專利名稱：稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵蛋白MgRacl的基因及其應用。
背景技術：
由稻瘟病菌7Wag"a; oAe (Herbert) Barr(無性世代i>7'cM/an'a gnkfl)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，有 性世代是單倍體異宗配合的子囊菌。該菌能夠侵染50多種禾本科植物，包 括許多雜草以及重要的谷類作物如小麥、大麥、玉米等，也造成一定的經 濟損失。由于該病害的重要性和對稻瘟病菌傳統、分子遺傳的可操作性， 它已成為研究植物病原真菌與寄主互作較為理想的模式系統之一。但由于 稻瘟病菌的致病性復雜，且易變異，高抗水稻品種大面積種植往往3-5年 便喪失抗病性。因此，開辟防治稻瘟病的新途徑，是目前稻瘟病的熱門課 題。其中較為一致的看法是采取持久性抗性策略，即在弄清侵染循環各環 節機制的基礎上，設法干擾或中斷其中某一關鍵環節，使稻瘟病的流行速 率減低，達到防治病害的目的。稻瘟病菌以分生孢子和菌絲在病稻草或病谷上越冬。第2年當氣溫升 至2(TC左右時，若遇降雨，在草堆、草房等處越冬的病菌就能產生大量 分生孢子。這些分生孢子依靠氣流，通過空氣傳播，秧苗或成株葉片受侵 發病后，病斑上又產生大量孢子，繼續借風雨傳播進行再次侵染為害。在 實驗室條件下， 一個典型的病斑在溫濕度適宜時，每天可產生2 000 6 000 個分生孢子，且可持續14天左右，因此，只要條件適宜，病菌可反復進行 多次再侵染，以致病害迅速擴展而流行。可見，孢子在病害侵染循環中起 著關鍵性作用，能否產生大量的孢子，孢子能否發揮正常功能，決定著病 害會不會流行。國內外研究者發現，孢子萌發液中存在著稻瘟病菌的致病 因子及有關物質。Shi等用化學和插入突變技術獲得了幾個單基因產孢突 變f本conl、 con2、 con3、 con4、 con5、 con6禾口con7。它們在產f包的不同階 段起作用，每個基因突變體都在產孢和孢子形態上有獨特的特征。還有其 它幾個基因在產孢方面也有相類似的表型，例如稻瘟菌PAK激酶Chml，其敲除突變體的產孢量只有野生型的萬分之一。因此，有研究者認為，通 過有目的地研制開發新型高特異性農藥一對產孢基因的表達起干擾作用 的抗產孢物質，將會是控制稻瘟病流行的強有力武器。稻瘟病菌的侵染過程是一個涉及到復雜的細胞分化、信號傳導和極性生長的過程。Rho族蛋白是極性生長與細胞骨架重組過程中關鍵的調控因 子，現已發現的有Rho、 Rac、 Cdc42三個亞家族近百種蛋白。其中，Rac 是Rho族蛋白的一個重要成員，在許多真核生物中同樣普遍存在，研究發 現它在多個細胞進程中發揮著重要作用，包括對細胞周期、基因表達、噬 菌細胞NADPH氧化酶的激活、細胞骨架重組、神經軸突的引導和細胞遷 移等方面的調控。因此，對稻瘟病菌Rho族蛋白成員MgRacl的結構功能 研究，將有助于了解其調控稻瘟病菌侵染致病的分子機制，最終有助于闡 明稻瘟病菌Rac亞族G蛋白信號傳導通路網絡與它們所調控的生物學功能 之間內在的聯系，同時也有助于制定更加有效合理的稻瘟病治理策略和措 施，為開展防治稻瘟病菌的基礎理論研究與生產應用研究奠定分子生物學 基礎。稻瘟病菌全基因組序列的測定已經完成，為以功能基因組學方法從全 基因組水平研究其關鍵基因的功能奠定了基礎。目前，通過基因敲除和功 能互補相結合的方法，是鑒定基因功能最成熟的技術之一。這將為進一步 明確靶點基因調控稻瘟病菌生長發育和侵染致病的內在分子機制奠定基 礎，并為研制開發干擾該基因表達的特異性農藥提供快速而準確的幫助。發明內容本發明的目的是提供調控稻瘟病菌分生孢子發育和致病 性調控關鍵蛋白MgRacl的基因，以及所述基因在設計農藥分子耙點中的 應用。本發明提供稻瘟病菌Rho族蛋白成員MgRacl，該基因直接調控分生 孢子的發育，其特征在于具有SEQ ID1所示的核苷酸序列和SEQ ID2所 示的氨基酸序列。調控稻瘟病菌分生孢子發育的Rho族蛋白成員MgRacl的鑒定方法， 其特征在于包括以下步驟(l)用同源重組的方法，將野生稻瘟菌株中的 基因片段SEQID1敲除，則表現為分生孢子發育異常，致病性喪失；(2)采用人工構建的互補載體轉化被敲除而缺失所述SEQ ID1基因片段的稻 瘟病菌菌株，則所得的互補菌株的分生孢子發育及致病性均得到恢復； (3)用定點突變的方法，改變野生稻瘟病菌菌株中氨基酸序列SEQ ID2 中特異位點的氨基酸，則表現為分生孢子發育異常，致病性下降。具體操 作方法首先用同源重組的方法，通過PEG介導的原生質體轉化將 MGG—02731.5替換成潮霉素轉移酶基因。這種基因缺陷型突變體表現為 產孢量明顯下降，分生孢子畸形并無法分化附著胞，而且致病性完全喪失。 通過構建基因自帶啟動子與該基因連接的互補載體，進行功能性互補實 驗，能夠恢復基因敲除突變體的孢子發育及致病力。同時，將所述的氨基 酸序列SEQ ID2中第17位氨基酸glycine突變為valine,使該基因處于持 續激活的狀態，或將所述的氨基酸序列SEQ ID2中第123位氨基酸aspartic acid突變為alanine,使該基因處于持續失活的狀態，這兩種狀態均導致稻 瘟病菌分生孢子發育異常，從而嚴重干擾稻瘟病菌致病性。通過以上鑒定 方法，確認MgRacl基因的功能與分生孢子發育相關。本發明的調控稻瘟病菌分生孢子發育的Rho族蛋白成員MgRacl，其 實用價值在于可根據其功能域的結構和功能，設計新型農藥的分子靶點。 通過保守域分析，MgRacl具備了所有Rho族蛋白特有的結構域，即含有 一系列GDP/GTP結合和水解結構域，其中的G4結構域TKLD為所有Racl 蛋白所特有的，這些功能域的存在是MgRacl與其上下游效應蛋白特異互 作所必需的，輔以酵母雙雜交等技術，可用于進一步篩選耙點基因所調控 的基因。篩選直接作用于MgRacl基因或作用于能與其互作的其他基因的 藥劑都能使稻瘟病菌分生孢子的發育分化能力及致病性下降，從而進一步 起到田間防治稻瘟病的效果。
具體實施方式
實施例l: MgRacl基因克隆及保守域分析根據稻瘟病菌基因組數據庫公布的MgRacl序列(MGG—02731.5)， 設計基因特異引物，以稻瘟病菌野生型菌株70-15基因組DNA為模板， 經PCR擴增獲得MgRacl DNA全長序列。此外，以70-15總RNA為模 板，反轉錄擴增獲得MgRacl cDNA全長序列，分別克隆至pGEM-T easy載體，測序結果表明其與稻瘟病菌基因組數據庫所公布序列一致。Southern雜交結果表明該基因在稻瘟病菌中為單拷貝基因。通過生物信息 學預測，MgRacl具備了所有Rho族蛋白特有的結構域，即含有一系列 GDP/GTP結合和水解結構域，包括Gl, GXXXXGKS/T; G2,core effector domain, T; G3,DXXGQ/H/T; G4， T/NKXD; G5， C/SAK/L/T。其中的G4 結構域TKLD為所有Racl蛋白所特有的，在所有Racl類似蛋白中十分 保守。MgRacl在C端(第196-199氨基酸)還含有CAAX結構域，該結 構域與蛋白轉錄后修飾及異戊二烯化有關，它促使該蛋白結合于細胞內 膜。實施例2: MgRacl基因敲除本發明用同源重組的方法對MgRacl基因進行敲除。首先構建含有所 要敲除基因的上下游同源片段以及真菌篩選標記的重組質粒。設計擴增上 游與下游同源片段的引物，兩個片段的大小為900bp與lkb，經限制性內 切酶處理后，分別插入含有啟動子和終止子的潮霉素轉移酶基因的兩端。 提取克隆得到的陽性重組子的質粒DNA，進行下一步的稻瘟病菌原生質 體轉化。提取野生型菌株70-15的原生質體，以PEG介導的方法，將重 組質粒DNA導入原生質體中，于含有潮霉素的培養基上進行篩選生長。 生長得到的轉化子進行PCR和Southern雜交驗證。原生質體轉化所得到 的陽性敲除轉化子，表現為產孢量明顯下降，分生孢子畸形并無法分化附 著胞。在致病力方面，陽性敲除轉化子表現為完全喪失對水稻和大麥的致 病性。實施例3: MgRacl敲除突變體功能互補為了證實陽性敲除轉化子生長發育和侵染致病的異常是由于MgRacl 基因的敲除所引起的，本發明所構建的互補載體包含該基因及其上游自身 啟動子共2.7kb的DNA序列。首先，互補載體pBARKSl線性化，用限 制性內切酶BamH I和EcoR I對pBARKSl質粒DNA進行完全酶切，回 收酶切片段后，對野生型基因組DNA進行PCR擴增得到含有啟動子區的 目的基因片段，也進行相同的酶切處理后，與回收的載體片段用T4連接 酶進行體外連接。連接產物轉化到大腸桿菌中，挑取陽性重組子，提取質粒進行下一步的原生質體轉化。提取基因敲除突變體的原生質體，同樣以PEG介導的方法，將重組質粒DNA導入原生質體中，在含有除草劑的培養基上進行篩選生長。結果表明，敲除突變體的互補轉化子能夠恢復稻瘟 病菌正常的孢子發育及致病性。實施例4: MgRacl的定點突變為了進一步證實MgRacl發揮著調控稻瘟病菌分生孢子發育的作用， 本發明通過定點突變，構建了 MgRacl正顯性激活突變體(G17V)轉化 載體和負顯性失活突變體(D123A)轉化載體。首先設計特異引物，以野 生型菌株70-15的cDNA為模板，通過定點突變PCR方法分別擴增獲得 MgRacl正顯性突變(G17V)和負顯性突變(D123A)的cDNA產物， 與含有強表達啟動子RP27的pTEll載體進行體外連接。分別挑取陽性重 組子，轉化野生型菌株70-15的原生質體，于含有潮霉素的培養基上進行 篩選生長。生長得到的轉化子進行PCR和Southern雜交驗證。結果表明， 這兩個突變體均影響了稻瘟病菌分生孢子的發育，從而嚴重干擾稻瘟病菌 致病性。Untitled. ST25SEQUENCE LISTING〈110〉福建農林人學〈120〉稻瘟病菌分生孢了-發育和致病性調控關鍵蛋白及其應用〈130> 《160〉 2〈170> Patentln version 3. 1〈210> 1<2丄1> 1152〈212〉 誰〈213〉 稆瘟病茵〈400〉 1atggccgcccCtggggttC.3gtctttgaaggtaegcategccgccagcatccgtggaact60tgtatccaggcgcggtccgcateggcagegcctatatctctgctggactt120gatgctaacctcctccgcgttcttgtagtgtgtegtcactggcgacggtgctgtcgga肌180ggtcagtaccat,tcagtacatetcteggaggcgtxtcatctcattctttt240ctgcacgacctatctgaaaagattcagaagaeggaatectgeggagacatgcattgacga300ggaagctaacctcgtggatattagacatgccttctc.atctcctscaccacaaacgccttc360cccggcgsgtacatccccacagtgtcagtagctaccaaacctgtcccatcageaaeggae420acgataattctgagegagtccag'actatcgtgtgctgccggagtga,cacgttgectaaca480aacttcgcaccatgacageittcgacaactactcggc.tagtgUatggtcg3tgga肪gcc540catcagcttgggactttgggatacegctggacaggaggactacgacagactgaggecget600atcatacccgcagacagatgtcttcctaatttgcttctcgategttageecgccgtcatt660cgacaacgtcaaggegaaggtacgeaatteaatcatccagcctctaccatgttttgcctg720ctct.caaaagtxtggagcngtgatttggggcaatttctgacatttagtgcctgatgtag780tggtacccag解atcgacc3tcacgcgcccaacgtgcccatcatcctcgteggaaccaag840ctcgatcttcgtgaagacccctccaccctcgagagtcttcgct;ccaagaggatggagect900gtttcgtacgaccaggcacttatctgegeaaaggagattagggcgcacaagtaccttgag960tgctctgcattgacgc朋aggaacctgaagagtgtgttcgatgaggecattaggtatgta1020tttccgt3ttggctacgcgtagtggagcaaccctctaactcatccgtcaa1080cgcaacagggctgtcctcaacccccgaccccagccggcgaaggttaagaagtcaaagtgc1140accattctgt.ga.1152<210> 2〈211> 600〈212〉 PRT<213> 稻瘟病菌〈400〉 2Ala Thr Gly Glv Cys Os Gly Cvs Cvs Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly 1 5 ' lb ' ' 15 'Thr Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly 20 25 30Thr Glv Thr Cys Glv Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys 35 40 4hUntitled. ST25Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala 50 55 60Cys Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys 6:5 '7b ' 7^ 80Cys Thr Ala Cys Ala Cvs Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Cys 85 90 95Thr Thr Cys Cys Cys Cvs Glv Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala 100 110Thr Cys Cys Cys Cys Ala. Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Cys Gly Ala 115 120 125Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Gly Gly C、's Thr Ala Glv Thr 130 135 140GIy Thr Thr Ala Thr Glv G1y Thr Cys G1y Ala Thr Glv Gly Ala Ala 145 15b 155 160Ala Glv Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Glv lg5 170 17^Ala Cys Thr Thr Thr Glv Gly Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr 180 185 190Gly G.Iy Ala Cys Ala Gly Glv Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Glv 195 200 205/Ua Cys Ala GIy Ma Cys Thr GIy Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr 210 215 220Ala Thr Cys Ala Thr Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala 225 230 2^5 240GIy Ala Thi' Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cvs Thr Ala Ala Thr Thr Thr 245 250 255Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cvs Gly Ala Thr Cys Gly Thr Thr Ala Gly 260 265 270Cys Cvs Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys GIy Ala Cvs 275 280Ala Ala Cys Gly Thr Cys Ala A丄a GIy GIy Cys Gly Ala Ala Gly Thr 290 295 300Gly GIy Thr Ala Cys Cvs Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala 30^ 310 31^ 320Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Glv Cys Cys Cys Ala Ala Cys 3'25 33'0 335Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly340345Untitled. ST25 350Thr Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala355360365Thr Cvs Thr Thr Cys Gly Thr Glv Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys 3i70 375 380Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Gly Thr Cys385390395400Thr Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys A]a Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr405410415Glv Gly Ala. Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Gly Thr Ala Cys 420 425 430Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr435440445Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Thr Ala Gly450455460Gly Gly Cys Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Thi' Ala Cys Cys Thr Thr465470475480Gly Ala Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala485490495Cys Gly Cys Ala Ala Ala Gly Glv Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala 500 505 5li)Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly515520525Gly Cys Cys Ala Thr Thr Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys530535540Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala545550555560Gly Cys Cys Gly Gly Cys Glv Ala Ala Gly Glv Thr Thr Ala Ala Gly 565 570 575Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala 580 585 5b0Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala595600
權利要求
1、稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵蛋白MgRac1，其特征在于具有SEQ ID 1所示的核苷酸序列。
2、 根據權利要求1所述的稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵 蛋白MgRacl，其特征在于具有SEQ ID2所示的氨基酸序列。
3、 稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵蛋白MgRacl的鑒定方 法，其特征在于包括以下步驟(1) 用同源重組的方法，將野生稻瘟病菌菌株中權利要求1所述的 基因片段SEQID1敲除，則表現為分生孢子發育異常，致病性喪失；(2) 采用人工構建的互補載體轉化被敲除而缺失所述SEQ ID1基 因片段的稻瘟病菌菌株，則所得的互補菌株的分生孢子發育及致病性均 得到恢復；(3) 用定點突變的方法，改變野生稻瘟病菌菌株中權利要求2所述 的氨基酸序列SEQID2中特異位點的氨基酸，則表現為分生孢子發育異 常，致病性下降。
4、 利用如權利要求1或2所述的調控稻瘟病菌分生孢子發育的Rho 族蛋白成員MgRacl作為靶點基因制備新型農藥。
全文摘要
本發明的稻瘟病菌分生孢子發育和致病性調控關鍵蛋白MgRac1，具備了所有Rho族蛋白特有的結構域。該基因的敲除突變體產孢量下降，分生孢子畸形并無法分化附著胞，而且致病性喪失。敲除突變體通過功能互補實驗后，即恢復了分生孢子的發育及致病性。定點突變該基因特異位點的氨基酸，使其處于持續激活或失活狀態，則同樣導致稻瘟病菌分生孢子發育異常，致病性下降。該基因可以作為新型農藥設計的分子靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101235376SQ20071000994
公開日2008年8月6日 申請日期2007年12月7日 優先權日2007年12月7日
發明者王宗華, 武 鄭, 鄭士琴, 陳繼圣, 魯國東 申請人:福建農林大學