連接在去磷酸化的消化的5'amdS3'Sacir載體中。將連接混合物轉化進OneShotTOP10化學感受態E.coli(Invitrogen;Part.no.44-0301)中。使用M/el、&I、五coRI、SacII、&d根據限制性消化模式分析選擇正確的克隆。這得到最終的K/"cto芳基硫酸酯酶敲除載體(圖3)。根據廠商說明書，使用GeneElutePlasmidMidiPrep試劑盒(Sigma;Cat.No.NA0200),從含有50mg/ml卡那霉素的過夜LBC培養物中分離大量的芳基硫酸酯酶敲除載體。用&cII消化K/acto芳基硫酸酯酶敲除載體，使得可獲得缺乏TOPO載體部分的線性的敲除盒。根據廠商說明書使用NucleospinExtractII試劑盒(MacheryNagel)純化消化產物。用芳基硫酸酯酶敲除載體轉化《./"ctoCBS2359將尺.CBS2359的100mlYEPD培養物在3(TC下于280rpm搖動培養24小時。使用該培養物接種100ml的YEPD培養物，所述培養物在相同的條件下培養直到達到0.5和0.8之間的OD610。借助于在1559g和4'C下離心5分鐘來收集細胞。用50ml無菌的電穿孔緩沖液(EB)(10mMTrispH7.5、9.2%(w/v)蔗糖、1mMMgCl2)在4'C洗滌細胞沉淀物。將細胞沉淀物在室溫下重懸于含25mMDTT和20mMHEPES緩沖液pH8.0的50mlYEPD中。將細胞在3CTC孵育30分鐘，不搖動。借助于在1559g和4'C離心5分鐘來收集細胞，并用10ml冰冷的EB洗滌。借助于在1559g和4。C下離心5分鐘，將細胞再次沉淀并重懸于0.1ml冰冷的EB中。將細胞懸浮液分布在1.5mleppendorf管中的40微升等分試樣中。向一個細胞的等分試樣中添加0.2-1.0微克(l-5微升)的線性敲除構建體，通過吸打混合并在冰上孵育15分鐘。將細胞-DNA混合物添加至冰冷的具有2mm裂隙尺寸的電穿孔管(BTX;Part.No.45-0125)中。在由GenePulser(BioRad，ModelNo.1652077)和PulseControler(BioRad，ModelNo.1652098)組成的BioRad電穿孔儀上進行電穿孔，使用以下設定1000V、400Ohm和25pF。電穿孔后立刻添加1mlYEPD并將細胞轉移至無菌的12ml管中并在搖動培養箱中在3(TC孵育2小時。在1559g將細胞沉淀5分鐘并在生理鹽水溶液(0.85%(w/v)氯化鈉)中洗滌。將細胞再次沉淀并重懸于1ml生理鹽溶液中。將若干個25pl、50^和100pl的等分試樣如不在選擇性amdS瓊脂平板上1.25%(w/v)瓊脂、1.17%(w/v)酵母碳基、30mM磷酸鹽緩沖液pH6.8和5mM乙酰胺。將拼版在3(TC孵育2天，隨后在室溫下孵育2天。通過將菌落劃線在YEPD瓊脂平板上，使得可出現單菌落，并在3(TC孵育24小時來選擇和純化菌落。使用菌落PCR測試這些單菌落中定向整合的敲除構建體，所述PCR使用靶向amdS盒和整合的敲除構建體下游的寡核苷酸。將菌落材料懸浮于20mMNaOH，0.2%(w/v)中，并在98"C孵育5分鐘。用水將細胞懸浮液稀釋2倍，并直接2.5微升直接用作25微升PCR反應中的模板，所述PCR反應根據廠商說明書使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes;EspooFinland;產品編號F-530S)。Fw3，amdS:GACAATTGATACCACCTTCAGTTGRv下游CTGGGAAATGTGGTGACTCCATA靶向PCR的程序第l階段(l個循環)98°C30s第2階段GO個循環)98°C10s68。C30s72。C30s第3階段(1個循環)72°C10分鐘4°C保持在1%瓊脂糖凝膠上分析PCR，并選擇顯示清晰的被擴增條帶的定向轉化體。芳基硫酸酯酶敲除菌株被命名為2359AARY1-10并儲存直至進一步使用。實施例15檢測2359AARY中的芳基硫酸酯酶活性母菌株(Motherstrain)CBS2359和菌株2359AARY均在搖瓶中于100mlYEP+2%半乳糖中在30。C下培養3天。通過在1559g和4"下離心5分鐘收集生物質。用冰冷的水將生物質洗滌兩次，以去除培養基部分。根據廠商(Pierce)說明書，用酵母蛋白質提取試劑(Y-PER)處理酵母生物質，以提取細胞內酶如芳基硫酸酯酶。本領域技術人員應當明白其它酵母裂解方案可以用于提取芳基硫酸酯酶活性，如用玻璃珠機械剪切或酶處理，以用例如Zymolyase溶解細胞壁(參閱即GloverandHames,DNAcloning2-apracticalapproach,IRLPress1995)。使用實施例2中描述的方法，在提取物中測量芳基硫酸酯酶。從該實驗中顯而易見當母菌株含有可估計的量的芳基硫酸酯酶活性時，在2359AARY菌株中不能檢測到該活性。根據實施例2在該提取物中測量0-半乳糖苷酶(乳糖酶)活性時，在野生型菌株CBS2359和突變體菌株2359AARY之間檢測不到乳糖酶活性差異，顯示突變體菌株的芳基硫酸酯酶活性被特異地打斷。突變體菌株可用于以工業規模制造事實上缺乏芳基硫酸酯酶活性的乳糖酶制劑。權利要求1.乳糖酶，其包含相對每NLU乳糖酶活性而言少于40個單位芳基硫酸酯酶活性。2.根據權利要求1的乳糖酶，其包含相對每NLU乳糖酶活性單位而言少于30個單位的芳基硫酸酯酶活性，更優選地相對每NLU乳糖酶活性而言少于20個單位的芳基硫酸酯酶活性，最優選地相對每NLU乳糖酶活性而言少于IO個單位的芳基硫酸酯酶活性。3.根據權利要求1或2的乳糖酶，其為細胞內生產的乳糖酶。4.根據前述權利要求任何一項的乳糖酶，其為中性乳糖酶，優選地為《./flcto乳糖酶。5.根據前述權利要求任何一項的乳糖酶，其具有pH-6和pH=8之間的pH最適度。6.根據前述權利要求任何一項的乳糖酶，其具有每NLU乳糖酶活性少于0.5RFU/分鐘的蛋白酶活性。7.包含權利要求1到6中任一項的乳糖酶的組合物。8.乳制品，其包含權利要求1到6中任一項的乳糖酶或權利要求7的組合物。9.生產乳制品的工藝，所述工藝包括向包含乳糖的乳制品中添加權利要求1到6中任一項的乳糖酶或權利要求7的組合物。10.生產下述乳制品的工藝，所述乳制品沒有芳基硫酸酯酶產生的異味，所述工藝包括使用權利要求1到6中任一項的乳糖酶或權利要求7的組合物。11.純化含乳糖酶的酶制劑的工藝，所述工藝包括使用色譜法從乳糖酶中分離芳基硫酸酯酶。12.—種工藝，其包括用酶制劑處理底物，其中所述酶制劑基本不含芳基硫酸酯酶。13.根據權利要求12的工藝，其中所述酶制劑是根據權利要求36到43中任一項的酶制劑。14.根據權利要求10或13的工藝，其中所述工藝包括通過根據權利要求23到25中任一項或權利要求34或35的工藝獲得所述酶制劑。15.根據權利要求10到14中任一項的工藝，其中所述底物是蛋白質性質的底物。16.根據權利要求10到15中任一項的工藝，其中所述底物含有用硫酸酯基團取代的烷基苯酚。17.根據權利要求10到16中任一項的工藝，其中所述底物含有乳蛋白，例如酪蛋白和/或乳清蛋白。18.根據權利要求10到17中任一項的工藝，其中所述底物為奶、經發酵的乳制品，例如酸奶、乳清、水解產物，和/或肉。19.根據權利要求10到18中任一項的工藝，其中所述處理期間所述底物中芳基硫酸酯酶水平為每升底物至多500*10E3芳基硫酸酯酶單位，優選地每升底物至多250*10E3、優選地至多100*10E3、優選地至多50*10E3、優選地至多25*10E3芳基硫酸酯酶單位。20.根據權利要求10到19中任一項的工藝，其中所述酶制劑包含乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。21.根據權利要求10到20中任一項的工藝，其為用于制備營養制品(例如乳制品)的工藝。22.可以通過根據權利要求10到21中任一項的工藝獲得的制品。23.用于制備酶制劑的工藝，所述工藝包括純化粗酶制劑，所述粗酶制劑含有感興趣的酶和芳基硫酸酯酶，其中芳基硫酸酯酶與所述感興趣的酶分離。24.根據權利要求23的工藝，其中所述純化導致芳基硫酸酯酶活性降低至少50%、優選地至少80%、更優選地至少90%、更優選地至少95%、更優選地至少99%。25.根據權利要求23或24的工藝，其中所述純化通過色譜，優選地在單一色譜分離步驟中進行。26.生產下述宿主細胞的工藝，所述宿主細胞是芳基硫酸酯酶缺陷菌株，所述工藝包括將生產芳基硫酸酯酶的培養物置于下述條件下，所述條件下，所述培養物的部分被修飾，以形成芳基硫酸酯酶缺陷的宿主細胞，并分離所述宿主細胞。27.根據權利要求26的工藝，其中使用誘變條件，優選地使用隨機誘變條件，例如物理或化學誘變。28.根據權利要求26的工藝，其中使用重組遺傳操作技術，優選地使用一步基因打斷、標記物插入、定點誘變、缺失、RNA干擾、反義RNA。29.通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)在有益于多肽表達的條件下，在營養培養基中培養芳基硫酸酯酶缺陷型宿主細胞(b)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(c)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。30.通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)用表達載體轉化芳基硫酸酯酶缺陷型宿主細胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在有益于所述多肽表達的條件下，在營養培養基中培養所述宿主細胞，(c)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(d)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。31.通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)在禁止芳基硫酸酯酶生產的營養培養基中和在有益于所述多肽表達的條件下，培養宿主細胞(b)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(c)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收多肽。32.通過下述方法生產多肽的工藝，所述方法包括(a)用表達載體轉化宿主細胞，其中所述載體表達所述多肽，(b)在禁止生產芳基硫酸酯酶的營養培養基中和在有益于所述多肽表達的條件下，培養所述宿主細胞，(c)在所述宿主細胞中表達所述多肽，和(d)可選地，從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收所述多肽。33.根據權利要求29到32中任一項的工藝，其中所述多肽是酶。34.用于制備酶制劑的工藝，所述工藝包括通過根據權利要求33的工藝來制備酶，和從所述營養培養基或從所述宿主細胞中回收酶制劑。35.根據權利要求23到25中任一項或權利要求33或34的工藝，其中所述酶是乳糖酶、蛋白酶、脂酶或酯酶。36.能夠通過根據權利要求23到35中任一項或權利要求35的工藝獲得的酶制劑。37.根據權利要求12到36中任一項的酶制劑，其中所述酶制劑包括乳糖酶、蛋白酶、脂酶和/或酯酶。38.包含羧肽酶的酶制劑，其含有相對于每CPG而言少于10000個單位的芳基硫酸酯酶活性。39.根據權利要求38的酶制劑，其含有相對于每CPG而言少于1000個單位、優選地少于100個單位、優選地少于50、優選地少于10個單位的芳基硫酸酯酶活性。40.包含脯氨酸特異蛋白酶的酶制劑，其含有相對于每PPU而言少于300*10E3個單位的芳基硫酸酯酶活性。41.根據權利要求40的酶制劑，其含有相對于每PPU而言少于100*10E3個單位的芳基硫酸酯酶。42.包含乳糖酶的酶制劑，所述酶制劑含有相對于每NLU的乳糖酶活性而言少于40個單位的芳基硫酸酯酶活性。43.根據權利要求42的酶制劑，其含有每NLU乳糖酶活性少于30個單位的芳基硫酸酯酶活性，更優選地每NLU乳糖酶活性少于20個單位的芳基硫酸酯酶活性，最優選地每NLU乳糖酶活性少于IO個單位的芳基硫酸酯酶活性。44.根據權利要求36到43中任一項的酶制劑用于制備乳制品的用途。45.根據權利要求36到43中任一項的酶制劑用于預防或減少異味發生的用途。全文摘要本發明描述了一種細胞內生產的乳糖酶，其包含相對于每NLU的乳糖酶活性而言少于40個單位的芳基硫酸酯酶活性。本發明還提供了包括用酶制劑處理底物的工藝，其中所述酶制劑基本不含芳基硫酸酯酶。文檔編號A23C9/12GK101316928SQ200680044411公開日2008年12月3日申請日期2006年11月28日優先權日2005年11月28日發明者彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾,路泊·伊登斯,阿伯圖斯·阿拉德·蒂克·范,馬克西米利安·彼得·馬莉亞·斯瓦夫·德申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司