專利名稱：一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及免疫學和乳品制備技術領域，特別是涉及高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法。
背景技術：
免疫球蛋白(immunoglobulin，簡稱Ig)是人類及高等動物受抗原刺激后體內產生的能與抗原特異性相互作用的一類蛋白質，又稱為抗體，普遍存在于哺乳動物的血液、組織液、淋巴液及外分泌物中，是機體免疫系統的一個重要組成部分。免疫球蛋白是所有蛋白質中最不均一的一類蛋白質，根據其理化性質尤其是免疫學性質，可將其分為五類，即IgG，IgA，IgM，IgD及IgE，牛體內以IgG為主。
牛初乳及其功能成分的商品開發可追朔到1958年，芬蘭Immuno.Dynami c.Inc與其他公司開始合作研究牛初乳及其組分的生理功能、用量及安全性。在青霉素及其它抗生素出現以前，美國一直將牛初乳作為一種抗病食品。之后隨著生物技術的發展，人們發現了牛初乳的許多生理功能(大谷元等，1987；C enturyLabsinev spa tent50 13569)。在美國醫學界，明確提出牛初乳是“天然神秘的痊愈劑”。
牛初乳營養成份與人乳相似，免疫因子含量比人初乳更高，免疫球蛋白含量是人初乳的50-100倍，除抗病毒及外來致病原外，還可促進有益菌群生長和營養消化吸收，提高免疫力。牛初乳適用的人群嬰幼兒、孕產婦、年長者、糖尿病患者、心血管病人、手術后燒傷患者、亞健康狀態人群、愛美一族等(白雪2002)。
90年代以來，我國也陸續開發了一些強化牛初乳免疫球蛋白IgG的食品，如黑龍江完達山食品廠的添加IgG的嬰兒配方奶粉，1998年北京牛奶公司利用牛初乳生產的具有IgG活性的巴氏消毒奶“來福乳”和初乳粉。現有的乳品制備中，初乳產品中IgG含量層次差異較大，一般都在3％-20％之間，而且是否具有活性尚值得商榷。
本實驗測定了市售脫脂乳粉，加糖乳粉、乳清粉等各種乳粉中IgG的含量，但結果發現用單向免疫擴散法無法測出它們中的IgG的含量，即他們均不含IgG或含量至微，發明內容本發明的目的是提供一種高含量的免疫球蛋白乳清粉制品的制備方法，有效的提高人體的免疫功能，預防疾病的發生。
為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，包含以下步驟(1)選取原料牛初乳；(2)往上述的牛初乳中添加抗熱變性物質；(3)將上述的牛初乳脫脂，再對脫脂后的牛初乳進行沉淀，得到一次乳清液；(4)將上述的一次乳清液進行濃縮，得到二次乳清液；(5)將上述的二次乳清液進行干燥，即得乳清粉；步驟(4)中的濃縮采用等度洗脫超濾濃縮法進行濃縮，即將所述的一次乳清液先進行超濾濃縮，再進行等度洗脫；步驟(5)中的干燥經如下工序，先一次干燥、凍結，再升華二次干燥，最后在真空條件下解析。
在所述的步驟(1)中的牛初乳為健康乳牛分娩后72小時內分泌的乳汁。
所述的牛初乳是在-15℃--25℃中保存的，加工時取出并在室溫下融解。
所述的抗熱變性物質為蔗糖、磷酸鹽，檸檬酸鹽中的一種或其任意組合的混合物。
在步驟(3)中的脫脂是在高速冷凍離心機上進行的，該離心機的轉速為8000-12000轉/分，溫度為2℃～5℃，離心時間為10分鐘-20分鐘。
在步驟(3)中的沉淀為對脫脂后的牛初乳中的酪蛋白進行沉淀，該沉淀包括如下工序將脫脂后的牛初乳的pH值調節為5-6后，再在高速冷凍離心機上完成沉淀工序， 該離心機的轉速為8000-12000轉/分，溫度為2℃-5℃，離心時間為15分鐘-25分鐘。
在步驟(4)中的超濾濃縮是在超濾儀上完成的，其過程分為兩步，首先選擇40-60kDa膜進行超濾，然后用5-15kDa膜對濾出液進行截留。
在步驟(4)和步驟(5)還設有檢測所述的二次乳清液中免疫球蛋白的分離純度的步驟。
所述的檢測免疫球蛋白的分離純度是用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術來檢測的。
在步驟(5)中的凍結時，凍結溫度為-30℃---40℃，凍結時間為1.5～2.5個小時。
在步驟(5)中對二次乳清液的升華干燥是在冷凍干燥設備中進行，所述的升華干燥包括如下工序，首先將冷凍干燥設備降溫至并維持在-35℃--40℃之間，再對設備的干燥室抽真空，使真空度達40-50Pa，然后加熱升華6-7小時。
在步驟(5)中的解析是在熱解析裝置中進行，該熱解析裝置的解析溫度為35℃～45℃，解析時間為6.5～7.5個小時。
本發明與現有技術相比具有如下優點1.本發明的乳品中免疫球蛋白的含量顯著高于其他乳粉，因此有更強的提高免疫力的功能。
2.本發明的方法中，用等度洗脫超濾濃縮法分離免疫球蛋白IgG，確保了乳品中免疫球蛋白IgG的高含量和高純度。
3.本發明的實用性強，操作簡單，步驟清楚，能適應大批量的生產的需要為表明用本發明方法制備的高含量免疫球蛋白乳清粉制品有顯著的提高免疫力的功能，進行動物實驗，過程如下取615近交系雌性小鼠27只(購自中國醫科大學動物實驗中心)。稱重后，取體重在21-24克的小鼠，隨機分成9組，每組3只，使各組之間體重差異不顯著。然后隨機放到9個位置上，隨機抽出3組作為飲用組(I)，之后再隨機抽出3組作為注射組(II)，剩余的3組作為對照組(III)，這樣可以使環境無差異。飲用組小鼠每天每只飲用1ml乳清粉末溶液(0.2克乳清粉末，免疫球蛋白IgG的含量在40％左右)，注射組小鼠每天腹腔注射0.1ml乳清粉末溶液，每天下午3:00給小鼠飲用和注射IgG乳清粉末溶液。實驗時間為30天。實驗期間，小鼠自由進食和飲水。
實驗30天后，立即開始免疫力測試實驗，包括小鼠外周T淋巴細胞酶標記染色法(影響細胞免疫功能的實驗方法)，雞紅細胞作免疫原的溶血素(摘眼球取血)測定法，腹腔巨噬細胞功能測定法(影響體液免疫功能的實驗方法)，免疫器官(脾臟)稱重共四項試驗。
實驗結果分析如下，(一)對小鼠細胞免疫功能的影響結果見表19，給小鼠飲用IgG后，T淋巴細胞所占的百分率明顯提高，注射組與對照組比較差異極顯著(P≤0.01)，說明口服牛初乳中的IgG可以明顯促進小鼠細胞免疫功能。注射組與對照組比較差異也極顯著(P≤0.01)，說明注射IgG也可以促進小鼠細胞免疫功能。
表19IgG對小鼠T淋巴細胞百分含量的影響Table 19 effect of IgG on the percemtage coaleat of Tlymphocyte of mice

(二)對小鼠體液免疫功能的影響結果見表20，給小鼠飲用IgG后，光密度值明顯提高，說明血清溶血素明顯提高，注射組與對照組比較差異極顯著(P≤0.01)，說明口服液牛初乳中的IgG可以明顯促進小鼠體液免疫功能。注射組與對照組比較差異也極顯著(P≤0.01)，說明注射IgG也可以促進小鼠體液免疫功能。
表20Igc對小鼠溶血素生成量的影響Table 20 effect of IgG on productiom of hemoly sin of mlce

(三)對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響結果見表21，給小鼠飲用IgG后，鏡檢發現，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率明顯提高，注射組與對照組比較差異極顯著(P≤0.01)，說明口服牛初乳中的IgG可以有效促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。注射組與對照組比較差異也極顯著(P≤0.01)，說明注射IgG也可以促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。
表21IgG對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響Table 21effect of IgG on phaging function of abdominal in mice

(四)對小鼠免疫器官(脾)重量的影響結果見表22，給小鼠飲用和注射IgG都增加小鼠的免疫器官(脾)的重量，飲用組與對照組相比差異顯著(P≤0.05)，但注射組與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)表22IgG對小鼠脾重的影響Table 22 effect of IgG on spleen weight of mice

注實驗過程中注射組有一只小鼠死亡。
分析原因如下1、由于小鼠每天進行一次腹腔注射，對小鼠刺激較大，可能是應激過大而死。
2、小鼠購進時，由于條件有限，室內溫度沒有達到20度。
3、操作過程中可能不當，引起小鼠死亡。
(五)小結本實驗用高含量免疫球蛋白IgG乳清粉喂養小鼠后，其T淋巴細胞、光密度值(能促進血清容血素)、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率均比在相同環境下不喂IgG乳清粉的小鼠明顯增加，對小鼠的免疫器官(脾)也有增加但是效果不明顯。這也充分證明了IgG乳清粉有促進小鼠的生長發育，增加小鼠的免疫功能。實驗結果表明，實驗II組的T淋巴細胞百分率、光密度腹巨噬細胞吞噬率、脾較實驗III有比較顯著的提高。IgG乳清粉的主要成分IgG能增強免疫作用。因其均含有增強免疫機能的有效活性成分。本實驗中實驗二組同對照組相比，T淋巴細胞百分率、光密度、腹腔巨噬細胞吞噬率均有極顯著差異(p＜0.01)，說明該物質具有提高機體免疫作用。同時能促進脾細胞增生，這也許是提高機體免疫機能的途徑之一。
具體實施例下面詳述一個按照本發明方法制備高含量的免疫球蛋白乳清粉的具體過程(1)將健康乳牛分娩后72小時內分泌的新鮮乳汁置于-17℃冰箱中保存，加工時取出在室溫下緩慢融解，以避免初乳喪失生物活性。
(2)在牛初乳中添加抗熱變性物質-檸檬酸鈉、磷酸鈉、蔗糖其中，檸檬酸鈉的摩爾濃度為200mmol/l，磷酸鈉的摩爾濃度為100mmol/l，蔗糖的質量含量為15％，添加抗熱變性物質以改善牛初乳的熱穩定性；(3)將上述的牛初乳脫脂，整個脫脂過程采用高速冷凍離心機，在4℃，10000轉/分情況下離心15分鐘。離心后發現下層出現微紅色沉淀物，考慮因為采樣時間較早，最下層應為血紅胞和大分子物質。接著對脫脂后的牛初乳進行加工以沉淀其中的酪蛋白，先將其pH值調至4.5，離心機的轉速為10000轉/分，溫度為4℃，離心時間為20分鐘，酪蛋白就可以離心下來，得到一次乳清液；(4)將上述的一次乳清液進行超濾濃縮，是在超濾儀上完成的，其過程分為兩步，首先選擇40-60kDa膜對乳清液進行超濾，然后用5-15kDa膜對濾出液進行截留，再對截留液等度洗脫，得到二次乳清夜；(5)用不連續垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠電泳技術測試等度洗脫法超濾濃縮后二次乳清夜中免疫球蛋白的分離純度，經測定，乳液中免疫球蛋白含量為50％；(6)將免疫球蛋白IgG乳液裝入干燥瓶，于-35℃的溫度下凍結2個小時后，再將補水器降溫至并維持在-40℃之間，再對干燥室抽真空，使真空度達45Pa，然后供熱，為乳液補進升華熱，7小時后，大部分水會以冰晶的形式除去，接著40℃下高真空度解吸7小時后，出料封口，成品包裝，入庫。
權利要求
1.一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，包含以下步驟(1)選取原料牛初乳；(2)往上述的牛初乳中添加抗熱變性物質；(3)將上述的牛初乳脫脂，再對脫脂后的牛初乳進行沉淀，得到一次乳清液；(4)將上述的一次乳清液進行濃縮，得到二次乳清液；(5)將上述的二次乳清液進行干燥，即得乳清粉；其特征在于步驟(4)中的濃縮采用等度洗脫超濾濃縮法進行濃縮，即將所述的一次乳清液先進行超濾濃縮，再進行等度洗脫；步驟(5)中的干燥經如下工序，先一次干燥、凍結，再升華二次干燥，最后在真空條件下解析。
2.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在所述的步驟(1)中的牛初乳為健康乳牛分娩后72小時內分泌的乳汁。
3.根據權利要求2所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于所述的牛初乳是在-15℃--25℃中保存的，加工時取出并在室溫下融解。
4.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于所述的抗熱變性物質為蔗糖、磷酸鹽，檸檬酸鹽中的一種或其任意組合的混合物。
5.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(3)中的脫脂是在高速冷凍離心機上進行的，該離心機的轉速為8000-12000轉/分，溫度為2℃～5℃，離心時間為10分鐘-20分鐘。
6.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(3)中的沉淀為對脫脂后的牛初乳中的酪蛋白進行沉淀，該沉淀包括如下工序將脫脂后的牛初乳的pH值調節為5-6后，再在高速冷凍離心機上完成沉淀工序，該離心機的轉速為8000-12000轉/分，溫度為2℃-5℃，離心時間為15分鐘-25分鐘。
7.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(4)中的超濾濃縮是在超濾儀上完成的，其過程分為兩步，首先選擇40-60kDa膜進行超濾，然后用5-15kDa膜對濾出液進行截留。
8.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(4)和步驟(5)還設有檢測所述的二次乳清液中免疫球蛋白的分離純度的步驟。
9.根據權利要求8所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于所述的檢測免疫球蛋白的分離純度是用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術來檢測的。
10.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(5)中的凍結時，凍結溫度為-30℃-- -40℃，凍結時間為1.5～2.5個小時。
11.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(5)中對二次乳清液的升華干燥是在冷凍干燥設備中進行，所述的升華干燥包括如下工序，首先將冷凍干燥設備降溫至并維持在-35℃--40℃之間，再對設備的干燥室抽真空，使真空度達40-50Pa，然后加熱升華6-7小時。
12.根據權利要求1所述的一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其特征在于在步驟(5)中的解析是在熱解析裝置中進行，該熱解析裝置的解析溫度為35℃～45℃，解析時間為6.5～7.5個小時。
全文摘要
本發明涉及一種高含量免疫球蛋白乳清粉的制備方法，其具體步驟為首先將牛初乳進行熱穩定性的改善，然后脫脂，再沉淀酪蛋白后，用等度洗脫法超濾濃縮乳清中的免疫球蛋白，確立工藝條件，接著用電泳技術測試超濾濃縮后的免疫球蛋白的分離純度，然后用真空冷凍干燥方法使免疫球蛋白IgG乳清變成乳粉，即可包裝入庫。高含量免疫球蛋白乳清粉的免疫力測試是對小鼠進行的，測試結果分析得出，采用本發明制備得乳清粉中免疫球蛋白的有效含量達50％以上，能有效的提高免疫功能，預防疾病的發生。
文檔編號A23L1/29GK101019580SQ20071002027
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月12日 優先權日2007年3月12日
發明者張志成 申請人:蘇州科牧動物藥品有限公司