專利名稱：具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及其應用。
背景技術：
在油田三次采油中，水溶性聚合物(HPAM)已廣泛應用于油田工業的各 個方面，大慶油田現在廣泛使用是"三元復合驅"采油技術，"三元"主要包 括超高分子量聚丙烯酰胺(HPAM)、堿和表面活性劑。超高分子量聚丙烯酰 胺(HPAM)水溶液被用來作為驅油劑注入油層，使具有較大黏度的原油(成 分主要為飽和烴、芳烴、膠質及瀝青質)與水之間流度比下降，減弱水的粘性 指進，從而提高原油采收率。聚合物驅油的采出液中，不僅含有原油，而且還 含有聚丙烯酰胺。造成含聚丙烯酰胺污水大量增加，污水中聚丙烯酰胺含量也 大量增加。油田中含聚丙烯酰胺的污水是一類比較復雜、特殊的污水，存在含 油多、黏度大等的特點，如何對難以降解的聚丙烯酰胺進行有效分解，減少環 境污染帶來的壓力，是油田在聚丙烯酰胺驅油中非常關注的問題。尋找能產生 還原性物質的微生物，促進聚丙烯酰胺的連鎖氧化降解反應，從而完成聚丙烯 酰胺的降解，是解決含聚污水外排一條重要的途徑，目前有關聚丙烯酰胺降解 的微生物報道很少。
發明內容
本發明首次提出一種具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌，命名為 大慶沙門氏菌MF即6Wmo"e〃" Z)"^"g MF，所屬分類學屬為沙門氏菌屬 &/mo"e//a，所屬分類學種為大慶沙門氏菌D"^"g，分類命名為大慶沙門氏菌
D"w>2g,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏， 保藏號為CGMCCNo.1910，保藏日期為2007年1月10日。
菌種來源所述的新的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌
D^/"g MF，生活在中國大慶油田采油五廠聚合物注入站熟化罐中 的聚合物水溶液里。
Z)叫/"g MF的形態及生長特性5Wwo"e//a Z)a^'"g MF為革蘭 氏陰性短桿菌，有莢膜，專性厭氧生長，細菌長短多變，在寬0.35pm 0.7pmx
長0.7pm 1.6iim的范圍之間，菌體無鞭毛；在固體培養基上生長時，為黑色 圓形菌落，表面光滑，邊緣不整齊。
&/mo"e〃aZ)a^"gMF的生理生化特征利用硫酸鹽、亞硫酸鹽和還原性 硫化物起電子受體作用，并還原成H2S，兼性厭氧；能在碳源為乳酸鈉、甲酸 鈉、蘋果酸、葡萄糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨的培養基中生長，菌株能以聚 丙烯酰胺為唯一碳源；可以以硫酸氨、尿素為氮源；液體培養基液相末端產物 為乙醇、乙酸、丙酸和丁酸。
&/mo"e//"Da^"gMF的菌種分類鑒定用試劑盒(寶生物公司)提取菌 株DNA，采用通用引物進行PCR擴增，16S rDNA序列的引物 Eubac27F :5 ，陽AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ，
1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3， ； 16S 23S rDNA間隔區的引物Ph 5，-GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA-3' ， P2 :
5'-CCTCTGACTGCCAGGGCATCC-3，；引物由大連寶生物有限公司合成。PCR 反應在PTC-200上進行擴增，50PL的反應體系內含模板40ng， TagDNA 聚合酶(大連寶生物)終濃度為0.3U， dNTP為0.3mmo1 L"，引物各0.1 U mol'L";擴增程序為94。C預熱5min， 94。C變性30s， 58。C復性45s， 72°C 延伸90s，循環30次，最后72'C延伸10min。擴增產物于質量濃度為1.0%的 瓊脂糖溶液中電泳檢測。用膠回收試劑盒(寶泰克)切膠回收，后與 pGEM-T(Promega)載體連接，轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞(天為時代)； LB固體培養基中加入氨芐青霉素Amp(5ixg/MF)和X-gal(5-溴-4-氯-3-口引哚-(3-D 半乳糖苷)，藍白斑篩選轉化子，提取質粒(華舜)，用載體引物T7和SP6檢 測，測序由上海生物工程有限公司完成。
^/附o"e〃aDa^"gMF的16SrNA特性用細菌的16SrNA可以精確的判 定細菌的屬和種。將Da^'wg MF的16S rNA的PCR產物的序列與 基因庫NCBI中16S rNA對比，發現與沙門氏菌屬的鼠傷寒沙門氏菌種 (&/wo"e〃a^/^mw〃'Mm)同源性為96%，與鼠傷寒沙門氏菌種是同屬不同的 兩個種，&/附0恥//"1)"^^]^是屬于沙門氏菌屬，為新的細菌菌種(Da^'"g 種)。
本發明中的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌，在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo.1910，保藏日
期為2007年1月10日。
圖1是5^/mo"e〃"D"^"gMF的菌落形態圖。 圖2是原子力顯微鏡觀察下的菌體形態圖。
圖3是MF菌株在600mg/L的HPAM上時的生長曲線和聚合物濃度變化 曲線，其中顏色深的線為聚合物濃度變化曲線，顏色淺的線為生長曲線。 圖4是菌株作用于聚丙烯酰胺降解前后的聚合物紅外光譜圖。 圖5是MF菌株的系統發育樹圖譜。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細 菌，命名為大慶沙門氏菌MF即5^附0^^/^^^]^^，所屬分類學屬為沙門 氏菌屬&/mo"e/to，所屬分類學種為大慶沙門氏菌Z)"^"g，分類命名為大慶沙 門氏菌6^附^^//"/)"^"&在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏號為CGMCCNo.1910，保藏日期為2007年1月10日。
具體實施方式
二本實施方式中5"a/mowe//aDa《&gMF菌種的分離通過以 下方法實現取聚合物注入站的熟化罐中的聚合物水溶液5 10mL，放入充 滿純度為99.99%的氮氣的含有厭氧無菌水的厭氧瓶中，加入3 5顆玻璃珠， 在搖床上振蕩1.5h，將聚合物溶液中菌膠團打碎，用厭氧的無菌水進行倍比稀 釋，將細菌濃度稀釋到106，再接種于固體培養基中，然后"滾管"培養7 10d;挑取1 3環單菌落轉接入液體體培養基中，然后進行3 6次的分離純 化，用電鏡確認并分離純菌株，將純菌株進行擴大培養后配置成菌液，其中細 菌濃度配置為106;配置不同濃度的含有聚合物的培養基并向其中加入相同量 的菌液，進行連續培養，不同時間測定聚合物的降解速率，反復多次篩選高效 的降解菌株，將高效的降解菌株分別接入到以聚丙烯酰胺為唯一碳源、以硫酸 銨、尿素為氮源的液體培養基中培養，對液體培養基的液相末端產物進行生理 生化鑒定(《伯杰細菌鑒定手冊》第八版)，液相末端產物為乙醇、乙酸、丙酸 和丁酸的培養基中的菌株為fe/mw^/aZ^^'MglVIF菌。
本實施方式中的液體和固體培養基是通過以下方法制備的將0.5g的 HPAM、 0.5g的K2HP04、 LOg的NH4CI、 2g的Na2S04、 O.lg的CaCI2'2H20、 2.0g的MgS(V7H2Q、 l.Og的酵母膏、質量濃度為60%的乳酸鈉溶液6mL和
蒸餾水1000 mL充分混合，然后加入質量濃度為0.2%的刃天青溶液1 2g， 將混合液煮沸后，加入L-半光鹽酸鹽0.5g，通入純度為99.99%的氮氣驅氧 30min，當培養基由紅色變成淡黃色，表明培養基為厭氧狀態，可以進行培養 基的分裝，將培養基分成相同重量的兩份，然后在12rC滅菌20min，向一份 培養基中加入質量濃度為3%的FeS(V(NH4)2S04溶液10 12g,得到具體實施 方式一中的液體體培養基；向另一份培養基中加入質量濃度為1.2%的瓊脂糖 10 12g，得到具體實施方式
一中的固體培養基；本實施方式中的培養基為選 擇性培養基。
具體實施方式
三本實施方式中5^/wo"e/^Da^"gMF菌種的鑒定通過以 下方法實現1、本發明中的5Ia/mo"e//fl￡>aw>7gMF細菌為革蘭氏陰性短桿菌， &/附0^/^/)"^>^^^的菌落形態如圖l所示，在固體培養基上生長時，為黑 色圓形菌落，表面光滑，邊緣不整齊；2、圖2是用原子力顯微鏡觀察的 D叫/wg MF的菌體形態圖，菌落有莢膜，細菌長短多變，在寬 0.35jxm 0.7^imx長0.7pm 1.6jxm的范圍之間，菌體無鞭毛；3、 &/mo"e〃"
MF的菌種分類鑒定用試劑盒(寶生物公司生產)提取菌株DNA， 采用通用引物進行PCR擴增，16S rDNA序列的引物 Eubac27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG畫3， ，
1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ， ； 16S 23S rDNA間隔區的引物Pl: 5'-GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA-3， ， P2 :
5，-CCTCTGACTGCCAGGGCATCC-3，；引物由大連寶生物有限公司合成，PCR 反應在PTC-200上進行擴增，50 " L的反應體系內含模板40ng左右，TagDNA 聚合酶(大連寶生物公司生產)終濃度為0.3U， dNTP為0.3mmo1 L/1，引 物各0.1"mo卜L";擴增程序為94。C預熱5min， 94。C變性30s， 58。C復性 45s， 72。C延伸90s，循環30次，最后72。C延伸10min;擴增產物于1.0%的瓊 脂糖電泳檢測；用膠回收試劑盒(寶泰克)切膠回收，后與pGEM-T(Promega) 載體連接，轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞(天為時代)；LB固體培養基 中加入氨芐青霉素Amp(5嗎/MF)和X-gal (5-溴-4-氯-3-卩引哚-(3-D半乳糖苷)， 藍白斑篩選轉化子；提取質粒(華舜)，用載體引物T7和SP6檢測，測序由 上海生物工程有限公司完成；將Sa/附o"e/fe D叫/"g MF的16S rNA的PCR產 物的序列與基因庫NCBI中16SrNA對比，發現與沙門氏菌屬的鼠傷寒沙門氏
菌種(&/mo"e〃a/>^/H'/m^MW)有96%的同源性，但不完全相同，&/mo"e〃a Z^W'"gMF是屬于沙門氏菌屬而與鼠傷寒沙門氏菌種不同的一種短桿菌，本發 明中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌的16S rNA序列的核苷酸有 1259個，16S 23S rDNA間隔區的核苷酸有818個。
具體實施方式
四本實施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細 菌為革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，專性厭氧生長，細菌長短多變，在寬
0.35^im 0.7jxmx長0.7pm 1.6pm的范圍之間，菌體無鞭毛；在固體培養基上 生長時，為黑色圓形菌落，表面光滑，邊緣不整齊。
具體實施方式
五本實施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細 菌應用于聚丙烯酰胺的降解。
&/mo"e//flDaw>7gMF菌種對聚丙烯酰胺黏度的改變和降解率的大小通過 以下方法測定選用水溶性聚丙烯酰(HPAM)，代替乳酸鈉作為碳源，用蒸 餾水配置成濃度為600mg/L聚丙烯酰胺厭氧培養基，接種量為10%;選擇生 長曲線上代表性的4個點測定了聚丙烯酰胺溶液黏度，如圖3所示由于微生 物的降解作用，黏度由接種時停滯期的19.0mPa-s，到第2天進入對數生長期 的8.2mPa's，至第7天穩定期3.0mPa's，第20天衰亡期的UmPa's，該菌對 于降低黏度效果顯著，第20天聚合物降解率為40 70%。&/woMe//a Da^唯MF 菌種對聚丙烯酰胺分子結構的改變如圖4所述水作用后的吸收峰與干粉樣品 相比有1571.0345的羰基峰出現，3433.0721峰值代表N-C鍵斷裂；菌株作用 后，相對與干粉樣品和水溶液，增加1462.8813可能是羧基的吸收峰，在 618.5579到1298.3612峰值為各種不同的苯環結構，多為菌株代謝產物。每逢 MF菌株以聚丙烯酰胺為碳源和氮源，降解側鏈，部分官能團發生改變，導致 聚丙烯酰胺斷鏈。聚丙烯酰胺結構的改變表現在降解產物中，產物萃取相的氣 相色譜圖，經質譜計算機系統檢索，并與純化合物譜圖核對，確定保留時間為 9.368min的是底物正十六酰胺(C,6H33N)，可能是聚合物的微生物作用下的C-C 斷鏈后的產物；此外還有3-甲基-4-康醇(C8H80)保留時間為1.505min; 2-甲基 丁二酸異丁酯((:13112404)保留時間為2.418min，此外還有15種微生物利用聚 合物的降解和代謝產物；大部分降解產物中，低分子量化合物除含雙鍵、環氧 和羰基的聚丙烯酰胺碎片外，大多屬于一般丙烯酰胺低聚體的衍生物。
MF菌株的系統發育樹如圖5所示。
序列表
<110>哈爾濱工業大學
<120>具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌及其應用
<160>2
<210> 1 <211> 1259 <212> DNA
<213>沙門氏菌屬(SsZwtwe^/a) <220>
<223>沙門氏菌屬大慶沙門氏菌MF 16S rNA基因序列。
<400> 1
tgcctaac3catgcaagtcg33CggtagC3C3g3g3gCttgctctcgggtgacgagtggc60
ggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactgg3咖ggt120
agctaataccgcataacgtcgcaagaccaaag卿gggaccttcgggcctcttgccatca180
gatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggt獄ggctcacctaggcgacgatccc240
tagctggtctg卿ggatgetCC3gCC3CELCtgg咖tgagacacggtccELgactcctacg300
gg3ggC3gC￡Lgtgggga由ttgcacaatgggcgc犯gcctgatgcagccatgccgcgtg360
tatg鄉gaggccttcgggttgtaagtactttcagcggggaggaaggtgttgtggttaat420
aaccgcagcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccg■
cggtaatacgg鄉gtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcg540
gtctgtc朋gtcggatgtg3aatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggc600
aggct卿gtcttgtagaggtccaggtgtagcggtga犯tgcgtag卿t660
ctggagg犯taccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgc卿720
agcgtggggagcaaacaggattagat3ccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgact780
tggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagttaacgcgttaagtcgaccgcctggg840
gagtecggccgcaaggttaaaattgacgggggCCCgCSLCSl3gcggtggag■
catgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaact960
gctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtca1020
gctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatxctttgttg1080
CC3gCggtt3ggccggg雄tcaaaggagsctgccagtgata已已ctggagga鄉tgggg1140
atg3cgtc犯gtC￡LtC￡ltggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcat1200
gcgacctcgcg卿gc犯gcggacctcata鄉tgcgtcgtsgtccgga1259
<210>2 <211>818 <212> DNA <213>沙門氏菌屬( <220>
<223>沙門氏菌屬大慶沙門氏菌MF16S 23S rDNA間隔區部分基因序列。
<400> 2
ttggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagt犯tcgtsgatcagaatgc60
tacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgg120
aggtagcttaaxxttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactg180
gggtg已agtcgta3C33ggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctccttacctt24。
^aga^cctgcctttgtagtgctcacacagattgtctgattagcaggcgt300
cttgcgattgagacttcagtgtccccttcgtctagaggcccsggacaccgctctttcacg360
gcggt,aggggttCg33tcccctaggggacgccacttgctggttcgtgagtgaaagtc420
acctgccgtcactgacttgcgagtcatgtttgagatatttgctctttaaa■
satctggatxaagctgaaaattgaaacgactgtgtgttcgagtctctcaa540
attttxgcaaaxxgatgstga3catcttcgggttgtg郷ttaagcgact600
aagcgtacacggtggatgccctggcagtcagaggcgatgaaggacgtgct660
aagcgccggcgaggtgatatga^cctttgacccggcgatttccgaatggggaaacccaat720
cactagtgcggccgcctgcaggtcgaccatatggg卿gctcccaacgcgttggatgcat780
agcttgagtattctatagtgtc3cctanatagcttggc818
權利要求
1、具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌，其特征在于具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌命名為大慶沙門氏菌MF即Salmonella DaqingMF，所屬分類學屬為沙門氏菌屬Salmonella，所屬分類學種為大慶沙門氏菌Daqing，分類命名為大慶沙門氏菌Salmonella Daqing，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.1910，保藏日期為2007年1月10日。
2、 根據權利要求1所述的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌， 其特征在于16S rNA核苷酸序列為GCAAGCGGACCTC ATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGA-3'。
3、根據權利要求1所述的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌， 其特征在于16S 23S rDNA間隔區核苷酸序列為GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGC-3'。
4、根據權利要求1所述的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌， 其特征在于所述的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌為革蘭氏陰性 短桿菌，有莢膜，專性厭氧生長，細菌長短多變，在寬0.35^im 0.7)imx長0.7, 1.6pm的范圍之間，菌體無鞭毛；在固體培養基上生長時，為黑色圓形菌落，表面光滑，邊緣不整齊。
5、具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌的應用，其特征在于具有 聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌應用于聚丙烯酰胺的降解。
全文摘要
具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌及其應用，本發明涉及一種微生物及其應用。本發明首次提出一種具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌，本發明中的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸鹽還原細菌，命名為大慶沙門氏菌MF即Salmonella Daqing MF，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，所屬分類學屬為沙門氏菌屬Salmonella，所屬分類學種為大慶沙門氏菌，保藏號為CGMCC No.1910。細菌為革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，專性厭氧生長，細菌長短多變，在寬0.35μm～0.7μm×長0.7μm～1.6μm的范圍之間，菌體無鞭毛；在固體培養基上生長時，為黑色圓形菌落，表面光滑，邊緣不整齊。
文檔編號C12N15/31GK101104844SQ200710072029
公開日2008年1月16日 申請日期2007年4月13日 優先權日2007年4月13日
發明者李維國, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱工業大學