專利名稱：豬白細胞介素－2基因抗感染制劑的制備及應用的制作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學具體包括豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對藏豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用技術。
背景技術：
白細胞介素-2(IL-2)是細胞因子網絡中關鍵性的細胞因子，主要由輔助T細胞、NK細胞和LAK細胞分泌；它能激活并促進T細胞、NK細胞、B細胞的分化成熟，誘導淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)活性，還能促進許多淋巴因子如干擾素，腫瘤壞死因子等的合成與釋放以及抗體生成，顯著增強機體免疫功能。IL-2已用于預防和治療一些常規方法難以治療的，如腫瘤、病毒感染等免疫抑制、免疫機能低下的疾病，如惡性黑色素瘤及腎細胞癌，其他腫瘤有神經膠質瘤、膀胱、卵巢腫瘤，視神經細胞癌、肺、頭頸部、乳腺腫瘤、淋巴瘤、結腸癌及內皮癌等(Baigrie RJ，1992)。在獸醫方面因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亞單位苗的免疫效果而倍受重視，展現出廣闊的應用前景。
IL-2跟IL-2R結合后才發揮作用，它與活化T細胞表面的IL-2Rα鏈、β鏈和γ鏈結合。首先β鏈和γ鏈結合成中等親和力受體，再與低親和力的α鏈受體結合，成為高親和力受體。IL-2與三聚體結合后，發生信號傳導，引起NK細胞與單核細胞的增殖反應及活化CTL。其中的信號傳導機制尚不清楚，可能與一種酪氨酸激酶的激活相關。另外，IL-2Rα鏈易從細胞上脫落成可溶性IL-2Rα，可與細胞表面IL-2受體競爭型IL-2，對IL-2的生物學活性發揮起抑制作用。
IL-2的主要生物學活性包括1刺激T細胞生長IL-2最重要的作用是誘導T淋巴細胞增殖(從G0期進入S期)和分化。IL-2對T細胞的作用還包括增強CTL的細胞毒活性，增加細胞內pH，促進細胞移動，增強細胞間的接觸和誘導細胞分泌細胞因子(IFN-γ、IL4、TNF和CSF等)。
2誘導細胞毒作用(1)接受了抗原預刺激信號的CD8+T細胞可以受IL-2的作用活化CTL，發揮細胞毒作用；在一定條件下，CD4+T細胞也可受IL-2的誘導而具有殺傷作用。
(2)NK細胞是唯一正常情況下表達IL-2R的淋巴細胞，因此始終對IL-2保持反應性。然而靜止NK細胞上只表達IL-2R的β鏈和γ鏈，對IL-2的親和力低，只能對高濃度的IL-2發生反應。一旦NK細胞活化，就表達IL-2R的α鏈，成為高親和力的受體；大劑量IL-2誘導的LAK活性主要來源于NK細胞。
(3)使T細胞和NK細胞產生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促進非特異性細胞毒性；還可誘導產生某些B細胞生長因子以及造血因子等，從而發揮相應的生物學作用。
3對B細胞的作用IL-2對B細胞的生長及分化均有一定的促進作用。較高濃度的IL-2可誘導B細胞生長繁殖，促使抗體分泌，并誘使B細胞由分泌IgM向著分泌IgG2轉換。
IL-2除了支持B細胞生長外，還能促進免疫球蛋白(IgM和IgG)的分泌，誘導J鏈合成從而加速IgM的裝配和分泌。
4對巨噬細胞的作用高劑量的IL-2能激活單核巨噬細胞增殖和分化，并增強單核巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的作用。單核-巨噬細胞受到IL-2的持續作用后，其抗原遞呈能力、殺菌力、細胞毒性均明顯增強，分泌某些細胞因子的能力也得到加強。
IL-2還能誘導NK細胞增殖，增強NK細胞的活性，誘導LAK細胞和TIL，并刺激它們產生細胞因子。
現在IL-2重組蛋白是應用較廣泛的細胞因子免疫增強劑。重組人IL-2能提高傷寒桿菌活苗和莢膜多糖亞單位苗的免疫效果；重組牛IL-2與牛皰疹病毒I型活苗一起使用，血清中中和抗體滴度比單獨使用疫苗組提高6倍；用牛皰疹病毒糖蛋白亞單位苗免疫牛，并注射IL-2，可顯著提高特異性抗體滴度，特異性細胞毒反應和特異性淋巴細胞增殖反應；重組牛IL-1、IL-2能促進牛病毒性腹瀉死苗的免疫效果；IL-2分別于狂犬病疫苗或瘧疾疫苗聯合使用，對相應抗原的攻擊有保護作用。Ramshaw等(1981)、Flexner等(1987)先后報道將小鼠或人IL-2cDNA與含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重組，獲得表達IL-2的重組病毒。將這種重組病毒與不含IL-2基因的痘病毒同時接種裸鼠，結果顯示，IL-2的插入并不影響HA的表達水平及免疫原性，但可以提高裸鼠的抗病力。Hazama等(Hazama et al.，1993)將IL-2基因與牛單純性皰疹病毒糖蛋白D基因融合，真核細胞內表達融合蛋白，免疫小鼠后攻毒。結果該融合蛋白可以完全保護小鼠免疫病毒攻擊，而以氫氧化鋁為佐劑但不含IL-2的重組糖蛋白只產生部分保護，IL-2在體內的半衰期也因此延長大約4倍。這些結果表明采用此種方式獲得，是研制新一代基因工程苗的另一途徑。
rIL-2能顯著增強人體免疫功能，只要每天注射10μg-100μg的rIL-2，四周后，NK細胞的高親和受體即可從10％升至60-80％，能大大增強其免疫功能(Akuffo H，Kaplan G，etal.1990)，說明rIL-2是良好的免疫治療因子，對維持人體正常健康以及防病治病有重要的作用。用逆轉錄病毒載體插入IL-2基因，再轉化肝癌細胞株HAC，從而使之能持續分泌IL-2。將此IL-2基因轉化了的HAC去接種大鼠腹腔或皮下，結果使動物生存期延長，田體積縮小，這些實驗結果，說明IL-2的基因治療在動物模型實驗中取得了明顯的效果(王立群，鄭仲承，1996)。
rIL-2對感染性疾病有較好的治療作用。rIL-2對麻瘋病的治療有很好的療效，每天注射兩次，每次10μg，經8天的療效，可相當于WHO使用MDT一年的療效；有人發現，rIL-2對結核桿菌(TB)有很強的抑制作用，對小鼠接種TB5或15天后，每天肌肉注射0.5-1.0萬IU的rIL-2共10天，然后觀察脾臟中TB細菌數目，結果rIL-2對TB的抑制作用能達到99％(Flexner C，Hugin A，et al，1987)；近年來性病有蔓延趨勢，尖銳濕疣過去在性病中居第4位，現在上海的統計上升到第二位，它是由乳頭狀瘤病毒感染所致，可用激光治療，但復發率高達30-60％，用rIL-2合劑肌肉注射與激光治療相結合，可完全防止復發，療效幾乎100％。對AIDS病患者，使用低劑量rIL-2(10萬IU/天)，治療一個月，也獲得一定的效果。rIL-2對嚴重結合免疫缺陷癥(SCID)也有一定療效(McElrach MJ，et al，1990)。
以上rIL-2的治療作用，均由于rIL-2增強免疫功能所致，也證明用小劑量rIL-2能增強免疫功能，可產生良好的療效。
rIL-2對腫瘤有較強的治療作用。肌注rIL-2能增強癌癥患者的免疫功能。在rIL-2的臨床癌癥患者中，大部份患者的免疫功能經rIL-2治療而增強，rIL-2的這種免疫功能對防止癌癥患者在手術、放化療后的復發，轉移而延長病人生命，有一定的作用。rIL-2與LAK合用治療癌癥，兩者療效均達50％，采用局部動脈灌注rIL-2及異體LAK，治療肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌共268人，灌注682例次，總有效率36.5％(肝癌38％)，癥狀改善率68.3％(肝癌70％以上)。
此外，IL-2有明顯的鎮痛作用。實驗結果表明結果IL-2的鎮痛作用非常明顯(Li JZ，ZhouDH，et al.1993)，用電生理方法也得到證實(Zhao ZQ，Yang XY.1994)。故IL-2的鎮痛現象，已明確無誤，在臨床應用IL-2時，它一般能使病人疼痛癥狀減輕，生活指標提高，可能與IL-2的這一鎮痛作用有關。
總之，白細胞介素-2(interleukin 2，IL2)具有廣泛的生物學活性，對免疫系統和免疫應答具有十分重要的調節效應，已在抗腫瘤與病毒病方面顯示較好的療效。在動物醫學上因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亞單位苗的免疫應答而倍受重視，顯示出廣闊的應用前景。但直接注射IL2時，因其體內的存留時間較短，大劑量重復給藥不僅費用高，而且常伴有較重的毒副作用，因而尋找高效安全、效應持久和經濟價廉的新型實用制劑，一直是研究IL2等細胞因子提高機體免疫應答的熱點應用研究領域。
殼聚糖是天然生物多糖甲殼質的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內多種酶類降解、降解產物安全無毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨特的聚陽離子特性，已有的研究結果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來，在基因轉染表達研究領域已出現了基于殼聚糖的納米顆粒系統。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復合物用于基因運載和轉染表達時，能有效攜帶目的基因進入靶細胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質釋放明顯延長。初步研究結果發現基于殼聚糖的顆粒系統在生物醫學方面具有廣闊的應用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2制備DNA制劑，并將其應用于提高機體細胞和體液免疫水平、增強抗感染能力的應用技術，在科研，醫療，動物保健，和產業化方面具有潛在的巨大價值。
本發明首次制備了包裹豬IL2基因(VPIL2)的殼聚糖納米顆粒分子，以其分子包裝豬IL2基因真核表達質粒VPIL2，發現對動物免疫機能和免疫保護效應有顯著的增強作用，可用作高效安全和效應持久的新型動物免疫增強劑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題具體包括豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對豬白細胞介素-2基因真核質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的應用技術。主要包括下列步驟1、豬白細胞介素2基因的克隆應用淋巴細胞分離技術，分離了藏豬外周血液淋巴細胞進行體外培養，在Con A的刺激下培養24-72h后，提取培養的淋巴細胞總RNA，應用RT-PCR擴增出藏豬淋巴細胞白細胞介素-2基因的cDNA，克隆到pMD18-T載體上，并進行了序列分析；將得到的序列在GenBank和EMBL數據庫中進行了同源比較，證實本實驗克隆到了藏豬白細胞介素-2的cDNA。
2、藏豬白細胞介素2基因的真核表達與活性檢測將豬白細胞介素2基因亞克隆到真核分泌型表達載體VR1020上，命名為VRIL-2；豬淋巴母細胞增殖實驗證明VRIL-2在轉染Cos7細胞株后，能夠表達出有生物活性的IL-2，可刺激豬淋巴母細胞顯著增殖；此結果表明已成功構建了能正確表達TPIL-2的真核表達質粒，其表達產物具有正常的生物學活性，為研究其體內基因轉移表達的免疫調節作用奠定了堅實基礎。
3、殼聚糖納米顆粒的制備和分子包裝將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2質粒(含適當濃度三聚磷酸鹽)溶液分別50℃水浴恒溫20min，均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得VRIL2質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer 3000HS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位，結果發現本法獲得的顆粒直徑主要在40-60nm之間，顆粒的zeta電位達到+25.6mV，表明所制備的CNP成功完成了VRIL2的分子包裝。
4、藏豬白細胞介素-2基因抗感染制劑的應用試驗動物用昆明鼠120只，隨機分為8組，每組15只。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠。注射裸質粒免疫組每只小鼠接種相應質粒30pmol；注射殼聚糖包裝質粒的免疫組每只小鼠接種相應包裝的質粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。大腸桿菌、沙門氏菌和豬藍耳病疫苗特異性小鼠分組見表1，每組小鼠均按豬免疫劑量1/50股外側肌肉注射免疫。非特異免疫小鼠分組除不注射疫苗外，其它均以特異疫苗免疫組相同。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測體液免疫應答(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)、細胞免疫反應(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的動態變化；并在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實驗小鼠，觀察發病情況；49天時對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測免疫保護效應。
本研究首次將豬白細胞介素-2基因用殼聚糖納米顆粒包裝后通過肌肉注射的方式免疫小鼠，檢測了殼聚糖包裝豬白細胞介素-2基因及未包裝豬白細胞介素-2基因對小鼠的體液免疫和細胞免疫水平的影響情況，并對常規疫苗在不同的形式的豬白細胞介素-2基因分子免疫佐劑協同作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統的分析。結果顯示豬白細胞介素-2基因能顯著提高小鼠的免疫應答水平，以殼聚糖納米顆粒作為免疫基因包裝分子，具有減少質粒用量、增強體液免疫和細胞免疫的優點。
在應用中發現，豬白細胞介素-2基因裸質粒和殼聚糖包裝豬白細胞介素-2基因質粒肌肉注射的方式都能有效提高免疫小鼠對常規疫苗的免疫應答水平，兩種方式的作用效果差異不大。CNP包裹組的質粒用量僅為未包裹組的1/5，但獲得了與VRIL2直接免疫組相似或較強的免疫應答反應，其原因可能是殼聚糖納米顆粒包裹質粒DNA后，有效地防止了VRIL2被體內其它組織蛋白的吸附和體液核酸酶對DNA的降解，同時又促進VRIL2進入細胞，使質粒DNA緩慢釋放，將目的基因DNA轉運到靶細胞中，發揮基因轉錄表達，分泌更多的細胞因子，增強對免疫應答的上調效應，提高體液和細胞免疫水平。這在將來的實際應用上有較大的價值，意味著較少的質粒用CNP包裹后也可刺激較強的免疫反應，減少質粒用量，降低成本。這些結果提示殼聚糖納米顆粒包裹豬白細胞介素-2基因接種可提高機體細胞免疫和體液免疫水平，增強免疫應答及免疫保護力，可望作為豬的新型高效抗感染免疫調節劑，具有潛在的廣泛應用前景。


圖1a 殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(×50000)圖1b 殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖2a TPIL-2 RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1DL2,000 MTPIL-2cDNA圖2b pMTPIL-2酶切電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)Lane1DL2000marker Lane2BamHI/EcoRI消化 Lane3BamHI消化Lane4EcoRI消化 Lane5空質粒圖2.c 真核表達RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1DL2,000marker 2VR1020對照 324h 448h 572h表達產物圖3a 疫苗免疫組小鼠血清中沙門氏菌特異性抗體含量圖3b 疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖3c 疫苗免疫組小鼠血清中藍耳病特異性抗體含量圖4a 疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖4b 疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖4c 疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖5a 疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖5b 疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖5c 疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖6a 疫苗免疫組小鼠白細胞數量變化圖6b 疫苗免疫組小鼠單核細胞數量變化圖6c 疫苗免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖6d 疫苗免疫組小鼠中性粒細胞數量變化圖7a 非特異免疫組小鼠血清中IgA含量圖7b 非特異免疫組小鼠血清中IgG含量圖7c 非特異免疫組小鼠血清中IgM含量圖7d 非特異免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖8a 非特異免疫組小鼠血清中IL-2含量圖8b 非特異免疫組小鼠血清中IL-4含量圖8c 非特異免疫組小鼠血清中IL-6含量圖9a 非特異免疫組小鼠白細胞數量變化圖9b 非特異免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖9c非特異性免疫組小鼠單核細胞數量變化圖9d 非特異免疫組小鼠中性粒細胞數量變化
具體實施例方式
1、藏豬IL2基因(TPIL-2基因)的克隆從健康藏豬耳靜脈無菌采血10mL，分離藏豬外周血淋巴細胞，加入10ug/ml Con A刺激，在CO2培養箱中37℃培養72h，分時段(24、48、70h)提取藏豬總RNA，設計一對藏豬IL-2基因cDNA擴增引物。引物序列如下引物1CGGGATCCCAG TAA CCT CAA CTC CTG CCA CAAT，引物2GCCAA TTCCAA GTC AGT GTT GAG TAG ATG CTTT。
以總RNA為模板，在50μl反應體系中加10×RT-PCR反應緩沖液5μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)1μl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，5′和3′引物各20uM，總RNA1~2μl，補水至50μl。RT-PCR循環參數為50℃，30min；94℃，2min，然后進行30個PCR循環(94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s)后繼續在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉化感受態細胞，篩選和鑒定含重組質粒的菌落，小規模提取質粒DNA，酶切及電泳觀察質粒DNA，確定重組質粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一樣后(附圖2a.b)，進行序列測定。序列測定結果采用DNAtools 5.1進行分析。
用M13通用引物對含有目的基因片斷的pMTPIL-2質粒進行正反向測序，通過重疊序列的拼接，得到了完整的TPIL-2基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1對其編碼氨基酸進行了分析，發現其ORF為465個堿基，編碼154個氨基酸，分子量為17.4kD。
2、藏豬IL2基因真核表達質粒的構建及表達活性檢測提取VR1020質粒，經BamHI/BglII酶切后，加入回收的BamHI/BglII酶切的TPIL-2cDNA片段2μl，1μl T4DNA連接酶16℃水浴過夜連接。轉化的菌落與含50μg/ml Amp的LB培養基上，37℃過夜培養。然后通過重組子的快速鑒定，經過質粒大小的比較，選取有插入片斷的菌落，提取質粒，用BamHI/BglII分別做雙酶切篩選鑒定重組子，證實獲得TPIL2的真核表達質粒-VRIL2(見附圖2c)。
使用法國PT公司的JetPEITM細胞轉染試劑進行質粒DNA轉染Cos7細胞實驗，參照試劑說明書進行。培養48小時，檢測基因表達產物活性。以RT-PCR檢測基因在真核細胞中表達；制備豬淋巴母細胞，MTT比色法檢測TPIL-2生物學活性，分別使用轉染后24小時、36小時和72小時細胞培養液上清進行分析，結果發現VTPIL-2重組質粒真核表達產物對豬淋巴細胞均有顯著的增殖刺激活性，24h表達樣品(OD5700.284)、36h表達樣品(OD5700.431)和72h表達樣品(OD5700.496)均明顯高于VR1020對照孔的OD5700.067(P＜0.01)；這些證明，VTPIL-2能在真核細胞正確轉染表達具有生物學活性的TPIL-2，對豬淋巴細胞具有增殖免疫激活作用。
3、殼聚糖納米顆粒的制備和包裝VRIL2質粒分子用離子交聯法制備質粒殼聚糖納米顆粒。將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2質粒(含適當濃度三聚磷酸鹽)溶液50℃水浴分別恒溫20min，然后均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得VRIL2質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。取少量質粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer 3000HS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見說明書附1)。納米粒度分析儀測定結果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190，表明納米顆粒直徑較均勻(見說明書附2)；顆粒的zeta電位達到+25.6mV，說明這種納米顆粒比較穩定，能有效地包裹帶大量負電荷的質粒分子，有利于顆粒分子進入細胞。凝膠阻滯實驗也發現VRIL2幾乎全部被CNP所包裹。這些表明本實驗成功地制備了CNP，完成了VRIL2的分子包裝。
4、殼聚糖納米顆粒包裝豬白細胞介素-2基因對疫苗特異性免疫應答的調節試驗動物分組昆明鼠60只，隨機分為4組，每組15只。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠。
注射裸質粒免疫組每只小鼠接種相應質粒30pmol注射殼聚糖包裝質粒的免疫組每只小鼠接種相應包裝的質粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。大腸桿菌、沙門氏菌和豬藍耳病疫苗特異性小鼠分組見表1，每組小鼠均按豬免疫劑量1/50股外側肌肉注射免疫。
表1 疫苗免疫小鼠分組組別 免疫程序A1裸VRIL2肌注接種小鼠+疫苗A2CNP包裹VRIL2肌注接種小鼠+疫苗C1CNP包裹VR1020肌注接種組小鼠+疫苗C2裸VR1020肌注接種組小鼠+疫苗注CNP殼聚糖納米顆粒體液免疫反應的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測體液免疫反應。
IgG、IgA及IgM的含量測定實驗鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
特異性抗體的測定制備K88和K99大腸桿菌、沙門氏菌和藍耳病病毒抗原，分別用折3種抗原包被Costar酶標板，實驗鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法(武漢博士德公司生產)測定小鼠免疫5周攻毒后血清中抗大腸桿菌、沙門氏菌和藍耳病病毒特異性抗體含量。
細胞因子的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實驗鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測小鼠細胞免疫應答情況。
免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞。
免疫保護效應的檢測小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實驗小鼠，觀察生長情況；49天時用常規方法對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
實驗結果(1)小鼠血清中特異性抗體含量測定結果見說明書附3。圖3(a)(b)(c)顯示了傷寒疫苗、大腸桿菌和藍耳病疫苗、與相應VRIL2聯合免疫后實驗動物特異性抗體變化情況。結果顯示小鼠在免疫一周后，就檢測到特異性抗體的產生；在同時免疫VRIL2后，實驗小鼠的上述特異性抗體比對照組顯著提高(P＜0.05)。用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后與疫苗聯合注射免疫小鼠，在核酸用量僅為未包裝組1/5的情況下，VRIL2對提高實驗動物對疫苗特異性免疫應答效果同樣顯著；其中肌肉注射對藍耳病疫苗、大腸桿菌、傷寒疫苗特異性抗體水平的明顯提高。
(2)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量測定結果見說明書附4。圖4(a)(b)(c)顯示了VRIL2與藍耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗免疫小鼠后血清中免疫球蛋白的變化情況。結果表明在同時免疫了VRIL2后，實驗動物的IgG、IgA與IgM含量均比對照組顯著增多(P＜0.05)。其中殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后，再與藍耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合注射小鼠，雖然在DNA的使用量上只有未包裝組的1/5，但其IgG、IgA、IgM含量較對照組明顯增加(P＜0.05)，與未包裝免疫鼠差異不顯著(P＞0.05)。
(3)血清中細胞因子的檢測結果見說明書附5。圖5(a)(b)(c)結果表明VRIL2與藍耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對照組高。用殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2組與未包裝組相比較，包裝的DNA只有未包裹組1/5的用量，但是對免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用較明顯。
(4)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化結果見說明書附6。用藍耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合VRIL2免疫小鼠，小鼠外周血免疫細胞數量的變化情況(見圖6(a)(b)(c))。結果同樣發現肌肉注射VRIL2均對實驗小鼠外周血免疫細胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細胞數量較對照組稍低。用殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2，不僅可以將DNA用量減少至未包裝用量的1/5，還有效增加了小鼠外周血免疫細胞數量。
6、殼聚糖納米顆粒包裝豬白細胞介素-2基因對小鼠非特異性免疫應答的影響試驗動物分組昆明鼠60只，隨機分為4組，每組15只，非特異免疫小鼠分組見表2。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠；注射裸質粒免疫組每只小鼠接種相應質粒30pmol；注射殼聚糖包裝質粒的免疫組每只小鼠接種相應包裝的質粒6pmol。5周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)，觀察各試驗動物的免疫抗病力變化。
表2 非特異免疫小鼠分組組別免疫程序A1 裸VRIL2肌注接種小鼠B1 CNP包裹VRIL2肌注接種小鼠C1 CNP包裹VR1020肌注接種組小鼠C2 裸VR1020肌注接種組小鼠注CNP殼聚糖納米顆粒動物接種包裝質粒制劑后免疫機能的變化檢測免疫小鼠體液免疫反應的檢測(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)細胞因子的檢測和外周血免疫細胞數量的動態變化均與上述特異性免疫應答試驗相同。
免疫保護效應的檢測小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實驗小鼠，觀察生長情況；49天時用常規方法對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
實驗結果(1)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量和攻毒后特異性抗體的測定結果見說明書附7。從圖7(a)(b)(c)(d)可見，小鼠在注射VRIL2后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對照組顯著增高；其中殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2注射組血清中IgG、IgA、IgM含量的增加尤為顯著；與對照組相比，肌注未包裝VRIL2組IgG、IgA、IgM含量也有提高。殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2后，雖然DNA用量僅為未包裝組的1/5，但免疫組血清中的IgG、IgA、IgM含量仍顯著提高，與對照組差異顯著(P＜0.05)。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對照組血清中IgG、IgA、IgM含量顯著增加(P＜0.05)；大腸桿菌特異性抗體水平也明顯高于空白質粒對照組小鼠(P＜0.05)。
(2)血清中細胞因子的檢測結果見說明書附8。由圖8(a)(b)(c)可知，VRIL2免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對照組明顯升高(P＜0.05)，殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2組與未包裹組相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差異不顯著(P＞0.05)。
(3)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化結果見說明書附9。免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化是考察小鼠細胞免疫應答的一個重要指標。圖9結果顯示VRIL2免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白細胞、單核細胞、淋巴細胞數量較對照組都有顯著增加，中性粒細胞在攻毒前也較對照組明顯升高，但攻毒后中性粒細胞數量則較對照組低(P＜0.05)；用殼聚糖納米微粒包裝VRIL2后免疫小鼠，發現在使用DNA量減少5倍的情況下，可以達到同樣的提高免疫細胞數量的效果。
攻毒小鼠免疫保護率的觀察免疫后35天以致病性大腸桿菌口服攻擊實驗小鼠，攻毒3周后剖解實驗小鼠和檢測免疫學變化；結果發現CNP包裹VRIL2組小鼠的細胞和體液免疫應答均顯著強于對照小鼠，VRIL2接種小鼠活動如常，均健康存活，3周后剖解消化道和呼吸道均未見明顯的眼觀病變。而對照小鼠均發病，精神委頓，行動遲緩、被毛聳立；剖解后發現胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等病變。這些結果顯示殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2接種能顯著增強小鼠對大腸桿菌感染的免疫抵抗力，提高其免疫保護率。
<110>四川今朝生物科技有限責任公司<120>藏豬白細胞介素-2抗感染DNA制劑的制備及應用<160>1<210>1<211>465<212>DNA<213>藏豬(Tibet Sus scrofa)<220>
<400>1atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga cttga 46權利要求
1.豬白細胞介素-2基因抗感染制劑的制備及應用，其特點為包括豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的構建、殼聚糖納米顆粒對豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的分子包裝、此DNA制劑應用于豬增強機體免疫應答及抗感染免疫力的應用技術。
2.根據權利要求1所述的豬白細胞介素-2基因抗感染制劑的制備，其特征在于所述的豬白細胞介素-2基因構建入VR1020真核表達質粒。
3.根據權利要求1所述的豬白細胞介素-2基因真核表達質粒的制備，其特征在于所述的DNA制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯法制備質粒殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權利要求1要求的殼聚糖納米分子包裝豬白細胞介素-2基因表達質粒作為新型動物抗感染基因分子免疫調節劑的應用技術，其特征在于以下幾方面a)將制備的豬白細胞介素-2基因表達質粒納米顆粒以肌注方式免疫動物，比較了對細胞和體液免疫應答水平的影響；b)以制備的殼聚糖納米顆粒豬白細胞介素-2基因表達質粒接種動物，結果表明該納米顆粒基因制劑能有效提高實驗動物非特異性細胞和體液免疫水平，增強其非特異性免疫力；c)以制備的豬白細胞介素-2基因表達質粒納米顆粒聯合疫苗(豬藍耳病疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實驗動物，結果表明殼聚糖納米顆粒豬白細胞介素-2基因表達質粒可顯著促進動物對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應，增強動物的免疫抗病能力。
全文摘要
本發明公開豬白細胞介素－2基因抗感染DNA制劑的制備及應用技術。用離子交聯法制備質粒殼聚糖納米顆粒，將豬白細胞介素－2基因真核質粒(VPIL2)溶解于三聚磷酸鹽溶液與分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖醋酸溶液50℃水浴分別恒溫20min，然后按適當比例均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液5min，得到VPIL2質粒殼聚糖納米顆粒液，粒徑40－60nm，Zeta電位+25.6mv，無細胞毒性，能抵抗核酸酶對DNA的降解。以殼聚糖納米顆粒包裝VPIL2質粒，將此DNA納米顆粒制劑以肌肉注射的方式單獨或協同疫苗免疫實驗動物，可顯著提高試驗動物的細胞和體液免疫應答水平，明顯增強試驗動物的抗感染免疫保護力，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL2質粒作為新型動物抗感染分子免疫增強劑的應用技術。
文檔編號A61P37/00GK1720998SQ200410040210
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月14日 優先權日2004年7月14日
發明者高榮, 武梅, 李惠, 王澤洲, 李江凌, 呂學斌, 吳凱源, 付滿良, 楊毅, 王麗煥 申請人:四川今朝生物科技有限公司