專利名稱：一種耐高溫Pyrolobus聚合酶及其高效表達質粒和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因重組技術領域，具體涉及一種耐高溫Pyrolobus聚合酶及其高效表達質粒和應用。
背景技術：
現有的耐熱DNA聚合酶大多來源于嗜熱菌。嗜熱菌成為許多耐高溫酶的主要來源，受到科學家的廣泛關注。DNA聚合酶耐高溫性對其在DNA擴增，DNA測序，DNA探針標記以及反轉錄等應用中必不可少的品質。在DNA擴增中應用廣泛的聚合酶鏈式反應(PCR)是一個依賴于周期性的加熱和冷卻的循環過程。首先復制的雙鏈DNA模板在高溫(94°C 98°C) 下變形成單鏈DNA，單鏈DNA在降溫后和引物雜交，然后聚合酶在最適合溫度下由引物合成一條和單鏈DNA配對的新DNA片段。每個循環DNA的總量就增加一倍。一般的PCR反應需要2(Γ40個循環。催化此反應的聚合酶耐高溫是催化的重要前提?，F有的耐高溫的有商業價值的聚合酶，例如Taq來源于嗜熱菌(Ser^AS a卯aiicm)，其最適合溫度在75°C ^80°C， 在95°C下的半衰期有池。但Taq的保真性和速度都不高。Pyrococcus是一類在100°C下生長的嗜熱古菌。ykPyrococcus中分離的聚合酶，有很好的保真性但較慢的速度。Pyrolobus fumarii是另一類超嗜熱古菌。在1997年首次在大西洋中脊背的超熱礦物質噴口處被發現，可以在高達113°C下繁殖。其基因組在2011年9月21號完成發布。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種耐高溫 Pyrolobus聚合酶，以使其較高的溫度耐受性。本發明的另一目的是提供一種高效表達 Pyrolobus聚合酶的質粒。本發明還有一目的是提供一種高效表達Pyrolobus聚合酶的體系。本發明還有一目的是提供一種構建高效表達Pyrolobus聚合酶的體系的方法。本發明還有一目的是提供一種構建高效表達Pyrolobus聚合酶的質粒的方法。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下
一種耐高溫Pyrolobus聚合酶，所述的Pyrolobus聚合酶為YP_004780419. 1蛋白，在 Pyrolobus聚合酶的碳端有用連接序列GGSG連接的ko7d DNA結合蛋白；其中，Pyrolobus 聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA結合蛋白的序列如序列表中的序列3所
7J\ ο一種用于表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的DNA，片段包括在5，端的NdeI的限制性內切酶位點、Pyrolobus聚合酶編碼序列、GGSG連接序列、Sso7d的編碼序列和3’端的BioI 的限制性內切酶位點，DNA具體序列如序列表中的表2所示。一種高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒，質粒載體為pEI^8a，在其上克隆有上述的用于表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的DNA。一種構建高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒方法，包括酶切反應、連接反應和質粒質量檢測，其中，
酶切反應50μ L酶切反應體系包括500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a 載體，5 μ L反應緩沖液，0. 5 μ L NdeI，0. 5 μ L BioI，補水至50 μ L ;37°C，保溫Ih ；反應結束后，過柱純化；
連接反應20 μ L連接反應體系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10 μ L快速連接酶反應緩沖液，1 μ L Τ4 DNA連接酶，加蒸餾水至20 μ L ;25°C， 保溫5min，轉至冰上冷卻； 質粒質量檢測為測序檢測。一種高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶體系，表達菌株為T7表達菌株BL21 DE3， 在其內轉化有權利要求3所述的高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒。一種構建高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶體系的方法，將上述的高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒轉化入T7表達菌株BL21 DE3 ；具體包括感受態細胞冰上解凍細胞lOmin，加入Ing的檢測正確的質粒DNA，混勻，置于冰上30min。然后42°C熱激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室溫的SOC培養基，37°C，250rpm振蕩培養60min，取2 μ L加 98 μ L培養基混勻細胞涂布于氨芐霉素的選擇平板上，37°C過夜培養。 上述的耐高溫Pyrolobus聚合酶在PCR反應中的應用。有益效果與現有的耐熱DNA聚合酶相比，本發明的耐高溫Pyrolobus聚合酶具有的突出優點包括本發明通過在其末端連接DNA結合蛋白提高了聚合酶的效率，用體外合成修飾過的適合在大腸桿菌中表達的DNA合成重組Pyrolobus聚合酶，此酶和市場上擁有的產品有同樣的聚合酶活力并可以更有效地合成大片段DNA。另外，Pyrolobus聚合酶有很強的耐高溫性，即使在98°C下處理證仍有活力，此酶將在DNA合成，測序及標記探針合成等領域有廣泛應用，具有很好的實用性，能夠產生很好的經濟效益和社會效應。


圖1是載體pET28a的質粒圖譜；
圖2是純化從組蛋白的SDS - PAGE電泳分析；圖中，泳道1為75°C熱處理后的粗蛋白；泳道2為過柱上清(flow through)，泳道3為漂洗(wash)，泳道壙19為洗脫的純化蛋白；
圖3是檢測聚合酶的活力的電泳圖；圖中，泳道1是DNA分子量標準；泳道2-5是PCR 反應用Pyrolobus聚合酶合成的0. 5Kb (2)、1Kb (3) ,2Kb (4)和4Kb (5) PCR的反應產物；泳道 6-9 是用 Phusion 聚合酶的 0. 5Kb (6)、1Kb (7)、2Kb (8)和 4Kb (9) PCR 的反應產物；
圖4是Pyrolobus聚合酶的熱穩定性的檢測電泳圖；圖中，Pyrolobus聚合酶在98°C下處理Oh (泳道l)，lh (泳道2)，2h (泳道3)，3h (泳道5)，4h (泳道6)后、5h (泳道7)后合成4Kb的PCR反應產物。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。實施例1
由Pyrolobus fumarii的超嗜熱性推斷其聚合酶有高耐熱性，用已知的Pyrococcusfuriosus DNA聚合酶蛋白質序列(NP_577941. 1)作為靶子在/^ro/o/ws fummarii的基因組中查詢，調出了 Pyrfu_0295編碼蛋白(YP_004780419. 1 )，其蛋白質序列含803氨基酸，具體序列如序列表中序列1所示。對Pyrfu_0295蛋白的結構分析，發現和/^rococcm furiosus DNA聚合酶共享36%同樣氨基酸序列，55%相似氨基酸。除了其碳端聚合酶結構領域，還包括在其氨基端的3’到5’的外切酶區域可以幫助檢測基因復制錯誤。初步鑒定了 Pyrolobus聚合酶有和Pyrococcus聚合酶類似的功能。聚合酶和DNA的結合是整個催化反應的限速步驟，加快酶和DNA的結合速度可以提高酶的整體效率，減短反應時間。為了加快酶和DNA的結合速度，本發明把小且沒有序列特意性的和DNA緊密結合的ko7d (1BBX_C) DNA結合蛋白用減短的4個氨基酸的連接序列(GGSG)連接在Pyrolobus聚合酶的碳端來提高和DNA的結合速度。實施例2
培養嗜熱菌有各種技術障礙，比如它們不能在固體凝膠上生長，古菌細胞共同生長成網絡結構，單個細胞脆弱幾乎不存在，這使得在實驗室發酵培養困難叢叢，價格昂貴。另外， 在Pyrolobus中原始聚合酶的表達量低，又將進一步提高成本。重組蛋白蛋白表達純化技術已經在各個酶技術中廣泛應用?？纱罅颗囵B的宿主包括細菌，真菌，植物或真核細胞。在本發明中大腸桿菌將被用于大量表達此Pyrolobus聚合酶。但是因為各種生物都有其最適合的編碼表的不同，當原始的Pyrolobus聚合酶的基因在大腸桿菌中表達時，蛋白表達量低到很難檢測的程度。為了提高Pyrolobus聚合酶的表達量，Pyrolobus聚合酶的氨基酸序列用來反向翻譯成適合在大腸桿菌中合成的基因序列。新設計的基因在核酸序列上和原始基因有25%的編碼差別。整個序列用體外合成的方法合成。體外合成的用于克隆的DNA包括以下幾個片段在5’端的NdeI的限制性內切酶位點，Pyrolobus聚合酶編碼序列，GGSG 連接序列，Sso7d的編碼序列和3’端的B10I的限制性內切酶位點，具體序列見序列表中的表2。合成基因用NdeI和B10I限制性內切酶處理后連接到用同樣限制性內切酶處理后克隆載體pET28a (Novagen Cat#69864-3)上，如圖1所示。在pET28a上有高表達的T7啟動子?？寺『玫谋磉_載體經過測序來確保編碼基因序列的準確性。表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3) (NEB C2527)菌株中誘導表達。具體步驟包括
(1)限制性內切酶反應
兩個5(^1^反應體系包括500叫DNA (合成基因或pET28a載體)，5yL反應緩沖液 (100 μ g/mL BSA，20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg (Ac)2, 50 mM Kac, 1 mM DTT, pH 7. 9),0. 5μ L NdeI (NEB R0111) ,0. 5μ L XhoI (NEB R0146)，補水至 50 μ L。37°C，保溫lh。反應結束后，過柱純化。(2)基因和載體連接反應
20 μ L反應體系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后基因，IOyL快速連接酶反應緩沖液，1 μ L T4DNA連接酶，加蒸餾水至20 μ L。
25 °C,保溫5min，轉至冰上冷卻。
(3)連接反應樣品轉化到大腸桿菌
感受態細胞(NEB C3019)冰上解凍細胞10π η，ΜΛ 5ng的質粒DNA連接樣品(2 μ L)， 混勻，置于冰上30min。然后42°C熱激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室溫的SOC培養基，37°C，振蕩(250rpm)培養60min?；靹蚣毎⒂肧OC做系列10倍稀釋。每個稀釋比例取100 μ L稀釋液涂布于氨芐霉素的選擇平板上，37°C過夜培養。第二天，挑選8個獨立菌落培養在2mL的LB培養基中37°C培養后，抽提質粒。用NdeI和B10I酶切找出含克隆基因的質粒并測序保證編碼序列的準確性。實施例3
將實施例2測序鑒定正確的表達質粒轉化至T7表達菌株BL21 (DE3)，涂布于氨芐霉素選擇平板，37°C培養過夜。挑一個獨立菌落到IOmL含100μ g/mL的氨芐霉素的液體培養基中，37°C，培養直至OD6c 達到 0.4 0. 6后，加 40 μ L 100 mM IPTG (Sigma 15502)貯存液(終濃度為0. 4mM)，37°C，誘導4h，30°C，生長5h或16°C生長過夜。取40 μ L樣品進行10 20% iTris —甘氨酸SDS— PAGE (Invitrogen Cat#EC61352B0X)電泳分析，通過考馬斯亮藍染色蛋白膠、Western Blot檢測表達情況后，發現37°C誘導池的表達量最高。大規模表達時， 取新鮮IOmL培養液接種到IOL液體培養基(含抗生素)中，37°C培養直至0D_達到0. 4^0. 6 后，加IPTG至終濃度為0.4 mM，37°C，誘導4h。離心收集細胞，去除上清。收集的IOL表達細胞溶解在加有蛋白酶抑制劑(Roche Cat#11873580001)和溶菌酶(Sigma L6876)的 400mL 細胞裂解液(20mM NaP,500mM NaCl, IOmM imidizole, ImM DTT, 10% glycerol，pH7. 4)中，超聲波破碎細胞。然后12500rpm離心30min后取上清中可溶聚合酶。利用聚合酶的熱穩定性，75°C熱變性20min來沉淀大部分不穩定大腸桿菌的雜蛋白。再次離心后，取上清進行親和6組氨酸標簽純化。400ml樣品加到有4X5ml的鎳柱結合(GE Cat#17-5M7-01)，用2L含20mM咪唑洗去雜蛋白，最后用20mlT400mM的梯度咪唑競爭洗脫，收集洗脫樣品后進行10 20% Tris 一甘氨酸SDS — PAGE (Invitrogen Cat#EC61352B0X)電泳分析，如圖2所示。集中收集樣品5號到15號后，在蛋白保存緩沖液中(20mM Tris-HCl, IOOmM KCl, ImM DTT, 0. ImM EDTA, 50% glycerol)透析兩次，純化的蛋白在一 20°C保存。其中，高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒轉化入T7表達菌株BL21 (DE3) 具體步驟包括感受態細胞(NEB C2527)冰上解凍細胞lOmin，加入Ing的檢測正確的質粒 DNA,混勻，置于冰上30min。然后42°C熱激30s，再置于冰上5min。加入950 μ L室溫的SOC 培養基，370C，振蕩(250rpm)培養60min。，取2 μ L加98 μ L培養基混勻細胞涂布于氨芐霉素的選擇平板上，37 °C過夜培養。實施例4
純化蛋白的在PCR的反應中鑒定DNA聚合酶活力并和市場上最耐高溫的Wiusion聚合酶相比較合成四種不同大小的基因片段的能力。用于PCR的四對引物由IDT (Integrated DNA Technologies)合成，其序列如下
(1)用于合成495bp E.coli IspA 基因: IF :ATGAGTCAATCGATCTGTTCAACAGGG,
IR TTATTGTTTTTTCGCTCTAGAAGGCAA ；
(2)用于合成U87bp Ε. coli thrC 基因 2F ATGAAACTCTACAATCTGAAAGATCACAACG, 2R TTACTGATGATTCATCATCAATTTACGC ；
(3)用于合成2353bp Ε. coli polB 基因3F GTGGCGCAGGCAGGTTTTATCTTAA，
3R TCAAAATAGCCCAAGTTGCCCG ；
(4)用于合成 4681bp Ε. coli LeuA, B, C, D 基因
4F :ATGAGCCAGCAAGTCATTATTTTCG,
4R :TTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGC。反應體系是50 μ L，包括0. 5 μ L (IOOng)的模板DNA (大腸桿菌的DNA，用Qiagen Cat#69504試劑盒從大腸桿菌K12 MG1655菌株中提取)，0. 5 μ L的IOOmM的一對引物，2 μ L IOX 反應緩沖液(500mM KCl, IOOmM Tris-HCl，ρΗ8· 8，25mM MgCl 2,1% Triton X-100),2yL dNTPs (IOmM), 1 μ L的聚合酶和43 μ L的蒸餾水。建立好反應體系后立即放入已經預熱至變性溫度的熱循環儀中執行，反應條件為98°C 30s ；30 個循環98°C 10s,60°C 10s，72°C 30s ；72°C 5min ；4°C降溫保存?；虮挥脕頇z測不同大小的產物合成。PCR反應樣品和染料加密度試劑混合后，上樣在1%的瓊脂膠上電泳100V，2h。隨后用溴化已錠給DNA染色后在紫外燈下照相。在圖3 中，新純化的聚合酶在現有的反應條件下和已有的酶相比，不僅有很高的酶活力，還能更有效的擴增較大的DNA片段。實施例5
為了測定聚合酶的熱穩定性，純化的酶在98°C下熱處理Hh后，在進行實施例4的擴增4Kb片段的PCR反應。圖4顯示，這種新型的來源于超嗜熱古菌Pyrolobus的聚合酶有很強的耐高溫性能。即使證的高溫處理后，仍然能有效合成4Kb的DNA。
權利要求
1.一種耐高溫Pyrolobus聚合酶，其特征在于所述的Pyrolobus聚合酶為 YP_004780419. 1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用連接序列GGSG連接的ko7d DNA結合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA結合蛋白的序列如序列表中的序列3所示。
2.一種用于表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的DNA，其特征在于片段包括在5’端的 NdeI的限制性內切酶位點、Pyrolobus聚合酶編碼序列、GGSG連接序列、Sso7d的編碼序列和3’端的B10I的限制性內切酶位點，DNA具體序列如序列表中的表2所示。
3.一種高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒，其特征在于質粒載體為pET28a，在其上克隆有權利要求2所述的用于表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的DNA。
4.一種構建權利要求3所述的高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒方法，其特征在于，包括酶切反應、連接反應和質粒質量檢測，其中，酶切反應50μ L酶切反應體系包括500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a 載體，5 μ L反應緩沖液，0. 5 μ L NdeI，0. 5 μ L BioI，補水至50 μ L ;37°C，保溫Ih ；反應結束后，過柱純化；連接反應20 μ L連接反應體系包括50ng酶切后pEI^8a，IOOng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10 μ L快速連接酶反應緩沖液，1 μ L Τ4 DNA連接酶，加蒸餾水至20 μ L ;25°C， 保溫5min，轉至冰上冷卻；質粒質量檢測為測序檢測。
5.一種高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶體系，其特征在于表達菌株為T7表達菌株 BL21 DE3，在其內轉化有權利要求3所述的高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒。
6.一種構建高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶體系的方法，其特征在于將權利要求 3所述的高效表達耐高溫Pyrolobus聚合酶的質粒轉化入T7表達菌株BL21 DE3 ；具體步驟包括感受態細胞冰上解凍細胞lOmin，加入Ing的檢測正確的質粒DNA，混勻，置于冰上 30min ；然后42°C熱激30s，再置于冰上5min ；加入950 μ L室溫的SOC培養基，37 °C，250rpm振蕩培養60min，取2 μ L力卩98 μ L培養基混勻細胞涂布于氨芐霉素的選擇平板上，37°C過夜培養。
7.權利要求1所述的耐高溫Pyrolobus聚合酶在PCR反應中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫Pyrolobus聚合酶及其高效表達質粒和應用，所述的Pyrolobus聚合酶為YP_004780419.1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用連接序列GGSG連接的Sso7dDNA結合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示。本發明通過在其末端連接DNA結合蛋白提高了聚合酶的效率，用體外合成修飾過的適合在大腸桿菌中表達的DNA合成重組Pyrolobus聚合酶，此酶和市場上擁有的產品有同樣的聚合酶活力并可以更有效地合成大片段DNA。另外，Pyrolobus聚合酶有很強的耐高溫性，即使在98℃下處理5h仍有活力，此酶將在DNA合成，測序及標記探針合成等領域有廣泛應用。
文檔編號C12N15/66GK102392000SQ20111034718
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者李志茹 申請人:李志茹