專利名稱：以菌絲球作為載體的微生物固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物固定化方法。
背景技術(shù)：
微生物固定化技術(shù)是指將微生物通過一定的技術(shù)手段(如利用載體材料、包埋物質(zhì)或合理控制水力條件等)使微生物保持在反應(yīng)器內(nèi)。菌絲球是由霉菌的自絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生具有一定機(jī)械強(qiáng)度和大小的球體，它除了自身具有一定的吸附和降解效能以外，近來也逐漸被用來作為一種新型生物質(zhì)載體，固定其他功能微生物應(yīng)用于污水生物處理中。但是，目前人們采用吸附法向菌絲球上固定化微生物，這種方法操作步驟繁瑣、耗時(shí)、固定微生物量有限、形成的混合菌絲球內(nèi)部微生物分布不均勻這樣就勢必影響固定化微生物的活性和整個(gè)球體的傳質(zhì)效果。而且采用吸附法需要先培養(yǎng)單純霉菌菌絲球成需要大小以后，再將其取出，以無菌水反復(fù)沖洗待用，然后再富集培養(yǎng)待固定細(xì)菌，等其進(jìn)入對數(shù)生長期以后，經(jīng)過離心收集細(xì)菌，然后細(xì)菌在無菌水中洗2-3次，然后再以無菌水配成細(xì)菌懸液，再將洗好的單純霉菌菌絲球放入制備好的細(xì)菌懸液中震蕩吸附10h達(dá)飽和，整個(gè)過程最短也需要耗時(shí)60h。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法操作步驟復(fù)雜及耗時(shí)時(shí)間長的問題，而提出一種以菌絲球作為載體的微生物固定化方法。以菌絲球作為載體的微生物固定化方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、富集培養(yǎng)取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有80～110mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)24～30小時(shí)后備用；二、制備孢子懸液用無菌的生理鹽水沖洗長有曲霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面并用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來，在生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面的同時(shí)用試管接住沖洗過程中流下來的含有曲霉菌孢子的生理鹽水，然后輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài)；三、同時(shí)接種取出步驟二中的孢子懸液2～5ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液20～50ml，然后將2～5ml的孢子懸液和20～50ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有200～350ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)48～54小時(shí)，即達(dá)到細(xì)菌固定在曲霉菌菌絲球上的目的。本發(fā)明對曲霉菌菌體孢子和細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，節(jié)省了沖洗、制備細(xì)菌懸液和震蕩吸附的過程，固定化時(shí)間僅在48h左右，不但縮短了時(shí)間而且減少了步驟，還大大提高了效率。


圖1是吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖，其中圖1中的上部分是吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的700倍掃描電鏡圖，下半部分是吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3500倍掃描電鏡圖；圖2是沒有進(jìn)行固定化的單純霉菌菌絲球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3000倍掃描電鏡圖；圖3是采用本發(fā)明的方法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3000倍掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中以菌絲球作為載體的微生物固定化方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、富集培養(yǎng)取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有80～110mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)24～30小時(shí)后備用；二、制備孢子懸液用無菌的生理鹽水沖洗長有曲霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面并用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來，在生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面的同時(shí)用試管接住沖洗過程中流下來的含有曲霉菌孢子的生理鹽水，然后輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài)；三、同時(shí)接種取出步驟二中的孢子懸液2～5ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液20～50ml，然后將2～5ml的孢子懸液和20～50ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有200～350ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)48～54小時(shí)，即達(dá)到細(xì)菌固定在曲霉菌孢子體內(nèi)的目的。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中富集培養(yǎng)基是由5g NaCl、3g牛肉膏、10g蛋白胨和1000mL蒸餾水混合而成。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有90～100mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中于30℃、125～130轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)26～28小時(shí)后備用。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中的成球培養(yǎng)基是由30g蔗糖、0.5g NH4Cl、0.1g K2HPO3·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g FeSO4·7H2O和1000mL蒸餾水混合而成。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中取出步驟二中的孢子懸液3～4ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液30～40ml，然后將3～4ml的孢子懸液和30～40ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有240～300ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中于30℃、125～130轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)50～52小時(shí)。其它步驟與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式中以菌絲球作為載體的微生物固定化方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、富集培養(yǎng)取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有100mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)24小時(shí)后備用；二、制備孢子懸液用無菌的生理鹽水沖洗長有曲霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面并用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來，在生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面的同時(shí)用試管接住沖洗過程中流下來的含有曲霉菌孢子的生理鹽水，然后輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài)；三、同時(shí)接種取出步驟二中的孢子懸液2ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液20ml，然后將2ml的孢子懸液和20ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有200ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)48小時(shí)，即達(dá)到細(xì)菌固定在曲霉菌菌絲球上的目的。
本實(shí)施方式中的富集培養(yǎng)基是由5g NaCl、3g牛肉膏、10g蛋白胨和1000mL蒸餾水混合而成；成球培養(yǎng)基是由30g蔗糖、0.5g NH4Cl、0.1gK2HPO3·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g FeSO4·7H2O和1000mL蒸餾水混合而成。
采用吸附法和本發(fā)明中的方法同時(shí)進(jìn)行以曲霉菌菌絲球作為載體的細(xì)菌固定化培養(yǎng)，待兩種方法均固定完成后，隨機(jī)取兩種固定化方法形成的混合菌絲球各一個(gè)，切開后在電子顯微鏡下觀察各自的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同時(shí)以沒有進(jìn)行固定化的單純霉菌菌絲球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，由圖可知圖1中的上部分是吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的700倍掃描電鏡圖，下半部分是吸附法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3500倍掃描電鏡圖，圖1中采用吸附固定化方法形成的混合菌絲球內(nèi)部的細(xì)菌只固著在菌絲交叉形成平臺的地方，而在沒有交叉的菌絲上就沒有細(xì)菌存在；圖3是采用本發(fā)明中的方法形成的混合菌絲球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3000倍掃描電鏡圖，無論菌絲交聯(lián)與否，細(xì)菌都非常均勻的排列生長在每一根菌絲上，而且單位面積上固定化生長的細(xì)菌數(shù)量也明顯多于圖1的混合菌絲球，圖3中細(xì)菌均勻排列，很少出現(xiàn)堆積和分層的現(xiàn)象，這樣就不影響菌絲球內(nèi)部的能量和氧氣的供給，不會影響菌絲球?qū)?nèi)部細(xì)菌的傳質(zhì)，這樣被固定的細(xì)菌就能夠保持較高的活性。圖2是沒有進(jìn)行固定化的單純霉菌菌絲球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的3000倍掃描電鏡圖。
權(quán)利要求
1.以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于以菌絲球作為載體的微生物固定化方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、富集培養(yǎng)取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有80～110mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)24～30小時(shí)后備用；二、制備孢子懸液用無菌的生理鹽水沖洗長有曲霉菌孢子的斜面固體培養(yǎng)基的表面并用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體被完全沖洗下來，在生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面的同時(shí)用試管接住沖洗過程中流下來的含有曲霉菌孢子的生理鹽水，然后輕輕震蕩試管，使懸液中的孢子呈均勻分散狀態(tài)；三、同時(shí)接種取出步驟二中的孢子懸液2～5ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液20～50ml，然后將2～5ml的孢子懸液和20～50ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有200～350ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中，然后于30℃、120～140轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)48～54小時(shí)，即達(dá)到細(xì)菌固定在曲霉菌菌絲球上的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟一中富集培養(yǎng)基是由5g NaCl、3g牛肉膏、10g蛋白胨和1000mL蒸餾水混合而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟一中取一環(huán)待固定化的好氧細(xì)菌接種到盛有90～100mL液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟一中于30℃、125～130轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中富集培養(yǎng)26～28小時(shí)后備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟三中的成球培養(yǎng)基是由30g蔗糖、0.5g NH4Cl、0.1g K2HPO3·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、0.1g FeSO4·7H2O和1000mL蒸餾水混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟三中取出步驟二中的孢子懸液3～4ml備用，再取出步驟一中已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液30～40ml，然后將3～4ml的孢子懸液和30～40ml的已經(jīng)富集好的細(xì)菌培養(yǎng)液同時(shí)接種到盛有240～300ml成球培養(yǎng)基的三角瓶中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，其特征在于步驟三中于30℃、125～130轉(zhuǎn)/分鐘的條件下將三角瓶置于搖床中培養(yǎng)50～52小時(shí)。
全文摘要
以菌絲球作為載體的微生物固定化方法，本發(fā)明涉及一種以菌絲球作為載體的微生物固定化方法。它是為了解決現(xiàn)有的以菌絲球作為載體的微生物固定化方法操作步驟復(fù)雜及耗時(shí)時(shí)間長的問題。以菌絲球作為載體的微生物固定化方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、富集培養(yǎng)；二、制備孢子懸液；三、同時(shí)接種，即達(dá)到好氧細(xì)菌與曲霉菌孢子體同時(shí)培養(yǎng)的目的。本發(fā)明節(jié)省了沖洗、制備細(xì)菌懸液和震蕩吸附的過程，固定化時(shí)間僅在48h左右，不但縮短了時(shí)間而且減少了步驟，大大提高了效率。采用本發(fā)明的方法形成的混合菌絲球內(nèi)部無論菌絲交聯(lián)與否，細(xì)菌都非常均勻的排列生長在每一根菌絲上，而且單位面積上固定化生長的細(xì)菌數(shù)量也明顯多于吸附法形成的混合菌絲球。
文檔編號C12N11/00GK101063121SQ200710072148
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者馬放, 山丹, 王晨, 張斯 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)