專利名稱：豬白細胞介素－4基因抗病制劑的制備和使用技術的制作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學具體涉及殼聚糖納米顆粒包裝藏豬白細胞介素-4基因抗感染DNA制劑的制備及應用技術。
背景技術：
防治畜禽疾病感染的傳統方法是藥物治療和疫苗免疫。由于長期使用化學藥物和抗生菌來治療疾病，藥物的“選擇壓力”，導致病原抗性品系的出現、傳播及擴散，產生了眾多藥源性疾病和細菌對抗生素的耐藥性問題，使藥物療效降低乃至失敗。而且大量使用藥物也造成體內蓄積，畜產品質量降低，人食用后也損害健康。目前由于過度依賴抗生素控制感染性疾病，導致病菌耐藥性問題。近十多年來細菌對抗生素的耐多藥、全耐藥現象蔓延加劇，造成許多感染性疾病難以控制，嚴重威脅著畜牧業的健康發展及人類食品安全。目前迫切需要開拓全新的抗感染技術及藥物，有效增強動物免疫抗感染能力，克服濫用抗生素的危害。
全新的“第三代免疫增強劑”為解決這一問題帶來了新的希望。免疫增強劑能提高機體特異和非特異的免疫防御能力，增強機體識別、殺滅和清除病原及異已物質的能力，并且在機體免疫功能低下或處于抑制狀態時，重建免疫功能，提升免疫水平，從而保證機體健康。第三代免疫增強劑是經歷了第一代外源性化學藥物分子和植物源分子的免疫增強劑，以及“細胞因子”類物質的第二代免疫增強劑，發展起來的一類新型免疫增強劑。第三代免疫增強劑利用現代生物工程技術，將免疫調節效應很強的細胞因子基因克隆入高效真核表達載體，構建重組真核質粒，將其有效轉染導入機體細胞，使之持久穩定表達出所需的細胞因子，增強其濃度，從而能夠特異高效而持久地增強機體免疫防御能力，達到經濟防治目前難以控制的病毒，細菌性傳染病和寄生蟲病的目的；并且預防條件性病原造成難以控制的復雜感染和疾病。近年來，人們對于用細胞因子表達性質粒直接轉染動物方面進行了研究，取得了許多結果。其特點是這些細胞因子可以在動物體內表達，達到免疫刺激增強作用，并且有容易生產，易純化，易保存，作用持久，理化性質穩定等特點。所以，構建高效重組細胞因子表達質粒作為新型抗感染制劑是一個有經濟價值和社會效益的方法。必將首先在動物醫學及保健方面獲得廣泛應用，有力推動各類動物傳染性疾病的預防和治療，保障畜牧業的順利發展和人類健康及食品衛生安全。
白細胞介素4(IL-4)是由CD4+T細胞亞群、B細胞、肥大細胞等分泌的多效性細胞因子，概括起來，主要在下述幾個方面發揮重要作用(1)調節B細胞的生長分化及其對抗原刺激的應答，包括增殖和分泌抗體，參與Ig類別轉換(IgE生成)；(2)促進B細胞表達CD和MHCII類分子；(3)刺激T細胞生長分化和殺傷性T細胞的生成；(4)是巨噬細胞(Mφ)和肥大細胞的激活因子；(5)是Mφ的趨化因子；(6)抑制Mφ分泌IL-6，IL-1，TNF，促進IL-1ra的產生；(7)與細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)有關；(8)免疫佐劑作用；(9)能誘導造血細胞的分化和維持其生存。IL-4又名B細胞生長因子(B cell growth factor，BCGF)、B細胞化因子γ(B cell differentiating factorγ，BCDFγ)、B細胞刺激因子1(B cell stimulating factor-1，BSF-1)、T細胞生長因子II(T cell growth factor II，TCGF-II)和肥大細胞生長因子II(mast cell growthfactor II，MCGF-II)。
IL-4可以作用于T細胞、B、細胞胸腺細胞、肥大細胞、巨噬細胞等多種靶細胞，激活的B細胞產生的抗體主要是IgG1和IgE，是機體液免疫的重要調節因子。IL-4作為體液免疫的重要調節因子，其表達型質粒作為分子免疫增強劑的研究也取得了一些進展。將IL-4插入到RSV-LTR表達載體，以DNA免疫的形式與鑰孔藍蛋白(KLH)注射小鼠，結果注射IL-4表達載體的小鼠應答明顯高地對照組，且IL-4有選擇性地刺激IgG1的作用。IL-4與HIV-1DNA共同免疫小鼠，使得DCS(郎罕氏細胞)具有強的Th2型免疫應答反應。將IL-4基因與抗AID的編碼猿猴免疫缺陷病毒(SIV)Gag蛋白的基因共注射時能促進更強的Th2型反應。Lee(1999)用IL-4表達型質粒DNA疫苗共同免疫小鼠，測得其抗體反應水平明顯提高。在針對免疫缺陷的糖尿病、關節炎等疾病的基因治療中，IL-4作為分子免疫佐劑顯示了一定的作用。在糖尿病患者體內，IL-4分泌異常，對小鼠共注射編碼IL-4基因和IL-10基因的質粒能抑制糖尿病的惡化，降低小鼠體內葡萄糖的濃度。Chang等比較了IL-4和γ干擾素受體基因在糖尿病治療中的作用，結果表明共注射編碼IL-4/IgG1的質粒比共注射編碼γ-IFN受體/IgG的質粒更有效，而且具有劑量低、無免疫原性等優點。Wolfe還將IL-4表達型質粒通過口服途徑給藥于患糖尿病的動物，能增加免疫治療的安全性(Wolfe T，2002)。將編碼鼠IL-4基因的腺病毒注射小鼠腳踝，可減緩關節炎癥狀，有望成為基因治療關節炎的新手段。吳丹(1999)將豬IL-4與豬囊尾蚴保護性抗原cC1進行融合，以融合蛋白形式在體內表達，可以增加抗原的免疫原性，通過IL-4的作用還可以促進抗原提呈和抗體應答，增強機體的保護性免疫效應。
在DNA免疫的載體中，將編碼抗原的基因與細胞因子基因共表達，不僅能增強體液免疫和細胞免疫，還能誘導直接的Th1型和Th2型反應。Hornef等將IL-2、IL-4及γ-IFN基因分別與編碼結腸耶氏菌素60KD熱休克蛋白的基因構建于同一載體共免疫小鼠，能使小鼠抵御結腸耶氏菌的攻擊，并且克服了常規佐劑的副作用，提高了機體免疫力。Park等構建了IL-4基因和編碼呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的融合載體免疫小鼠，與對照組相比，IL-4基因增強了特異性抗RSV-F的抗體表達。
IL-4基因在腫瘤治療方面也顯示了廣闊的前景。Kimura等嘗試利用細胞因子的基因(如IL-2，IL-4)來治療胰腺癌，在以小鼠為動物模型階段取得了一些結果。將IL-4基因克隆到逆轉錄病毒載體上轉染C6神經膠質瘤細胞，降低了腫瘤原性，腫瘤細胞的生長被有效的抑制。Broberg等將Th2型細胞因子IL-4與單純性皰疹病毒載體重組后注射患腦脊髓炎小鼠，消除了腦脊髓炎癥狀，防止脊髓受到巨噬細胞滲透，預防了脫髓鞘。Kim等分別將編碼人免疫缺陷病毒EnV、Rev和猴免疫缺陷病毒Gag及Pol蛋白的基因與IL-4基因共注射恒河猴，實驗結果表明IL-4能明顯增強恒河猴特異性抗原的免疫應答。Poliani等把IL-4基因插入單純皰疹病毒載體中，治療恒河猴急性腦脊髓炎取得了一些效果。
由于IL-4在機體體液免疫應答和造血調控中發揮重要作用，而且隨著對IL-4作用機制的進一步認識，IL-4可能會顯示出更多的研究和應用價值。
藏豬主要繁衍、棲息在西藏高原，是我國特有的珍稀物種，是經高寒地區牧民長期馴養而形成的一種能適應高寒氣候、耐粗性、抗逆性強的獨特地方豬種；其肉質鮮美，具有較高的經濟價值。目前國內外均未見有關藏豬白細胞介素-4(IL-4)基因及其應用的研究報道，因此藏豬IL-4基因抗感染DNA制劑的制備及應用技術具有廣闊的應用前景，可望發展成新型抗感染分子制劑用于提高豬抗傳染性疾病的免疫應答能力，防治動物疾病的感染。
因免疫途徑和免疫方式不同，所涉及的抗原呈遞細胞、抗原呈遞方式均有不同，故可產生不同類型、不同強度的免疫應答。由于肌肉注射主要通過Th1細胞激活方式誘導免疫應答，效率較低，需要注射的DNA劑量較大。為了進一步提高實驗動物對質粒DNA的免疫應答水平，必須采用有效的免疫投遞系統來增強免疫效果。殼聚糖是天然生物多糖甲殼質的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內多種酶類降解、降解產物安全無毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨特的聚陽離子特性，已有的研究結果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來，在基因轉染表達研究領域已出現了基于殼聚糖的納米顆粒系統。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復合物用于基因運載和轉染表達時，能有效攜帶目的基因進入靶細胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質釋放明顯延長。初步研究結果發現基于殼聚糖的顆粒系統在生物醫學方面具有廣闊的應用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝藏豬白細胞介素-4基因作為抗感染DNA制劑的制備及應用技術，在科研，動物保健，和產業化方面具有潛在的巨大價值。
本發明首次將克隆的藏豬白細胞介素-4基因構建入真核表達載體，以殼聚糖納米顆粒分子對藏豬白細胞介素-4基因真核表達質粒進行分子包裝，并將其應用于增強動物免疫應答和免疫保護力，發現對動物免疫機能和免疫保護效應有顯著的增強作用，可用作高效安全和效應持久的新型動物免疫增強劑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題具體包括藏豬白細胞介素-4基因真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對藏豬白細胞介素-4基因真核質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用技術。主要包括下列步驟1、藏豬白細胞介素-4基因的克隆應用淋巴細胞分離技術，分離了藏豬外周血液淋巴細胞進行體外培養，在Con A的刺激下培養36h后，提取培養的淋巴細胞總RNA，應用RT-PCR擴增出藏豬淋巴細胞白細胞介素-4基因的cDNA，克隆到pMD18-T載體上，并進行了序列分析；將得到的序列在GenBank和EMBL數據庫中進行了同源比較，證實本實驗克隆到了藏豬白細胞介素-4的cDNA。
2、藏豬白細胞介素-4基因的真核表達與活性檢測將藏豬白細胞介素-4基因克隆到真核分泌型表達載體VR1020上，命名為VTPIL-4；重組質粒轉染Cos7細胞株后，RT-PCR結果顯示轉染細胞24小時總RNA中已含有目的cDNA片段對應的mRNA；豬淋巴母細胞增殖實驗證明VTFIL-4在轉染Cos7細胞株后，能夠表達出有生物活性的豬PIL-4蛋白質，對豬淋巴細胞具有增殖作用；此結果表明已成功構建了能正確表達藏豬IL-4的真核表達質粒，其表達產物具有正常的生物學活性，為研究其體內基因轉移表達的免疫調節作用奠定了堅實基礎。
3、納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；將VTPIL-4質粒溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復合物微粒。即是VTPIL-4質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
4、納米顆粒的形態、粒徑及Zeta電位測定取少量VTPIL-4質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米顆粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
5、藏豬白細胞介素-4基因抗病制劑的應用昆明鼠120只，隨機分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠。
注射裸質粒免疫組每只小鼠接種相應質粒30pmol；注射殼聚糖包裝質粒的免疫組每只小鼠接種相應包裝的質粒6pmol。大腸桿菌、沙門氏菌和支原體疫苗特異性小鼠分組見表2，疫苗免疫組每只小鼠均按豬免疫劑量1/50接種以及相應裸質粒30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應質粒6pmol。非特異免疫小鼠分組除不注射疫苗外，其它均以特異疫苗免疫組相同。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，檢測了殼聚糖包裝VTPIL-4質粒及未包裝VTPIL-4質粒對小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，并對常規疫苗在不同形式的VTPIL-4質粒分子免疫佐劑協同作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統地分析。在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實驗小鼠，觀察發病情況；49天時對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測免疫保護效應。
結果發現以VTPIL-4質粒殼聚糖納米顆粒作為免疫增強劑時，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平比對照組顯著升高；同時，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞數量也明顯增加；與常規疫苗聯合使用，同樣可以顯著提高實驗動物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平，免疫細胞數量；對疫苗的特異性免疫應答也顯著加強。殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒后，雖然DNA用量僅為未包裝組的1/5，但免疫組體液免疫和細胞免疫應答水平也顯著提高，與對照組差異顯著(P＜0.05)。其原因可能是殼聚糖納米顆粒包裹質粒后，有效地防止了DNA被體內其它組織蛋白的吸附和體液核酸酶的降解，同時又促進質粒進入細胞，使質粒DNA緩慢釋放，將目的基因DNA轉運到靶細胞中，發揮基因轉錄表達，分泌更多的細胞因子，增強對免疫應答的上調效應，提高體液和細胞免疫水平。
這些結果表明VTPIL-4質粒能顯著提高小鼠的免疫應答水平，以殼聚糖納米顆粒作為免疫投遞系統，具有減少質粒用量、降低成本、增強體液免疫和細胞免疫的優點。結果提示殼聚糖納米顆粒包裹VTPIL-4質粒可提高機體細胞免疫和體液免疫水平，增強免疫應答及免疫保護力，可望作為有效的新型抗感染免疫調節劑，具有潛在的廣泛應用前景。


表1非特異性免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表2疫苗免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表3VTPIL-4重組質粒真核表達產物對豬淋巴細胞增殖刺激活性檢測結果(0D570)圖1TPIL-4RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1PIL-4cDNAMDL2,000圖2pMDT18-IL4BamHI酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)SpMDT18-IL4/BamHIMDL2,000圖3重組VTPIL-4質粒的菌落PCR篩選1陰性菌落 2、3陽性菌落 MDL2,000圖4VTPIL-4 BamHI酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1VR1020質粒 2VTPIL-4/BamHI 3VR1020/BamHI MDL2,000圖5PIL-4在VR1020插入方向酶切電泳圖譜(1.2％瓊脂糖凝膠)1pVTPIL-4/BglII和PmacI雙酶切正向重組子2pVTPIL-4/BamHI3pVTPIL-4/BglII和PmacI雙酶切反向重組子Mφ174圖6真核表達RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1VR1020 224h 348h 472h MDL2,000圖7VTPIL-4質粒殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(放大倍數50000)圖8殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖9非特異性免疫組小鼠血清中IgG含量圖10非特異性免疫組小鼠血清中IgA含量圖11非特異性免疫組小鼠血清中IgM含量圖12非特異性免疫組小鼠血清中IL-2含量圖13非特異性免疫組小鼠血清中IL-4含量圖14非特異性免疫組小鼠血清中IL-6含量圖15非特異性免疫組小鼠白細胞數量變化圖16非特異性免疫組小鼠單核細胞數量變化圖17非特異性免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖18非特異性免疫組小鼠中性粒細胞數量變化圖19疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖20疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖21疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖22疫苗免疫組小鼠血清中沙門氏菌特異性抗體含量圖23疫苗免疫組小鼠血清中支原體特異性抗體含量圖24疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖25疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖26疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖27疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖28疫苗免疫組小鼠白細胞數量變化圖29疫苗免疫組小鼠單核細胞數量變化圖30疫苗免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖31疫苗免疫組小鼠中性粒細胞數量變化具體實施方式
1、藏豬IL-4基因(TPIL-4基因)的克隆從健康藏豬耳靜脈無菌采血10mL，分離藏豬外周血淋巴細胞，加入10ug/ml Con A刺激，在CO2培養箱中37℃培養72h，分時段(24、48、70h)提取藏豬總RNA，設計一對藏豬IL-4基因cDNA擴增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCC TAT TCA TGG GTC TCA CCT C引物2CGG GAT CCT CAG CTT CAA CAC TTT以總RNA為模板，在50μl反應體系中加10×RT-PCR反應緩沖液5μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)1μl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，引物1和引物2各20uM，總RNA1-2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為50℃，30min；94℃，2min，然后進行30個PCR循環(94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s)后繼續在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉化感受態細胞，篩選和鑒定含重組質粒的菌落，小規模提取質粒DNA，酶切及電泳觀察質粒DNA，確定重組質粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一樣后(附圖1、2)，進行序列測定。序列測定結果采用DNAtools 5.1進行分析(基因序列表見說明書13頁)。
用M13通用引物對含有目的基因片斷的pMTPIL-4質粒進行正反向測序，通過重疊序列的拼接，得到了完整的TPIL-4基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1對其編碼氨基酸進行了分析，cDNA長度為423個堿基，開放閱讀框為402個堿基，編碼134個氨基酸，分子量為15.0kD。
2、藏豬IL-4基因真核表達質粒的構建及表達活性檢測將pMTPIL-4質粒用BamHI酶切后，將TPIL-4片段與BamHI酶切、脫磷酸化的VR1020質粒DNA在T4 DNA連接酶作用下進行連接反應。連接產物轉化DH5α感受態細胞，轉化子經菌落PCR鑒定，得到含有目的PIL-4片段的重組質粒的菌落，菌落PCR圖見附圖3。
得到含TPIL-4的重組質粒后，利用BamHI酶切可見413bp片段，根據VR1020質粒沒有PmacI位點，有BagII位點，而PIL-4片段上沒有BagII位點，有PmacI位點，因此，用PmacI和BagII雙酶切重組質粒DNA，通過觀察其酶切片段的大小來判定TPIL-4片段的插入方向，篩選出正確方向插入的重組表達質粒，命名為VTPIL-4，其BamHI酶切及PmacI和BagII雙酶切電泳圖譜見附圖4、5。
使用Life Technology公司Lipofect AMINETMReagent進行Cos7細胞的轉染，參照試劑說明書進行。培養48小時，檢測基因表達產物活性。以RT-PCR檢測基因在真核細胞中表達，結果顯示只有VTPIL-4轉染的Cos7細胞總RNA出現PIL-6的特征帶，Cos7細胞、VR1020轉染的Cos7細胞總RNA不出現TPIL-4的特征帶。表明VTPIL-4重組質粒在Cos7細胞中能表達基因的片段相應的mRNA。RT-PCR結果見圖6。
制備豬淋巴母細胞，MTT比色法檢測TPIL-4生物學活性，分別使用轉染后24小時、48小時和72小時細胞培養液上清進行分析，結果見附圖表3。此結果表明VTPIL-4轉染后24小時、48小時和72小時的細胞培養液上清中表達了具有生物學活性的PIL-4，對豬淋巴細胞具有增殖刺激作用。
3、納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)將質粒DNA溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復合物微粒。即是質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
4、納米顆粒的形態、粒徑及Zeta電位測定取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米顆粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見說明書附7)。納米顆粒度分析儀測定結果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190(見說明書附8)；zeta電位為+25.6mV，說明納米顆粒表面帶有正電荷。
5、實驗動物的免疫昆明鼠120只，隨機分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠。
注射裸質粒免疫組每只小鼠接種相應質粒30pmol；注射殼聚糖包裝質粒的免疫組每只小鼠接種相應包裝的質粒6pmol。大腸桿菌、沙門氏菌和支原體疫苗特異性小鼠分組見表2，疫苗免疫組每只小鼠均按豬免疫劑量1/50接種以及相應裸質粒30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應質粒6pmol。非特異免疫小鼠分組除不注射疫苗外，其它均以特異疫苗免疫組相同。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。動物免疫分組見說明書附圖表1，表2。表1為非特異性免疫分組情況，表2為疫苗免疫分組情況。
6、殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒對小鼠非特異性免疫應答的影響小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測各項免疫指標。
(1)IgG、IgA及IgM的測定含量實驗鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結果見說明書附圖9、圖10、圖11。從圖可見，小鼠在注射VTPIL-4質粒后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著增高；殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒后，雖然DNA用量僅為未包裝組的1/5，但免疫組血清中的IgG、IgA、IgM含量仍顯著提高，與對照組差異顯著(P＜0.05)。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對照組血清中IgG、IgA、IgM含量有顯著增加。
(2)細胞因子的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實驗鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，觀測小鼠細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖12、圖13、圖14。由圖可知，VTPIL-4質粒免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對照組明顯升高(P＜0.05)，殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒組與未包裹組相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差異不顯著(P＞0.05)，但包裝組質粒用量比未包裝減少了4/5，節約了質粒用量。
(3)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖15、16、17、18。免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化是考察小鼠細胞免疫應答的一個重要指標。從圖可見VTPIL-4質粒免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白細胞、單核細胞、淋巴細胞數量較對照組都有顯著增加，中性粒細胞在攻毒前也較對照組明顯升高，但攻毒后中性粒細胞數量則較對照組低；用殼聚糖納米微粒包裝質粒后免疫小鼠，發現在使用DNA量上減少5倍的情況下，可以同樣達到的提高免疫細胞數量的效果。
7、殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒對疫苗特異性免疫應答的調節(1)IgG、IgA及IgM的測定含重實驗鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定小鼠血清中1gG、1gM和IgA含量。
結果見說明書附圖19、20、21。圖19、20、21顯示了VTPIL-4質粒與支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的變化情況。結果表明在同時免疫了VTPIL-4質粒后，實驗動物的IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著提高。其中殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒后，再與支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合注射小鼠，結果顯示這種免疫方法雖然在DNA的使用量上只有未包裝組的1/5，但是可以協同疫苗免疫，其IgG、IgA、IgM含量較對照組明顯增加(P＜0.05)，與未包裝免疫鼠差異不顯著(P＞0.05)。
(2)特異性抗體的測定制備支原體抗原、沙門氏菌抗原、大腸桿菌抗原包被Costar酶標板，實驗鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法測定小鼠血清中支原體特異性抗體、傷寒特異性抗體、大腸桿菌特異性抗體含量。
結果見說明書附圖22、23、24。圖22、23、24顯示了支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗與相應質粒聯合免疫動物后實驗動物特異性抗體變化情況。結果顯示動物在免疫一周后，就檢測到特異性抗體的產生；在同時免疫VTPIL-4質粒后，實驗小鼠的上述特異性抗體比對照組顯著提高(P＜0.05)。用殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒后與疫苗聯合注射免疫小鼠，在核酸用量僅為未包裝組1/5的情況下，VTPIL-4質粒對提高實驗動物對疫苗特異性免疫應答效果同樣顯著。
(3)細胞因子的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實驗鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，觀測小鼠細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖25、26、27。圖結果顯示VTPIL-4質粒與支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對照組高。殼聚糖納米顆粒包裹VTPIL-4質粒組與未包裝組相比較，包裝的DNA只有未包裹組1/5的用量，但是對免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差異不顯著(P＞0.05)。(4)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖28、29、30、31。用支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合VTPIL-4質粒免疫小鼠，小鼠外周血免疫細胞數量的變化情況結果同樣發現肌肉注射VTPIL-4質粒對實驗小鼠外周血免疫細胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細胞數量較對照組低。用殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL-4質粒，不僅可以將DNA用量減少至未包裝劑量的1/5，還有效增加了小鼠外周血免疫細胞數量。
8、攻毒小鼠器官病變的檢測小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88和K99口服攻毒實驗小鼠，觀察小鼠的生長情況；49天時用常規方法對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
攻毒3周后剖解實驗小鼠發現，VTPIL-4質粒接種小鼠均健康存活，肝、脾、十二指腸、等消化道和呼吸道組織器官未出現明顯病變，而對照小鼠均發病，精神萎靡，被毛聳立，糞便稀軟，帶棕褐色解剖觀察發現，對照組小鼠均出現以胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等為主的病變。
9、數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
藏豬白細胞介素-4基因序列<110>四川大學<120>豬白細胞介素-4基因抗病制劑的制備和使用技術<160>1<210>1<211>423<212>DNA<213>藏豬(Sus scrof，Tibet)<220>
<400>1agagctctat tcatgggtgt cacctcccaa ctgatcccaa ccctggtctg cttactggca 60tgtaccagca acttcgtcca cggacacaag tgcgacatca ccttacaaga gatcatcaaa 120accttgaaca ttctctcagc gagagagaac tcgtgcatgg agctgcccgt gacggacgtc 180tttgctgccc cagagaacac gacggagaag gaaaccttct gccgggcctc gactgtgctt 240cggcacatct acagacacca cacgtgcatg aagagcctcc tgagcggact tgacaggaac 300ctgagcagca tggcaaacat gacctgttct gtgcatgaag ccaagaagag cactttgaaa 360gacttcttgg aaaggctaaa gacgattatg aaggagaaat actcaaagtg ttgaatctct 420aga 423
表1非特異性免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表2疫苗免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表3VTPIL-4重組質粒真核表達產物對豬淋巴細胞增殖刺激活性檢測結果OD570

權利要求
1.豬白細胞介素-4基因抗病制劑的制備和使用技術，其特點包括藏豬白細胞介素-4基因的克隆及其真核表達質粒(VTPIL-4)的構建，殼聚糖納米顆粒對藏豬白細胞介素-4基因真核表達質粒進行分子包裝制備DNA納米顆粒制劑，并將此DNA制劑應用于增強豬機體免疫應答及抗感染免疫力的應用技術。
2.根據權利要求1所述的藏豬白細胞介素-4基因抗病制劑的制備，其特征在于所述的DNA制劑的基質是以分泌型質粒VR1020為載體構建的藏豬白細胞介素-4基因真核表達質粒VTPIL-4。
3.根據權利要求1所述的藏豬白細胞介素-4基因抗病制劑的制備，其特征在于所述的DNA制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯法制備的殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權利要求1要求的殼聚糖包裝藏豬白細胞介素-4基因真核表達質粒VTPIL-4納米顆粒作為豬用新型抗感染分子免疫調節劑的應用技術，其特征在于以下幾方面(1)以小鼠為實驗動物，將制備的殼聚糖VTPIL-4質粒納米顆粒以肌肉注射的投遞方式免疫小鼠，檢測了殼聚糖包裝VTPIL-4質粒及未包裝VTPIL-4質粒對小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，并對常規疫苗在不同形式的VTPIL-4質粒分子免疫佐劑協同作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統地分析；(2)以制備的殼聚糖VTPIL-4質粒納米顆粒單獨免疫實驗動物，結果表明殼聚糖VTPIL-4質粒納米顆粒能有效提高實驗動物細胞和體液免疫水平，增強其非特異性免疫力；(3)以制備的殼聚糖VTPIL-4質粒納米顆粒聯合疫苗(支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實驗動物，結果表明殼聚糖VTPIL-4質粒納米顆粒可顯著增強實驗動物對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應。
全文摘要
該發明所屬技術領域1.生物技術，2.分子免疫學。本發明克隆了藏豬白細胞介素－4基因，并構建了其真核表達質粒(VTPIL－4)，以分子量為150000、脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備了殼聚糖納米顆粒，提供了利用殼聚糖納米顆粒對質粒VTPIL－4進行分子包裝以制備抗感染DNA制劑的方法，公開了該納米顆粒DNA制劑作為新型抗感染分子免疫增強劑的應用技術。該方法包括殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL－4質粒，將此制備DNA納米顆粒制劑以肌肉注射方式單獨或協同疫苗免疫實驗動物，增強實驗動物的特異和非特異性細胞和體液免疫機能，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VTPIL－4質粒作為新型動物抗感染分子免疫增強劑的應用技術。
文檔編號A61K48/00GK1692942SQ200410040700
公開日2005年11月9日 申請日期2004年9月17日 優先權日2004年9月17日
發明者武梅, 高榮, 李惠, 吳凱源, 付滿良, 楊毅, 章歡, 劉狄廣, 程馳, 李化 申請人:四川大學