專利名稱：利用費氏丙酸桿菌nx－4制備丙酸及聯產維生素b的制作方法
技術領域：
本發明屬于發酵工程技術領域，涉及一種高產丙酸(Propionic Acid)的微生物菌株費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，以及將它用于丙酸及聯產維生素B12的生產。
背景技術：
丙酸是一種重要精細化工產品和基本化工原料，廣泛應用于食品、飼料、橡膠、塑料、油漆、涂料、香料、醫藥、農藥、印刷等領域。
目前丙酸的工業化生產方法采用的是化學合成法。近年來，石油資源日趨緊張，價格不斷上揚，化學合成法生產丙酸的成本上升，同時化學合成法本身操作條件苛刻，加上消費者對天然有機產品的青睞，生物法合成丙酸的研究重新活躍起來。美國、德國、法國、印度、墨西哥等國有大量有關微生物生產丙酸的論文和專利，2000年至今檢索到的論文達50多篇。國內對丙酸的研究也有一些，但菌株產量普遍不高，其中最高發酵水平為天津科技大學的梁惠珍等人用菌株Propionic bacterium sp TQ-10發酵生產丙酸得24g/L。
維生素B12(氰鈷胺)是一種含鈷的水溶性維生素，為深紅色結晶或結晶粉末。維生素B12具有廣泛的生理作用，它參與體內甲基轉換及葉酸代謝，促進神經髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經和外周有髓鞘神經纖維的功能完整，參與廣泛的蛋白質及脂肪代謝等。近年來，國內外市場對維生素B12的需求日益增長，我國生產和出口連年大幅增加。維生素B12及其衍生物的市場前景十分廣闊。人們在丙酸生產研究時往往忽略了這一有價值副產物，只有德國Scharif等人考慮丙酸和維生素B12的耦聯生產，令人遺憾的是丙酸產量和VB12產量均不高，分別為17.7g/l和49mg/L(EP 0668359)。

發明內容
本發明的目的是提供一種高產丙酸的微生物新菌株，將其用于制備丙酸及聯產維生素B12。
本發明人實驗室選育并保藏的微生物菌株費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，目前該菌株保藏于武漢中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，登記入冊的編號是CCTCC No.M 207015，保藏日期是2007年2月7日。以此菌作為生產菌株。
CCTCC No.M 207015菌株具有下述性質1、菌落形態學特征在營養瓊脂上，33℃培養48h出現黃色小菌落(＝0.8～1mm)，菌落呈圓形，表面光滑，粘狀，中央凸起，不透明。適當延長培養，菌落增大，細胞的尺寸和形狀變化很小。
2、生理與生化特性a.培養溫度28～37℃，最適溫度為33℃；b.在pH5.5～7.2范圍內生長；c.色素產生產黃色素；d.耐NaCl濃度在5％濃度可以生長。
3、16S rDNA序列分析測得16S rDNA大部分序列976bp，具體如下5′-CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCATCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGATCACGTCGGAAGTGAAATTCCAGGGCTTAACTCTGGGCTTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAATGTAGGGGAGAATGGAACTCTCGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACATTTCCTGACGCTGAGAAGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTCCCTTCCACGGGGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTG
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4、營養特征費氏丙酸桿菌NX-4的培養基中不需要添加生長因子，可以利用多種化合物作為碳源，這些物質既可以單獨使用，也可以適當的比例復配充當碳源。有機氮或無機氮都可以作為氮源使用。培養基中各組分用量配比按各組分與培養基重量體積百分比計為碳源用量為培養基的2～10％，氮源用量為培養基的2～4％，無機鹽用量為培養基的0.01～1％，其余為水。碳源一般采用葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油等，氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、棉子餅粉、尿素以及(NH4)2SO4、NH4Cl等，培養基中還包括鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、鹽酸鹽等常用的無機鹽類。
利用費氏丙酸桿菌制備丙酸的方法，該方法的步驟為將保藏號為CCTCC M 207015的菌株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中，在合適生長的條件下靜止培養，能夠生成丙酸及聯產維生素B12。
所述的方法，其中培養基的碳源用量為培養基總重量的2～10％，氮源用量為培養基總重量的2～4％，無機鹽用量為培養基總重量的0.01～1％，其余為水。
所述的方法，其中培養基的碳源為葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一種或多種；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一種或多種；無機鹽為鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽或鹽酸鹽中的一種或多種。
所述的方法，其中合適生長的條件是初始pH為6.0～7.0、培養溫度為28～37℃、培養時間為48～150小時。
所述的方法，其中發酵液中的菌體破碎可提取維生素B12；除去菌體后的發酵液可提取丙酸。
優選的制備丙酸及聯產維生素B12的方法將保藏號CCTCC No.M 207015的費氏丙酸桿菌NX-4菌株斜面活化一天后(斜面培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基)，在含有碳源、氮源和無機鹽的培養基上培養48～150小時，可以生成10～53.5g/L丙酸，通常發酵條件還包括培養基為葡萄糖或乳酸2～10％，玉米漿2～4％，(NH4)2SO40.01～0.5％，K2HPO40.01～0.5％，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，以下同。發酵溫度28～37℃，較佳的為32～35℃；培養基的初始pH范圍為6.0～7.0，較佳的為6.8～7.0；靜止培養。
本發明的有益效果(1)本發明篩選到一株丙酸生產菌，該菌能利用多種碳源和氮源發酵生產丙酸，操作方便簡單，培養條件十分粗放。
(2)可以使用纖維素水解糖液(替代葡萄糖或木糖)和豆餅粉(替代酵母膏或蛋白胨)作為丙酸發酵培養基的碳源和氮源，使發酵原料成本大幅下降。
(3)本發明篩選到的丙酸生產菌還能副產高價值的維生素B12，提高了產品生產利率。
具體實施例方式
實施例1斜面培養基葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，pH6.9。
種子培養基葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，pH6.9。
發酵培養基葡萄糖50g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm試管中裝發酵培養液(即發酵培養基)30ml，CaCO30.5g/試管，121℃滅菌15分鐘。
將保藏號為CCTCC No.M 207015的費氏丙酸桿菌NX-4接兩環于種子培養基中，33℃培養36h得種子液，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養42h后，加入1g二甲基苯并咪唑，繼續培養60h，最后得到的發酵液中丙酸的含量為25.3g/L；發酵菌體中含維生素B1222mg/L。
實施例2發酵培養基葡萄糖60g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；500ml容積的三角瓶中裝發酵培養液300ml，CaCO35g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養基，配方與培養方法同實施例1，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養48h后，加入1g二甲基苯并咪唑，繼續培養68h，最后得到的發酵液中丙酸的含量為28.8g/L；發酵菌體中含維生素B1231mg/L。
實施例3發酵培養基葡萄糖20g/L，乳酸80g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。25×200mm試管中裝發酵培養液30ml、CaCO31g/試管，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養基，配方與培養方法同實施例1，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養140小時，發酵液中含丙酸38.5g/L。
實施例4發酵培養基葡萄糖20g/L，乳酸120g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容積的三角瓶中裝發酵培養液140ml、CaCO36g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養基，配方與培養方法同實施例1，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養150小時，發酵液中含丙酸53.5g/L。
實施例5發酵培養基甘油80g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容積的三角瓶中裝發酵培養液140ml、CaCO33.5g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養基，配方與培養方法同實施例1，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養80小時，發酵液中含丙酸38.5g/L。
實施例6發酵培養基木糖20g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm試管中裝發酵培養液30ml、CaCO31g/試管，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養基，配方與培養方法同實施例1，將種子液按發酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發酵液中，35℃培養72h，最后得到的發酵液中丙酸的含量為10.8g/L。
<110>南京工業大學<120>利用費氏丙酸桿菌NX-4制備丙酸及聯產維生素B12的方法<160>1<210>1<211>976<212>DNA<213>費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)<400>1cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgcggga 60tgacggcctt cgggttgtaa accgctttca tccatgacga agcgcaagtg acggtagtgg 120gagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt gatacgtagg gtgcgagcgt 180tgtccggaat tattgggcgt aaagagcttg taggcggttg atcacgtcgg aagtgaaatt 240ccagggctta actctgggct tgctttcgat acgggttgac ttgaggaatg taggggagaa 300tggaactctc ggtggagcgg tggaatgcgc agatatcggg aagaacacca gtggcgaagg 360cggttctctg gacatttcct gacgctgaga agcgaaagcg tggggagcaa acaggcttag 420ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggtactaggt gtgggtccct tccacggggt 480ccgtgccgta gctaacgcat taagtacccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac 540tcaaaggaat tgacggggcc ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac 600gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatgta ctggaagcgt tcagagatgg gcgtgccttt 660ttggctggta cacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 720agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtccaa tgttgccagc agttcggctg gggactcatt 780ggagaccgcc ggggccaact cggaggaagg tggggatgag gtcaagtcat catgcccctt 840atgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa gagttgcgag cctgtgaggg 900tgagcgaatc tcagaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga 960agtcggagtc gctagt 97權利要求
1.一種費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，其在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號是CCTCC No.M 207015。
2.利用費氏丙酸桿菌NX-4制備丙酸及聯產維生素B12的方法，其特征在于將保藏號為CCTCC M 207015的菌株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的培養基中，進行靜態培養，可制得丙酸或聯產丙酸與維生素B12。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的培養基中，各組分用量按重量體積百分比計為碳源用量為培養基的2～10％，氮源用量為培養基的2～4％，無機鹽用量為培養基的0.01～1％，其余為水。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的培養基中，碳源為葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一種或多種，氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一種或多種，無機鹽為鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽或鹽酸鹽中的一種或多種。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于靜態培養的條件為初始pH為6.0～7.0，培養溫度為28～37℃，培養時間為48～150小時。
全文摘要
本發明公開了一種費氏丙酸桿菌NX－4及利用該菌生產丙酸和維生素B
文檔編號C12P19/42GK101045910SQ200710020579
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月13日 優先權日2007年3月13日
發明者徐虹, 洪厚勝, 李莎, 楊麗, 熊強, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學