專利名稱：三葉青的組培快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種三葉青的組培快速繁殖方法。
背景技術：
植物是藥物的天然寶庫，人類利用藥用植物來防病治病已有幾千年歷史。
全世界約有75%的人口以植物作為治療疾病的藥物來源(刑建民，2001)。當今 的處方藥有25。^左右來自于藥用植物(邱德有,2000)。隨著經濟和醫療保健事 業的飛速發展，中藥資源的需求出現了空前的增長，從中藥中提取有效成分應 用于化妝品、食品及工業原料的研究也越來越深入，這些原因在不同程度上加 大了中藥資源的壓力。加之長期以來，對開發利用中藥資源的認識不足， 一些 地區不同程度上對中藥資源進行了掠奪式的過度采收，致使很多中藥資源蘊含 量下降，甚至耗竭， 一些種類瀕臨滅絕(黃璐琦，2001)。生物技術的蓬勃發展 為從根本上改變傳統藥材的生產提供了一個嶄新的方法。植物組織和細胞培養 技術則是其中一個重要的手段。近年來，國內外在這方面已做了大量工作，己 成功離體培養獲得試管植株的藥用植物有200多種。
三葉青(T^raWgma/zems/wam/mDielsetGilg)為葡萄科崖爬藤屬多年生常 綠草質蔓生藤本。異名為蛇附子(《植物名實圖考》)，石抱子(《江西草藥》)， 金線吊葫蘆、三葉對(《浙江民間常用草藥》等，為民間常用的中草藥(中藥辭海， 1993)。三葉青常生長于山坡或山溝，溪谷兩旁林下陰處。主要分布在浙江、江 西、福建、湖北、湖南，廣東、四川、貴州、云南、臺灣等地(浙江植物志，1993)。 三葉青以塊根或全草入藥，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛的功能，用于 治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝炎、風濕、月經不調、咽痛、瘰疬等癥，具有 很好的療效(中藥辭海，1993)。有關三葉青的化學成分研究近幾年非常熱門， 三葉青不同部位化學成分的鑒定也有較多報道。三葉青根中含槲皮素、山柰酚、 山柰酚一3—0—新橙皮糖苷、(3-谷甾醇、胡蘿卜苷及6 '—O-苯甲酰基胡蘿卜苷 (楊大堅，1998:李瑛琦，2003)。三葉青地上部分含蒲公英萜醇、蒲公英萜 酮、P—谷甾醇及麥角甾醇(劉東，1999)。藥理實驗表明三葉青提取物具有一 定的腫瘤抑制作用(楊大堅，1998; 丁鋼強，2005;馮正權，2006)、顯著的抗 病毒及抗出血熱的作用(楊學樓，1989;楊大堅，1998)和明顯的消炎、鎮痛 與解熱作用(資古明，1989;黃真，2005)及保肝作用(伍昭龍，2006;鐘曉明， 2006)。大鼠經口急性毒性實驗表明(江月仙，2005)，按急性毒性分級標準
判定，屬實際無毒；進一步小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗結果均 為陰性，說明三葉青未顯示有致突變性。臨床上主要用于抗癌及抗艾滋病毒、 治療血液病與心腦血管疾病、肝炎、腦膜炎、急性支氣管炎、肺炎、腸炎及咽 喉炎等感染性疾病，小兒外感高熱等(伍昭龍，2006)。
由于本種植物用途廣泛、藥效顯著，毫無節制地狂采濫挖，加上三葉青對 生長環境要求苛刻，這種珍貴的草藥現已瀕臨滅絕。現有的三葉青野生資源根 本難以滿足日益增長的醫藥領域的需要。為了保護野生的三葉青資源，同時又 能滿足醫藥工業的應用，因此有必要建立三葉青的離體再生體系，這對豐富植 物組織培養的理論和應用生物技術保護種質資源以及滿足臨床應用等均有重要 意義。
然而，由于野生三葉青對生境要求苛刻(須生長在海拔700米的深山密林 和懸崖峭壁的背陰面，上面要有散射光，旁邊要有細水滲出，下面要有樹葉覆 蓋，常年氣溫保持在18。C左右)，生長周期長，黃酮類及酚類物質含量高，非常 容易褐化，導致常規的組織培養技術十分難于對其進行快繁。
迄今為止，在國內外未見關于三葉青組織培養快繁成功的報道。我們通過 大量試驗，終于摸索出一套成熟的方法，成功實現了三葉青的組培快繁，可以 快速培育出大量幼苗，為中藥材GAP種植提供一種切實可行的開發項目。
參考文獻
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文中所提及的縮寫字母的以及見如下縮略詞表
MSMurashige and SkoogMS培養基
medium
BA6- benzyladenine6-芐基腺嘌呤
KTkinetin激動素
NAAa-naphthaleneacetic acidot-柰乙酸
IBAindole-3-butyric acid吲哚丁酸
ZTzeatin玉米素
GA3gibberellic acid;3赤霉素
PVPpolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮
ACActivated charcoal活性炭

發明內容
本發明的目的是提供一種三葉青的組培快速繁殖方法。
三葉青的組培快速繁殖方法的步驟如下
1)優選完整的腋芽為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗 30 40分鐘后，置于75%酒精中處理20 30秒，然后在經0.1%的升汞Hgcl2 消毒6 10分鐘后用無菌水沖洗，將腋芽接種于誘導培養基中，誘導培養為
MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l;
2) 將生長于誘導培養基上外植體轉接于 MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、 MS+BA0.5mg/l +PVP0.5g/l、 MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l、 MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/域 MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上的培養基上進行增殖培養；
3) 將進行增殖培養的高度為3 4公分壯苗轉入生根培養基中，生根培養基 為1/2MS+NAA0.3mg/1或l/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l;
4) 將己生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為l: 1 2的混合基質上。 所述的將腋芽接種于誘導培養基中將所選取的腋芽接種于誘導培養基中，
培養2 3周，看到有許多綠色的芽點和小的不定芽出現，誘導培養基的pH值 5.8 6.0，培養溫度25 27 °C，每天光照時間為16小時，光照強度為35 40 |umol.irf2.s-1。
所述的將生長于誘導培養基上芽轉接于增殖培養基上進行增殖培養培養 20 25天，可見小芽可長成3 4公分的無根苗，每個芽的周圍有2 6個新芽 出現，將叢生芽在無菌條件下取出，用解剖刀分開，置于上述增殖培養基中培 養，在20 25天內，各芽再生出一至數個新芽。
所述將高度為3 4公分的壯苗轉入生根培養基中首先在黑暗條件下培養 2 3天，隨后轉到光下培養7 10天可誘導形成根，再培養20 25天形成發達 的根系。
所述的將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為1: 1 2的混合基 質上將裝有生根幼苗的培養容器置于自然溫度、光照的環境下鍛煉5 7天， 然后打開瓶蓋，放置1 2天后，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖
泥炭土為1: 1的混合基質培養20 35天，開始的10 14天溫度為23 25 。C， 相對濕度為70 80%。
本發明的優點(1)三葉青的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、 氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵染和農藥殘留的影響，嚴格
控制三葉青藥材的質量。(2)增殖速度快，生產周期短，設備簡單，占地面積 少，能節省人力、物力等，便于工廠化生產。(3)在組培過程中進行脫毒處理， 提高三葉青的品質，有效解決野生三葉青品質不穩定，外觀和有效成分不勻的 問題，為生產道地藥材和產后加工銷售提供保障條件。(4)該技術方法解決了 三葉青快速繁殖和穩定生根的重要技術環節，達到技術穩定，繁殖系數高的要 求，可應用于工業化生產的目的。(5)使用本發明提供的組培快繁技術得到的
三葉青幼苗進行人工栽培，可以得到個體差異小，品質均一的三葉青成品，可 以為臨床應用提供品質穩定的原材料。(6)可以保存三葉青的種質資源，同時 有利于保護野生資源，減少對自然資源的破壞。
具體實施例方式
三葉青的組培快繁技術，包括外植體的選取與處理、誘導培養、增殖培養、 生根培養、移栽等步驟。具體地操作中，可優選三葉青的腋芽為培養材料。經
洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗30 40分鐘后，75%酒精處理20 30秒， 0.1%HgCl2 (內加2 3滴吐溫T-20)滅菌處理6 10分鐘，無菌水沖洗3 5次后， 接種于MS+BA1 .Omg/l或MS+BAl.0+IBAO. 1的啟動培養基中進行誘導培養。在溫 度為25 27。C，每天光照16小時，光強35 40nmoLm-ls"的溫室中培養15 20 天。然后將每個外植體基部得到的從生芽切開，置于MS+BA0.5mg/1、 BA0.5mg/l+NAA0.05mg/1、 KT1.0mg/1、 KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l或ZTlmg/l培養 基中進行增殖培養。培養條件同上述誘導培養基。20 30天后，每個外植體可 以得到2 6株綠色健壯、高度達到3 4公分的植株。將需要生根的幼苗轉移至 1/2MS+NAA 0.3mg/l或1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l培養基上 進行生根培養。培養條件同上述誘導培養。7 10天后可以看到有根原基形成， 20 25天完成生根。將裝有生根植株的培養容器取出，于自然環境下放置5 7 天后打開瓶蓋，在培養基表面澆少量水，再放置1 2天，然后將苗取出，將植 株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (h 1)的混合基質上。開始 10天保持環境溫度23 25。C，相對濕度在70% 80%，隨后即可逐漸過渡到自然 的環境條件。煉苗一個月后移栽到大田，可達到90%的存活率。
上述技術中誘導、增殖及生根步驟的培養基的pH值均為5.8 6.0，培養溫度 25 27°C，每天光照16小時，光照強度35 40pmol，m'2.s"。
使用本發明將三葉青的腋芽接種后，20 30天可誘導形成叢生芽， 一般誘 導率達到78 95%。在此基礎上繼代培養，叢生芽可大量繁殖，大約每25天繼代 一次，平均增殖倍數為5.4。把繼代后的叢生芽轉移到本發明提供的生根培養基 中20 25天可大量發根，出根率在90%左右，培養30 45天可出瓶煉苗。
采用上述措施的本發明，掌握了三葉青組織培養中叢生芽的誘導和生長， 壯苗、生根等關鍵階段的技術，成功解決了三葉青組培中生根困難、增殖率低、 成活率低等困難，使三葉青這一珍稀藥用植物實現快速育苗、工廠化栽培成為 可能。使用本發明同時可以有效地保護這一珍稀野生植物資源、減少私挖濫采、 形成可持續利用和合理開發相互協調的良性循環。
本發明的優點體現在提供了三葉青的組織培養和快速繁殖技術，摸索出 了快速繁殖及其穩定生根等重要環節的關鍵性技術， 一個外植體一年就可克隆 繁殖出數萬株后代，為該藥用植物的商品化生產提供了一套切實可行的生產技 術路線，可以應用于三葉青的大規模工業化生產。 本發明采用下述非限定性實施例作進一步的說明。 實施例l
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后，
置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1XHgCl2 (內力B2滴吐溫T-20)滅菌處理6 分鐘后用無菌水沖洗3次后，接種于MS+BA1.0mg/l培養基上，培養室的溫度為 25°C，光照強度為35 pmol.m々s"，培養15天，可見每個外植體上有3 6個新芽 出現，將長有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開，分別置于裝 有上述相同培養基的培養容器中培養，20天后，各培養容器內的芽可再生出數 個新芽。再將每個芽分開，轉接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培 養基上進行連續培養，以達到快速增殖的目的，其中加入抗氧化齊UPVP0.5g/l防 止褐化。培養20天后，將需要生根的三葉青植株轉移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培養基上進行生根培養。20天可生根。將已生根植 株的培養瓶取出，于自然環境下放置5天后打開瓶蓋，在培養基表面澆少量水， 再放置1天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭 土 (1: 1)混合基質上。保持環境相對濕度在70%左右。最初兩周避免直射光照 射， 一個月后移栽到大田中，可達到85%的存活率。 實施例2
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進行表面滅菌處理流水沖洗40分鐘后， 置于75%酒精中處理20秒，然后用0.1XHgCl2 (內力口3滴吐溫T20)滅菌處理IO 分鐘后用無菌水沖洗5次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養基上，培養 室的溫度為27。C，光照強度為40^imol.rr^.s"，培養20天，可見每個外植體上有 4 7個新芽出現，將長有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養基的培養容器中培養，20天后，各培養容器內的芽 可再生出數個新芽。再將每個芽分開，轉接于MS+BA0.5mg/1十PVP0.5g/l上培養 基上進行連續培養，以達到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止 褐化。培養20天后，將需要生根的三葉青植株轉移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培養基上進行生根培養。20天可生根。將已生根植 株的培養瓶取出，于自然環境下放置7天后打開瓶蓋，在培養基表面澆少量水，洗凈培養基，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 2) 混合基質上。保持環境相對濕度在80%左右。最初兩周避免直射光照射， 一個月
后移栽到大田中，可達到85%的存活率。 實施例3
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后， 置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1XHgCl2 (內加2滴吐溫T-20)滅菌處理8 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養基上，培養 室的溫度為25。C，光照強度為36(111101.111-2.^，培養20天，可見每個外植體上有 4 7個新芽出現，將長有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養基的培養容器中培養，20天后，各培養容器內的芽 可再生出數個新芽。再將每個芽分開，轉接于MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l上培養基 上進行連續培養，以達到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐 化。培養20天后，將需要生根的三葉青植株轉移至l/2MS+BA0.05mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養基上進行生根培養。25天可生根。將已 生根植株的培養瓶取出，于自然環境下放置5天后打開瓶蓋，在培養基表面澆少 量水，再放置2天，然后將苗取出，洗凈培養基，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質上。保持環境相對濕度在80%。 一個月后移栽到大田中，可達到85% 的存活率。 實施例4
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后，
置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1。/。HgCl2 (內加2滴吐溫T-20)滅菌處理8 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養基上，培養 室的溫度為26。C，光照強度為38拜01.1^2.8-1，培養20天，可見每個外植體上有 4 7個新芽出現，將長有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養基的培養容器中培養，20天后，各培養容器內的芽 可再生出數個新芽。再將每個芽分開，轉接于MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培養基上進行連續培養，以達到快速增殖的目 的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐化。培養20天后，植株生長健壯，高度 達到3 4公分，部分植株的基部出現根。將需要生根的三葉青植株轉移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養基上進行生根培 養。25天可生根。將已生根植株的培養瓶取出，于自然環境下放置7后打開瓶蓋， 在培養基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂洗凈，
將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質上。保持環境相對濕度在80%左右。 一個月后移栽到大田中，可達到85%的存活率。
實施例5
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進行表面滅菌處理流水沖洗40分鐘后，
置于75%酒精中處理20秒，然后用0.1XHgCl2 (內加2滴吐溫T20)滅菌處理9 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養基上，培養 室的溫度為26t:，光照強度為36^mol.m—2.^,培養20天，可見每個外植體上有 4 7個新芽出現，將長有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養基的培養容器中培養，20天后，各培養容器內的芽 可再生出數個新芽。再將每個芽分開，轉接于MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上培養基 上進行連續培養，以達到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐 化。培養20天后，植株高度達到4 5公分。將需要生根的三葉青植株轉移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養基上進行生根培 養。25天即可生根。將已生根植株的培養瓶取出，于自然環境下放置7天后打開 瓶蓋，在培養基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂 洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質上。保持環境相對濕度在 80%左右。 一個月后移栽到大田中，可達到85%的存活率。 實施例6
煉苗與移栽將實施例5得到的三葉青試管苗，在自然光照下煉苗7天后打
開瓶蓋，在培養基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊 脂洗凈，將苗移栽到以珍珠巖泥炭土 (1: 1)為基質的12公分塑料盆，每盆l
株，每15盆為一個單位。置于溫室大棚中，保持最高晝溫〈32°C，最低夜溫〉 18°C，保持環境相對濕度在70 80%，遮光70%。移栽后用塑料膜覆蓋，每天對 葉面噴1次水，IO天后除去覆蓋的塑料薄膜，20天澆一次1/4MS營養液。l個月后， 幼苗成活率達到90%以上，可以移栽到大田。
權利要求
1.一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于方法的步驟如下1)優選完整的腋芽為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗30～40分鐘后，置于75％酒精中處理20～30秒，然后在經0.1％的升汞Hgcl2消毒6～10分鐘后用無菌水沖洗，將腋芽接種于誘導培養基中，誘導培養為MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l；2)將生長于誘導培養基上外植體轉接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l上的培養基上進行增殖培養；3)將進行增殖培養的高度為3～4公分壯苗轉入生根培養基中，生根培養基為1/2MS+NAA0.3mg/l或1/2MS+BA 0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l；4)將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖∶泥炭土為1∶1～2的混合基質上。
2. 根據權利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述的將腋芽接種于誘導培養基中將所選取的腋芽接種于誘導培養基中，培養 2 3周，看到有許多綠色的芽點和小的不定芽出現，誘導培養基的pH值5.8 6.0，培養溫度25 27 °C，每天光照時間為16小時，光照強度為35 40 |imol.m-2.s-1。
3. 根據權利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述的將生長于誘導培養基上芽轉接于增殖培養基上進行增殖培養培養20 25 天，可見小芽可長成3 4公分的無根苗，每個芽的周圍有2 6個新芽出現， 將叢生芽在無菌條件下取出，用解剖刀分開，置于上述增殖培養基中培養，在 20 25天內，各芽再生出一至數個新芽。
4. 根據權利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述將高度為3 4公分的壯苗轉入生根培養基中首先在黑暗條件下培養2 3 天，隨后轉到光下培養7 10天可誘導形成根，再培養20 25天形成發達的根 系。
5. 根據權利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所述的將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為1: 1 2的混合基質上 將裝有生根幼苗的培養容器置于自然溫度、光照的環境下鍛煉5 7天，然后打 開瓶蓋，放置1 2天后，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土為l: 1的混合基質培養20 35天，開始的10 14天溫度為23 25 °C,相對 濕度為70 80%。
全文摘要
本發明公開一種三葉青的組培快速繁殖方法。包括外植體的選取與處理，誘導培養，增殖培養，生根培養，移栽等步驟。本發明以MS培養基為基礎，加入了輔助劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-芐基腺嘌呤、激動素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三葉青叢生芽誘導、壯苗及生根三個關鍵階段的組織培養。本發明的優點(1)三葉青的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵染和農藥殘留的影響，嚴格控制三葉青藥材的質量。(2)增殖速度快，生產周期短，設備簡單，占地面積少，能節省人力、物力等，便于工廠化生產。(3)可以保存三葉青的種質資源，同時有利于保護野生資源，減少對自然資源的破壞。
文檔編號C12N5/04GK101103700SQ20071007070
公開日2008年1月16日 申請日期2007年8月6日 優先權日2007年8月6日
發明者傅承新, 姜維梅, 趙云鵬 申請人:浙江大學