專利名稱：一種熱啟動耐高溫dna聚合酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種熱啟動耐高溫DNA聚合酶及其制備方法，更具體的是涉及一種通過化學修飾生產的熱啟動耐高溫DNA聚合酶及其制備方法，屬于生物化學中蛋白質化學領域。
背景技術：
目前，耐高溫DNA聚合酶已廣泛用于分子生物學中基因檢測，基因克隆等技術領域，其主要功能是通過DNA聚合酶鏈式反應對待檢測DNA進行信號放大。其基本原理類似于DNA的天然復制過程。DNA聚合酶鏈式反應由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至引物退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸DNA模板--引物結合物在耐高溫DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。如此循環幾十次后就能將待擴增的基因擴增放大幾百萬倍。在PCR反應中，熱啟動PCR是除了優化引物設計、PCR條件之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管耐高溫DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，但該酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。目前實現PCR熱啟動方法包括手工熱啟動方法、蠟防護層包裹法、抗體修飾法以及化學修飾法等幾種。其中手工熱啟動方法由于操作煩瑣，目前已較少人使用；蠟防護層包裹法由于工藝復雜以及熱啟動效果較差，不是一種理想的產業化方法；抗體法通過抗體特異性封閉酶活性中心，但該方法中的酶與抗體結合屬于非化學鍵結合，在熱啟動酶保存過程中易出現抗體活性下降，熱啟動效果喪失的風險，同時抗體修飾法很難完全封閉酶的所有活性，因此也不是一種真正意義上最佳的封閉耐高溫DNA聚合酶酶活的熱啟動修飾方法；化學修飾法通過化學物質與耐高溫DNA聚合酶肽鏈上氨基形成穩定的酰氨鍵，在常溫下可完全封閉酶的活性，通過高溫將酰氨鍵水解，耐高溫DNA聚合酶活性重新顯示出來，因此該方法是目前生產熱啟動耐高溫DNA聚合酶最理想的方法之一。

發明內容
本發明的目的是提供一種熱啟動耐高溫DNA聚合酶，該DNA聚合酶在DNA聚合酶鏈式反應過程中，極大地降低了DNA聚合酶在低溫時的3’到5’端的延伸活性，從而極大地提高了該DNA聚合酶的反應特異性、可靠性、均一性和靈敏度。這種熱啟動DNA聚合酶可廣泛地應用于分子生物學中涉及到的各類DNA聚合酶鏈式反應，尤其適合于人類STR-PCR DNA復合擴增基因分型產品中。
本發明的另一個目的是提供一種制備上述熱啟動耐高溫DNA聚合酶的方法，即化學修飾法。
為實現上述目的，本發明所采用的技術方案為經化學修飾的熱啟動耐高溫DNA聚合酶，其分子結構如下述通式(I)
其中R1，R2，R3各自代表氫、鹵素、羥基、羧酸、乙酸、硫化氫、磺酸基、硝基、氨基、亞氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
通過化學修飾制備熱啟動耐高溫DNA聚合酶的方法，該方法包括以下步驟A將通式為(II)的化學修飾物溶解于無水乙醇、二甲基亞砜、無水四氫呋喃或甲酰胺至溶液終濃度為0.1-10mol/L；將以上化學修飾物溶液按摩爾比2-100∶1加入pH為7.5-10的耐高溫DNA聚合酶溶液中，0-45℃反應2-48小時； 其中，R為琥珀酸、磺酸基、單硝基、多硝基、單氟或多氟取代的苯酚；R1，R2，R3各自代表氫、鹵素、羥基、羧酸、乙酸、硫化氫、磺酸基、硝基、氨基、亞氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
B、將反應產物采用透析、過柱或超濾方法純化，即得到熱啟動耐高溫DNA聚合酶；化學修飾法生產熱啟動耐高溫DNA聚合酶反應原理如圖1。
其中所述的化學修飾物溶解于無水乙醇、二甲基亞砜、無水四氫呋喃或甲酰胺至溶液終濃度優選范圍為1-3mol/L，化學修飾物溶液按摩爾比為10-30∶1的優選比例加入pH為8.0-8.5的耐高溫DNA聚合酶溶液中，4-10℃反應6-14小時。在該條件下整個修飾反應比較溫和，修飾反應徹底，同時不會出現蛋白質變性現象。由于在低溫反應，耐高溫DNA聚合酶活性不易喪失，反應時間比較恰當，適合于產業化。
要求所生產的耐高溫DNA聚合酶比活力大于30U/ul，其中1單位的酶活力定義為在74℃，30分鐘內，以活性化大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，催化10mmol的脫氧核苷酸摻入到酸不溶性物質所需酶的量。反應條件50ul體系中，包括50mM Tris-HCl(25℃，pH9.0)，50mM NaCl，10mM MgCl2，200uM的dATP、dCTP、dGTP和放射性同位素標記的dTTP，以及12.5ug活化的小牛胸腺DNA。同時該酶經SDS-PAGE檢測純度大于99％；經檢測無外源核酸酶活性；PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增人基因組中的單拷貝基因。
本發明的有益效果本發明提供的熱啟動耐高溫DNA聚合酶是經過化學修飾的耐高溫DNA聚合酶，在常溫下，酶活性被封閉，在95℃加熱1-20分鐘才能完全恢復正常活力開始反應，由于在初始循環的熱變性之前它沒有活性，從而抑制了低溫條件下由引物非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。擴增時具有普通耐高溫DNA聚合酶的活性，同時具有更強的特異性。該方法生產的酶可廣泛應用于高靈敏度和有較強背景基因組擴增(如基因組中某個特定基因位點或外源病原體的檢測)、熒光定量PCR、DNA序列測定、Multiplex PCR、TA克隆等。此外，采用本發明的化學修飾物所生產的熱啟動耐高溫DNA聚合酶其原酶活力保留率高，從而提高了生產效率，降低了產品的成本。


圖1是化學修飾法生產的熱啟動耐高溫DNA聚合酶反應原理圖；圖2是以人基因組DNA為模板，擴增319bp片段的瓊脂糖凝膠電泳鑒別結果；圖3是化學修飾法生產的熱啟動耐高溫DNA聚合酶應用于Multiplex PCR的結果。
具體實施例方式
實施例11、以2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐或2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐修飾耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生產出熱啟動耐高溫DNA聚合酶。具體生產步驟如下2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐結構式如下 2-甲基-2-丁稀-2-酸琥珀酸酐2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐結構式如下 2-甲基-2-丁稀-2-酸2，3，4，5，6-五氟代苯酚酸酐2、取Promega公司耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白濃度為50mg/ml，測定Taq酶活力為180U/ul。
3、稱取2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐或2-甲基-2-丁烯-2-酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐50mg，加入1000ul無水乙醇中。
4、取300ul 2-甲基-2-丁烯-2-酸琥珀酸酐乙醇溶液加入3ml共150mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，4℃攪拌反應14小時。
5、反應液4℃8000rpm離心10min，除沉淀。
6、上清液用截留分子量為50K(5萬道爾頓)的超濾管進行濃縮，4℃條件下8000rpm離心80min，除去反應副產物，濃縮液用pH8.0的TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCL；0.5％(V/V)吐溫-20；pH 8.0)緩沖液稀釋至反應原體積，加入與上清液等體積的甘油，混勻，即得熱啟動DNA聚合酶，-20℃保存。
實施例21、2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐修飾耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生產出熱啟動耐高溫DNA聚合酶。具體生產步驟如下2，4-己二烯酸琥珀酸酐結構式如下 2，4-己二稀酸琥珀酸酐2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐結構式如下 2，4-己二稀酸-2，3，4，5，6-五氟代苯酚酸酐2、取Promega公司耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白濃度為50mg/ml，測定Taq酶活力為180U/ul。
3、稱取2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐25mg，加入100ul二甲基甲酰胺中。
4、取100ul 2，4-己二烯酸琥珀酸酐或2，4-己二烯酸-2，3，4，5，6五氟代苯酚酸酐的甲酰胺溶液加入2.2ml共110mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，37℃攪拌反應2小時。
5、反應液4℃8000rpm離心10min，除沉淀。
6、上清液轉移至截留分子量為50K(5萬道爾頓)的透析袋中，在TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCl；0.5％(V/V)吐溫-20；pH 8.0)緩沖液中透析2天以上，期間換緩沖液6次。透析完畢后，取出酶液，加入與上清液等體積的甘油，混勻，即得熱啟動DNA聚合酶，-20℃保存。
實施例31、以3，5-二硝基水楊酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水楊酸對硝基苯酚酸酐修飾耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)蛋白，生產出熱啟動耐高溫DNA聚合酶。具體生產步驟如下3，5-二硝基水楊酸琥珀酸酐結構式如下 3，5-二硝基水揚酸琥珀酸酐3，5--二硝基水楊酸對硝基苯酚酸酐結構式如下 3，5-二硝基水揚酸對硝基苯酚酸酐2、取Takara公司耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)，酶蛋白濃度為30mg/ml，測定Taq酶活力為100U/ul。
3、稱取3，5-二硝基水楊酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水楊酸對硝基苯酚酸酐1mg，加50ul二甲基亞砜中。
4、取30ul 3，5-二硝基水楊酸琥珀酸酐或3，5--二硝基水楊酸對硝基苯酚酸酐溶液加2ml共60mg的Taq酶蛋白中(pH8.5)，37℃攪拌反應2小時。
5、反應液4℃8000rpm離心10min，除沉淀。
6、上清液過葡聚糖凝膠G25柱，TQ(20mM Tris-HCl；0.1mM EDTA；0.1M KCl；0.5％(V/V)吐溫-20；pH 8.0)緩沖液為洗脫液，收集第一個蛋白峰，加入與上清液等體積的甘油，混勻，即得熱啟動DNA聚合酶，-20℃保存。
實施例4以人基因組DNA為模板，擴增319bp的片段，其中模板2ul(2ng)，10uM Primer(up and low)10ul，10×HotstartTaq Buffer 5ul，25mM MgCl24ul，熱啟動耐高溫DNA聚合酶(5U/ul)1ul，補水至50ul；按如下條件反應95℃11min熱變性，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃保10min。同時以未修飾前的DNA聚合酶(5U/ul)做平行對照。結束PCR反應后，取反應產物5ul，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2，其中泳道1DL2000Marker；泳道2-5熱啟動DNA聚合酶擴增產物，泳道2-5普通DNA聚合酶擴增產物。從結果可知，采用熱啟動耐高溫DNA聚合酶擴增的強度和靈敏度明顯增加。
實施例5本發明的熱啟動耐高溫DNA聚合酶應用于MultiplexPCR。以ABI公司AmpF1STRIdentifilerTMPCR擴增試劑盒為例，其中模板2.5ul(0.25ng)，Identifiler PCR ReactionMix 10ul，Identifiler Primer Set 5ul，熱啟動耐高溫DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul，補水至25ul；按如下條件反應95℃11min熱變性，94℃變性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環，最后60℃保溫60min。同時以未修飾前的耐高溫DNA聚合酶(5U/ul)做平行對照。反應結束后取反應產物上ABI310或3100設備檢測。結果顯示使用未修飾前的耐高溫DNA聚合酶進行PCR，各STR位點均不能獲得有效擴增(圖片未顯示)；而采用熱啟動耐高溫DNA聚合酶進行PCR，各STR位點均獲得了有效擴增，結果見圖3。
權利要求
1.一種熱啟動耐高溫DNA聚合酶，其分子結構如下述通式(I) 其中R1，R2，R3各自代表氫、鹵素、羥基、羧酸、乙酸、硫化氫、磺酸基、硝基、氨基、亞氨基、乙烯基、羰基或乙炔。
2.制備權利要求1所述的熱啟動耐高溫DNA聚合酶的方法，該方法包括以下步驟A將通式為(II)的化學修飾物溶解于無水乙醇、二甲基亞砜、無水四氫呋喃或甲酰胺至溶液終濃度為0.1-10mol/L， 其中，R為琥珀酸、磺酸基、單硝基、多硝基、單氟或多氟取代的苯酚；R1，R2，R3各自代表氫、鹵素、羥基、羧酸、乙酸、硫化氫、磺酸基、硝基、氨基、亞氨基、乙烯基、羰基或乙炔，將以上化學修飾物溶液按摩爾比2-100∶1加入pH為7.5-10的耐高溫DNA聚合酶溶液中，0-45℃反應2-48小時；B、將反應產物采用透析、過柱或超濾方法純化，即得到熱啟動耐高溫DNA聚合酶。
3.如權利要求2所述的制備熱啟動耐高溫DNA聚合酶的方法，其特征在于所述的化學修飾物溶解于無水乙醇、二甲基亞砜、無水四氫呋喃或甲酰胺至溶液終濃度為1-3mol/L。
4.如權利要求2所述的制備熱啟動耐高溫DNA聚合酶的方法，其特征在于化學修飾物溶液按摩爾比為10-30∶1加入pH為8.0-8.5的耐高溫DNA聚合酶溶液中，4-10℃反應6-14小時。
全文摘要
本發明涉及一種熱啟動耐高溫DNA聚合酶及其制備方法，通過特定的化學修飾法來可逆地封閉DNA聚合酶的活性，同時該酶在弱堿性條件下(pH＝8－9)經高溫(94℃以上)處理一定時間，DNA聚合酶的活性經過解封閉逆轉而得到恢復。經過該方法修飾的耐高溫DNA聚合酶在DNA聚合酶鏈式反應過程中，極大地降低了DNA聚合酶在低溫時的3’到5’端延伸的酶活性，從而極大地提高了該DNA聚合酶的反應特異性、可靠性、均一性和靈敏度。利用該方法生產的熱啟動耐高溫DNA聚合酶可廣泛地應用于分子生物學中涉及到的各類DNA聚合酶鏈式反應，尤其適合于人類STR－PCR DNA復合擴增基因分型產品中。
文檔編號C12N15/52GK101050453SQ20071006512
公開日2007年10月10日 申請日期2007年4月4日 優先權日2007年4月4日
發明者鄭衛國, 熊勇華, 陳光輝, 涂祖新 申請人:無錫中德美聯生物技術有限公司