專利名稱：：四種產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生產(chǎn)技術的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及四種產(chǎn)膽鹽水解酶(BileSaltHydrolase,BSH)和胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的乳酸菌及其功能性酸奶生產(chǎn)技術，適用于發(fā)酵乳制品中降膽固醇的功能性酸奶和微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。技術背景益生菌(Probiotics)是指一類通過腸道定殖作用改善宿主特定部位微生態(tài)平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它們通過改善腸道微生物生態(tài)平衡，控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥人對乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免疫反應，具有免疫增強的作用。益生菌制品的活菌應該代謝穩(wěn)定，活性較強，通過消化道后大量存活，進入腸道后發(fā)揮益生菌作用。目前用于生產(chǎn)益生菌劑的優(yōu)良菌種有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬中的乳酸乳球菌乳酸亞種等。早在1963年人們就證實攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇的含量。20世紀70年代，科學家先后通過對大量飲用酸乳等發(fā)酵乳制品的非洲Massai人血清膽固醇的研究，對新生兒的研究，對常飲酸乳的美國人的調(diào)查，以及直接對酸乳的研究等，均發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用。迄今，國內(nèi)外研究者對于乳酸菌降低膽固醇的作用機理尚存在不同觀點，主要集中于以下三點(l)乳酸菌菌體細胞直接吸收同化膽固醇；(2)乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；(3)其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。膽鹽水解酶(BSH)是乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。該酶能在人體肝腸循環(huán)中將結合態(tài)膽鹽降解產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離態(tài)膽鹽。后者能與膽固醇結合形成沉淀復合物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。有文獻報道乳酸菌在亞優(yōu)化生長條件下，出于對自身的保護作用，可分泌胞外多糖(EPS)。Whitfield等研究表明胞外多糖的形成有利于微生物抵抗不良環(huán)境因素，如干燥、滲透壓條件、抗生素或毒物作用、巨噬細胞或噬菌體的侵襲等。自1982年日本學者Shiomi等人報道乳酸菌EPS具有抗腫瘤作用以來，引起了許多學者的注意。從報道的研究結果看，乳酸菌EPS主要有以下幾個方面的功能改善發(fā)酵乳制品組織狀態(tài)，控制酸奶的脫水收縮，防止乳清析出；改善菌株對腸道黏膜的非特異性粘附，增強菌株對腸道的定殖作用；抗腫瘤作用；調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用；對細胞體具有保護作用；抑制腸道腐敗菌的繁殖，防治結腸癌的作用。目前認為乳酸菌EPS抗腫瘤作用的機理有以下幾個方而(l)影響血液供應，鑒于細菌素能引起腫瘤細胞組織缺血性壞死，曾經(jīng)設想多糖的抗腫瘤作用可能影響腫瘤的血液供應；(2)刺激某種器官或組織，分泌一種物質攻擊腫瘤細胞；(3)細胞膜接觸抑制作用。腫瘤細胞表面具有很強的負電荷，而有些多糖可以結合這些電荷，使細胞表面被"中和"從而有利于細胞接受信號終止分裂。國內(nèi)關于干酪乳桿菌的研究主要是其降血脂、抗高血壓、治療過敏性疾病等保健功效上，如上海光明乳業(yè)股份有限公司申請的"干酪乳桿菌Bd—II菌株及其在降低血脂方面的應用"，專利申請?zhí)枮镃N03128995.9;干酪乳桿菌LC2W菌株及其在抗高血壓方面的應用專利申請?zhí)枮镃N03129450.2兩項專利；景岳生物科技股份有限公司申請的新的微生物株類干酪乳桿菌GM-080及其治療過敏相關疾病的用途，專利申請?zhí)枮镃N200410038566,X。雖然國外關于干酪乳桿菌降低血清膽固醇功效的研究也有一項專利報道丄acto6a"7/uscose/M-//stainandusedtoreducebloodcholesterol(20060127380)，但是，目前國外幾乎無關于乳酸乳球菌乳酸亞種、嗜熱鏈球菌等菌株產(chǎn)膽鹽水解酶的專利報道。雖然國內(nèi)有一項"含羅伊氏乳桿菌的功能性酸奶及其制作方法(200310112715.S)"的專利報道，但是國內(nèi)無利用降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌應用于功能性酸奶生產(chǎn)的相關文章報道和專利報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是提供四種具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌。本發(fā)明所提供的乳酸菌是干酪乳桿菌(丄""0^"7/^^^/)虹1菌株，干酪乳桿菌(丄acto6ac/〃Mcose/)Jl菌株，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcw/actosubsp./acto)KS4，嗜熱鏈球菌(5^卬tococc^Aermop/n7w"Tx，已于2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。保藏號分別為:CGMCCW1809(菌株KL1)，CGMCCMM808(菌株Jl)，CGMCCW2l807(菌株KS4)，CGMCCW1810(菌株Tx)。干酪乳桿菌(丄a"oZa"7/z^cosef)KL1，干酪乳桿菌(丄acto6fl"7/wscase/)Jl，乳酸乳球菌乳酸亞種(Zactococc^/actosubsp./acfe)KS4，嗜熱鏈球菌OS^;tococcwW/^mopMw)Tx，分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)。在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上，干酪乳桿菌aacto&cz7/wcwd)KL1和Jl菌株的菌落大小23mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解CaC03的透明圈，菌落有較高黏性；個體形態(tài)呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時菌體呈球形，G+無芽孢桿菌；乳酸乳球菌乳酸亞種(丄""ococcws/ac^ssubsp./acfe)KS4和嗜熱鏈球菌(&re;tococc^Aawop/n7z^)Tx菌株的菌落大小為12mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解CaC03的透明圈，菌落有較高黏性。個體形態(tài)呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，G+兼性厭氧菌。上述方法得到具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸乳球菌乳酸亞種KS4，嗜熱鏈球菌Tx，干酪乳桿菌KL1和Jl屬于本發(fā)明保護范圍。本發(fā)明的第二個目的是提供四種乳酸菌制備功能性酸奶生產(chǎn)技術。本發(fā)明所提供制備功能性酸奶的方法是由具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的干酪乳桿菌(丄""0^"7/1"')虹1和Jl，乳酸乳球菌乳酸亞禾中(丄actococcws/actosubsp./acto)KS4，嗜熱鏈球菌(^S^7tococa^/2ermo/7Mws)Tx四種乳酸菌制得。所述方法中，用于制備功能性酸奶的發(fā)酵工藝條件是發(fā)酵溫度為3743。C，接種量為2%6%，Tx/KS4/KLl(或Jl)接種比例為1:1:2、2:1:1、2:1:3,發(fā)酵時間為3.55.5h，蔗糖添加量為4%8%(w/v)。所述方法中制備功能性酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵劑接種量為4%，Tx/KS4/KLl(或Jl)接種比例為2:1:3，發(fā)酵時間為4.0h，蔗糖添加量45%(w/v)。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，成品酸奶凝乳時間短，乳凝固結實，無乳清析出，口感黏稠細膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風味。利用產(chǎn)胞外多糖的益生菌替代酸奶穩(wěn)定劑或增稠劑，即可明顯改善酸奶穩(wěn)定性和流變特性，又可利用產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的益生菌株大規(guī)模生產(chǎn)功能性酸奶。上述方法得到功能性酸奶最佳發(fā)酵工藝條件及其產(chǎn)品與專用生產(chǎn)菌株也屬于本發(fā)明保護范圍。應用干酪乳桿菌KL1和Jl、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4與嗜熱鏈球菌Tx生產(chǎn)功能性酸奶工藝流程圖說明如下(l)原料乳制作酸奶的原料乳要求菌數(shù)一般低于1(^個/mL，不含抗生素和消毒藥，不宜選用患乳房炎乳。(2)凈化以離心機除去牛乳中的白細胞和其他肉眼可見的雜質。(3)標準化原料乳的主要成分指標應符合食品衛(wèi)生國家標準GB5408-85。其總干物質應不低于11.5%,脂肪含量根據(jù)產(chǎn)品不同大體調(diào)整為4種3.2%、2.5%、1.0%和<0.1%，可通過脫除奶油或添加1%3°/。的脫脂奶粉或稀奶油以調(diào)整總干物質或脂肪含量。(4)預熱、配料和過濾將原料乳加熱至6(TC左右，加入4。/。5M(w/v)的蔗糖，溶解后過濾除雜。(5)均質在均質機中于810MPa壓力下對預熱的原料乳進行均質處理。目的是使乳凝固均勻，質地更加細膩、平滑，亦可使脂肪球變小而防止脂肪上浮。(6)殺菌將原料乳加熱至90。C,保溫510min。(7)冷卻經(jīng)殺菌后的原料乳迅速冷卻至40'C，待接種。(8)接種加入單一工作發(fā)酵劑的總接種量為4%,菌種Tx、KS4與KL1(或J1)的單一發(fā)酵劑的接種比例為2:1:3。(9)分裝為避免雜菌侵入，分裝于塑料小容器的操作應在無菌室中快速進行。(10)保溫發(fā)酵將塑料小容器置于發(fā)酵室中保持發(fā)酵溫度4(TC。當發(fā)酵乳酸度達到65。T，乳凝固性狀良好時，即發(fā)酵成熟。發(fā)酵時間一般為4h。(11)冷卻將盛酸奶的容器從發(fā)酵室取出，用冷風迅速冷卻至1(TC以下。(12)冷藏與后熟經(jīng)冷卻處理的酸奶，貯藏于05'C冷藏室中保存，直至飲用。目的是防止酸奶繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸造成pH過低而影響口感，并防止雜菌污染繁殖。冷藏條件下的后熟有利于酸奶風味物質的形成，最終獲得風味柔和、濃郁的功能性成品酸奶。干酪乳桿菌(丄actoZ^"7/wcase/)KL1和Jl，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcws/ac他subsp./acfe)KS4，嗜熱鏈球菌(5^/tococcwsf/zermopMiw)Tx分離篩選于東北普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)，具有可靠的安全性，用此四種乳酸菌株生產(chǎn)的功能性酸奶凝乳結實，無乳清析出，口感黏稠、細膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風味。本發(fā)明制作功能性酸奶的原料來源方便，發(fā)酵工藝簡單，發(fā)酵周期短，操作簡單，對設備要求低，成本較低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積百分含量。實施例1、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的干酪乳桿菌(丄acfo6"c/〃wscose/)KLl禾QJl,乳酸乳球菌乳酸亞禾中(丄actococcwsubsp./acfe)KS4，嗜熱鏈球菌CS^ep/ococcwAermop/7z7us)Tx的篩選與鑒定1、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的篩選取藏靈菇濾液5mL注入帶玻璃珠的45mL無菌生理鹽水中，充分振蕩30min，制成菌懸液，而后IO倍梯度稀釋成10-410-6的稀釋菌液。以稀釋傾注法接種平板，倒入含碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)24h，挑取有溶解圈的單菌落劃線接種于MRS斜面培養(yǎng)基中，于37t培養(yǎng)24h。革蘭氏染色，視其個體形態(tài)和純度。轉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37"C增菌培養(yǎng)23代，再以1%2%接種量轉接入含膽固醇的1號培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)20h后，以鄰苯二甲醛比色法測定1號培養(yǎng)基中發(fā)酵前后膽固醇的含量，并計算膽固醇降低率(％)。根據(jù)膽固醇降低率確定高效降膽固醇的菌株。具體測定方法取0.4mL培養(yǎng)前后的發(fā)酵液于比色管中，加入0.2mL鄰苯二甲醛(lmg/mL)和4mL混合酸(冰醋酸、濃硫酸等量混合)，充分混合后室溫靜置10min，以不含膽固醇的I號培養(yǎng)基為空白調(diào)0，于550nm測定吸光值(A)，在膽固醇-吸光值標準曲線上查得發(fā)酵前后膽固醇的含量(結果見表1)。表l不同乳酸菌株降低膽固醇的初篩試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>研究表明，采用高通量篩選技術和鄰苯二甲醛法獲得高效降低膽固醇的乳酸菌是KS4、Jl、KL1和Tx菌株。其中，KS4菌株降低膽固醇能力最強，其次是J1、KL1和Tx菌株。它們在有關文獻報道中屬于降低膽固醇能力較強菌株。將初篩后獲得的具有高效降膽固醇的菌株，在含0.1%膽固醇和0.3%牛黃膽酸鈉的MRS培養(yǎng)基平板上(分別以含0.1%膽固醇的MRS培養(yǎng)基、0.3%牛黃膽酸鈉的MRS培養(yǎng)基作為對照)，對稱放置牛津杯，加入O.lmLMRS培養(yǎng)菌液，于37t:厭氧培養(yǎng)34d后，觀察牛津杯周圍是否有銀色沉淀現(xiàn)象，其結果見表2。陽性者以茚三酮法檢測銀色沉淀物中是否有膽鹽的水解產(chǎn)物——氨基酸存在，根據(jù)藍紫色反應初步確定菌株是否產(chǎn)生膽鹽水解酶。將茚三酮反應陽性菌株劃線接種于MRS斜面試管，培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩１?產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌株復篩試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"+"表示牛津杯周圍有不同程度的銀色沉淀現(xiàn)象；"-"表示無沉淀現(xiàn)象。由表1和表2結果顯示，沉淀圈的大小與膽鹽水解酶的活力和降低膽固醇的百分率成正比。復篩試驗總體比較，菌株KS4、Jl、KL1和Tx能夠高產(chǎn)膽鹽水解酶，其中菌株KS4產(chǎn)酶能力最強，其次是J1、KL1和Tx菌株。高效降低膽固醇的乳酸菌株源于其產(chǎn)生多量或高活力的膽鹽水解酶。可利用這些高產(chǎn)膽鹽水解酶的乳酸菌株進一步開發(fā)研制高效降膽固醇的功能性酸奶。2、高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選取藏靈菇濾液5mL注入帶玻璃珠的45mL無菌生理鹽水中，充分振蕩30min，制成菌懸液，而后IO倍梯度稀釋成10'410—6。以稀釋傾注法接種平板，倒入含碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)24h，挑取有溶解圈、黏性較高的單菌落劃線接種于MRS斜面培養(yǎng)基中，于37'C培養(yǎng)24h。革蘭氏染色，視其個體形態(tài)和純度。轉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37'C增菌培養(yǎng)23代，再以P/。2Q/。接種量轉接入MRS液體培養(yǎng)基中，37"C培養(yǎng)12h后，以苯酚-硫酸比色法測定培養(yǎng)液中EPS的含量。將測得樣品吸光度y值代入標準曲線公式y(tǒng)-0.8649x(R2-0.9991)即得到EPS濃度x值(100mg/L)，其結果見表3。根據(jù)MRS培養(yǎng)基中的EPS含量，確定產(chǎn)胞外多糖的菌株。將產(chǎn)胞外多糖的菌株劃線含膽固醇和牛黃膽酸鈉的MRS培養(yǎng)基沉淀現(xiàn)象含膽固醇的MRS培養(yǎng)基沉淀現(xiàn)象含牛黃膽酸鈉MRS培養(yǎng)基沉淀現(xiàn)象茚三酮反應檢測膽鹽的水解產(chǎn)物接種于MRS斜面試管，培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩１?分離菌株產(chǎn)胞外多壽害測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>研究表明，采用高通量篩選技術和苯酚-硫酸法獲得較高合成EPS的乳酸菌是KS4、KL1、Jl和Tx菌株。其中KS4菌株EPS的產(chǎn)量最高，其次為KL1、Jl和Tx菌株。它們在有關文獻報道中均屬于產(chǎn)EPS能力較強的菌株。3、篩選菌株發(fā)酵性能鑒定將篩選的KS4、KL1、Jl和Tx菌株培養(yǎng)物轉接入滅菌脫脂乳中連續(xù)傳代活化23代，37。C培養(yǎng)過夜至牛乳凝固。再以1%接種量轉接入盛脫脂乳的三角瓶中，于37'C培養(yǎng)過夜至牛乳凝固后，再冷藏后熟過夜，測定發(fā)酵劑的活力(包括凝乳時間、酸度、黏度、還原韌天青時間，乳酸菌活菌數(shù)量)。分別于37i:、4(TC、43i:培養(yǎng)過夜至牛乳凝固后，進行感官綜合評定，其結果見表4。根據(jù)發(fā)酵劑的活力和感官綜合評定分數(shù)高低，確定發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。將篩選產(chǎn)膽鹽水解酶、胞外多糖和發(fā)酵性能優(yōu)良的MRS斜面菌株，接種于各種理化鑒定培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)進行鑒定。表4篩選乳酸菌株的發(fā)酵性能測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中數(shù)據(jù)為n=3測定之平均值。研究表明，菌株KS4、KL1、Jl和Tx均具有良好的發(fā)酵性能。其中由Tx菌株制備發(fā)酵劑的黏度最高，凝乳時間最短，感官綜合評分最高，其次是J1、KL1和KS4菌株。可利用這些產(chǎn)EPS的乳酸菌株進一步開發(fā)研制具有良好穩(wěn)定性的功能性酸奶。4、高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖菌株的鑒定注"+"95%以上的菌株為陽性；"-"95%以上的菌株為陰性。實施例2、利用高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖菌株生產(chǎn)功能性酸奶本發(fā)明所用的酸奶生產(chǎn)專用菌種是干酪乳桿菌a^to^cz7/wM"/)KL1和Jl，乳酸乳球菌乳酸亞種CLactococcw/ac^subsp./acfe)KS4，嗜熱鏈球菌(&^ptococcw^2wmop/2z7w)Tx。它們均為高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的功能性菌種。其中干酪乳桿菌KL1和Jl菌株耐胃酸、耐膽汁鹽能力較強，具有抗消化道逆環(huán)境特性，可順利到達小腸分泌膽鹽水解酶，將結合態(tài)膽鹽降解產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離態(tài)膽鹽。后者能與膽固醇結合形成沉淀復合物而排出常規(guī)生理生化試驗鑒定糖醇類發(fā)酵試驗，耐鹽試驗(7.5。/。NaCl)，不同溫度試驗(10。C、40°C)。Biok)g全自動微生物鑒定儀鑒定挑取MRS平板上的目的單菌落劃線接種于BUA+B平板上(含5%無菌脫纖維綿羊血)，37。C培養(yǎng)得到單菌落后，以Biolog的專用接種液調(diào)整菌懸液的濁度至65士2y。T，接種于AN微量鑒定板中，3537。C厭氧培養(yǎng)2448h后，于鑒定儀上讀取鑒定結果。鑒定結果如表5所示。鑒定菌株KL1和Jl為干酪乳桿菌(丄"ctoZ^d//^c"化/)，菌株KS4為乳酸乳球菌乳酸亞種(Z^c/oco"wsubsp./ac^y)，菌株Tx為嗜熱鏈球菌CS/r^^ococci^//zermop/w'/ws)。表5菌株KL1、Jl、KS4、Tx的鑒定項目與結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>I繊辦罾Jw繊蹄1罾1、.卩棉海山蔗松七葡水松果蜜乳體外，從而降低血清總膽固醇的含量。利用小白鼠做功能性酸奶經(jīng)口灌胃試驗，1個月后的結果表明，模型試驗組小鼠血清的低密度脂蛋白濃度較模型空白組明顯降低，并從小鼠糞便中分離篩選出菌株KL1的大量活菌，說明干酪乳桿菌0^"o^c///^co^/)KL1能順利通過消化道逆環(huán)境而到達小腸發(fā)揮高效降低血清膽固醇的功效。故可利用這些菌株生產(chǎn)降血清膽固醇的功能性酸奶。1、單一發(fā)酵劑的制備將10mL脫脂乳裝入試管，經(jīng)0.07Mpa滅菌20min，冷卻至37。C，分別接種產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的干酪乳桿菌KL1或Jl，乳酸乳球菌乳酸亞種KS4，嗜熱鏈球菌Tx優(yōu)良菌株，37'C培養(yǎng)至乳凝固，再以2%接種量制作發(fā)酵劑，37°C下培養(yǎng)至乳凝固，即為單一菌種發(fā)酵劑。2、功能性酸奶生產(chǎn)發(fā)酵條件的優(yōu)化根據(jù)影響功能性酸奶品質較大的發(fā)酵溫度、接種比例和接種量進行三因素三水平[L"3"]正交試驗(見表6)，并對成品酸奶的乳凝固時間、黏度、感官綜合評分(總分80分，其中色澤5分、滋味和氣體30分、組織狀態(tài)15分、乳酸菌活菌數(shù)10分、黏稠度20分)，通過對試驗結果的極差分析和方差分析確定其最佳發(fā)酵工藝條件。表6功能性酸奶優(yōu)化發(fā)酵條件正交試驗設計因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表7發(fā)酵條件優(yōu)化結果與初始發(fā)酵條件結果對照發(fā)酵溫度接種量菌種比例。C%Tx/KS4/KLl(Jl)對照組^^IT^優(yōu)化組40_f___為了獲得更大活力和優(yōu)良品質的功能性酸奶，針對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。通過正交試驗，以凝乳時間、黏度和感官綜合評分為評價指標，確定功能性酸奶最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵劑接種量為4%，Tx/KS4/KLl(Jl)的接種比例為2:1:3，發(fā)酵時間為4.0h，蔗糖添加量為4%5%(w/v)。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下(見表7)，成品酸奶黏度較高，凝乳時間較短，凝乳結實，無乳清析出，口感黏稠、細膩和幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風味。冷藏1周后其活菌數(shù)較高為9.6xl06dWmL,黏度仍較高，說明乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖對乳酸菌活性有一定保護作用，提高了生產(chǎn)菌種的抗逆性。冷藏兩周后其乳清析出量保持較低水平，比普通酸奶乳清析出量減少約50%，解決了酸奶乳清析出的問題。故利用產(chǎn)胞外多糖的益生菌替代酸奶穩(wěn)定劑或增稠劑，即可明顯改善酸奶穩(wěn)定性和流變特性，又可利用產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的益生菌株大規(guī)模生產(chǎn)功能性酸奶。本專利所屬項目北京市教委農(nóng)業(yè)應用新技術北京市重點實驗室開放課題"開菲爾粒的菌種篩選及其在功能性發(fā)酵牛乳中的應用研究"項目編號KF2003-06項目起止時間2004.01-2006.12項目負責人劉慧權利要求1、四種產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生產(chǎn)技術，其技術特征在于從藏靈菇中篩選獲得四種高產(chǎn)膽鹽水解酶(BSH)和胞外多糖(EPS)的乳酸菌，且它們均具有高效降低膽固醇和優(yōu)良的發(fā)酵性能。利用具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的四種乳酸菌制得品質優(yōu)良的酸奶，既具有降低血清膽固醇的功能，又可利用菌體產(chǎn)生的胞外多糖替代穩(wěn)定劑，能明顯改善和提高功能性酸奶的穩(wěn)定性。2、根據(jù)權利要求l所述的用于生產(chǎn)功能性酸奶的四種具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌屬于本發(fā)明保護的范圍。這四種乳酸菌的分類命名是菌株KLl為干酪乳桿菌afl"oZ)fl"7/^case/)(CGMCCJV2l809)，菌株Jl為干酪乳桿菌(Z^cto6ac/〃wscase/)(CGMCCW2I8O8)，菌株KS4為乳酸乳球菌乳酸亞種(Z"ctococc^/acfesubsp./flc船)(CGMCCJMM807)，菌株Tx為嗜熱鏈球菌(浙取ococ譜to7no盧/iw)(CGMCCJVf21810)。3、根據(jù)權利要求1所述的利用四種具有高效降低膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌制備品質優(yōu)良的功能性酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件及其產(chǎn)品與專用生產(chǎn)菌株也屬于本發(fā)明保護的范圍。即利用干酪乳桿菌(丄acto^"7/Mcase/)KLl和Jl，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcw/ac他subsp./acto)KS4，嗜熱鏈球菌(5^tococa^/M^M泌)Tx四種乳酸菌制備功能性酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵劑接種量為4%，Tx/KS4/KLl(Jl)的接種比例為2:1:3,發(fā)酵時間為4.0h，蔗糖添加量為4%5%(w/v)。全文摘要本發(fā)明名稱為四種產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生產(chǎn)技術，適用于發(fā)酵乳制品中降膽固醇的功能性酸奶和微生態(tài)制劑生產(chǎn)。本發(fā)明采用高通量篩選技術和鄰苯二甲醛法獲得高效降低膽固醇的菌株，牛津杯法復篩得到高產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株，苯酚-硫酸法獲得高產(chǎn)胞外多糖的菌株。篩選的四種乳酸菌均具有優(yōu)良的發(fā)酵性能。利用具有高效降膽固醇及高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的干酪乳桿菌KL1(CGMCC№1809)和J1(CGMCC№1808)，乳酸乳球菌乳酸亞種KS4(CGMCC№1807)，嗜熱鏈球菌Tx(CGMCC№1810)制得品質優(yōu)良的酸奶，既具有降低血清膽固醇功能，又可利用菌體產(chǎn)生的胞外多糖替代穩(wěn)定劑，解決了酸奶乳清析出問題。本發(fā)明制作功能性酸奶的發(fā)酵工藝簡單，發(fā)酵周期短，成本較低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號A23C9/123GK101331900SQ20071012310公開日2008年12月31日申請日期2007年6月28日優(yōu)先權日2007年6月28日發(fā)明者慧劉,張紅星,艾啟俊,鐘德壽申請人:北京農(nóng)學院