專利名稱：：利用產膽鹽水解酶的乳酸菌、酵母菌制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法
技術領域：
：本發明涉及三株產膽鹽水解酶(BileSaltHydrolase,BSH)的乳酸菌及兩株產膽鹽水解酶的酵母菌及其功能性飲料生產技術，適用于發酵蛋乳制品中降膽固醇的蛋乳發酵飲料的生產。
背景技術：
：益生菌(Probiotics)是指一類通過腸道定殖作用改善宿主特定部位微生態平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它們通過改善腸道微生物生態平衡,控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥人對乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免疫反應，具有免疫增強的作用。益生菌制品的活菌應該代謝穩定，活性較強，通過消化道后大量存活，進入腸道后發揮益生菌作用。目前用于生產益生菌劑的優良菌種有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、酵母屬、克魯維酵母屬等。早在1963年人們就證實攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發酵的酸奶具有降低血清膽固醇的含量。迄今，國內外研究者對于乳酸菌降低膽固醇的作用機理尚存在不同觀點，主要集中于以下三點(l)乳酸菌菌體細胞直接吸收同化膽固醇；(2)乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結合態膽鹽降解為游離態膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發生共同沉淀作用；(3)其他理論，如吸收同化與共沉淀聯合作用。膽鹽水解酶(BSH)是乳酸菌產生的代謝產物。Klaver等利用多株乳桿菌和雙歧桿菌進行的降膽固醇研究證實乳酸菌產生的膽鹽水解酶能在人體肝腸循環中將結合態膽鹽降解產生氨基酸與溶解度較低的游離態膽鹽。后者能與膽固醇結合形成沉淀復合物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。酵母菌包括乳糖發酵性和乳糖非發酵性二類。乳糖發酵性酵母有克魯維酵母屬(如馬克斯克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、保加利亞克魯維酵母)、假絲酵母屬(如乳酒假絲酵母)和酒香酵母屬等，它們能產生P-半乳糖苷酶，在牛乳中生長能發酵乳糖產生乙醇和C02,是制作乳酒的良好菌種。有關酵母菌的益生性也有文獻報道。酵母菌作為益生菌的應用起源于飼料，如Sacc/wramj/cM6o"/"/y板被用于不同類型痢疾的治療。Psomas等(2003年)研究了^cc/zaram;;c^^w/a"板具有降低膽固醇的功能。也有啤酒酵母拮抗大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等腸道病原菌生長的報道。啤酒酵母能夠通過腸道存活，進一步說明了它被作為益生菌的可能性。Submmanian等(1983年)研究了應用嗜酸乳桿菌和乳糖發酵性酵母——馬克斯克魯維酵母和C"w&Wa戸ei^^o/^"/^共生發酵生產嗜酸酵母乳產品，發現嗜酸乳桿菌的生長受酵母菌存在的刺激。利用酵母菌在生長過程中的呼吸作用，以生物法耗氧，創造一個適合于嗜酸乳桿菌生長繁殖、產酸代謝的厭氧環境。目前，國內有關發酵型蛋奶飲料研究較多，而降膽固醇的發酵蛋乳飲料工藝研究剛剛起步。包惠燕等(2003年)研究了乳酸菌發酵對蛋奶膽固醇的影響，結果顯示嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌單獨與混合發酵均可使蛋奶中膽固醇量下降10%左右；尹忠平等(2007年)以鮮雞蛋為主要原料，利用乳酸菌(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌復合菌種)發酵作用加工凝固型降膽固醇發酵全蛋飲料。其膽固醇降低率可達36.03%。而本發明專利是以牛奶與雞蛋為主要原料，利用從藏靈菇中篩選的高產膽鹽水解酶的乳酸菌(嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種)和馬克斯克魯維酵母菌采用二步發酵法制備降膽固醇蛋乳發酵飲料，其膽固醇降低率可高達89.3%。迄今，國內外尚無關于馬克斯克魯維酵母菌具有高效降低膽固醇及高產膽鹽水解酶的相關文章報道和專利報道。而關于利用產膽鹽水解酶的乳酸菌、酵母菌應用于降膽固醇蛋乳發酵飲料的生產亦未見國內外文獻報道和專利報道。
發明內容本發明的第一個目的是提供三株具有高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的乳酸菌。本發明所提供的乳酸菌是干酪乳桿菌(/^"0^"7/1^0^^)虹1菌株，乳酸乳球菌享L酸亞禾中(丄actococc船/ac似subsp./acfe)KS4，嗜熱鏈球菌(S/re/tococcwsAwmo/7/H7M)Tx菌株，已于2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。保藏號分別為:CGMCCW1809(菌株KL1)，CGMCCW2l807(菌株KS4)，CGMCCW2l8lO(菌株Tx)。干酪乳桿菌(Z^cfo6acz7/wsca"/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亞種(Z^c,ococcwj/ac船subsp./ac泡)KS4，嗜熱鏈球菌(S/re/tococcws^ermo;/H7ws)Tx，分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)。在含有碳酸藥和納他霉素的MRS選擇性培養基上，干酪乳桿菌a^toZ^"7/"jcose/)KL1菌株的菌落大小23mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規則，無光澤，扁平，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解CaC03的透明圈，菌落有較高點性；個體形態呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時菌體呈球形，G+無芽孢桿菌；乳酸乳球菌乳酸亞種(丄a"ococctw/ac他subsp./acfe)KS4禾tl嗜熱鏈球菌(5^eptococcws^2emzo//H7MS)Tx菌株的菌落大小為12mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解CaC03的透明圈，菌落有較高黏性。個體形態呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，G+兼性厭氧菌。上述方法得到具有高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的乳酸乳球菌乳酸亞種KS4，嗜熱鏈球菌Tx，干酪乳桿菌KL1屬于本發明保護范圍。本發明的第二個目的是提供兩株具有高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的酵母菌。本發明所提供的酵母菌是馬克斯克魯維酵母(i^;^ram;;c"maWaw一Kl和M3菌株。已于2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。保藏號分別為CGMCCW2l812(菌株Kl)，CGMCCJ^1811(菌株M3)。馬克斯克魯維酵母(ii:/w"eram;;c"mflm'aww》Kl和M3分離篩選自吉林省白城市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)。在含有抗生素的馬鈴薯乳糖(PDA)選擇性培養基上馬克斯克魯維酵母(ii:/^yveraw;;c"wwx/""w力Kl和M3菌落大小為34mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，有光澤，微隆起，乳白色，不透明；個體形態呈卵圓形或短橢圓形(K1菌株)、長橢圓形或圓柱形(M3菌株)，不形成假菌絲；無性繁殖為多邊芽殖，在馬鈴薯乳糖培養基中生長出芽高，有性繁殖形成子囊孢子；有很強的發酵能力，能產生P-半乳糖苷酶，在牛奶中發酵乳糖產乙醇含量可達3.0^(m/m)以上，在蛋乳發酵飲料中乙醇含量可達0.7%l,0%(m/m)。上述方法得到具有高效降低膽固醇及高產膽鹽水解酶的馬克斯克魯維酵母Kl和M3菌株屬于本發明保護范圍。本發明的第三個目的是提供利用三株乳酸菌及一株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法。本發明所提供制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法是由具有高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的干酪乳桿菌(Z^"o^d//^cwe/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄a"ococcus/a池subsp./a"&)KS4，嗜熱鏈球菌()S^ptococa^/em2qp^Ms)Tx三株乳酸菌及馬克斯克魯維酵母(X/w"eram""man:/amw)Kl或M3酵母菌制得。所述方法中，原輔料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%,料水比1:1(附F),蔗糖添加量7。/。(附F)，CMC-Na用量0.3%，卡拉膠用量0.2%。全蛋液最佳殺菌條件為67。C，20min。原料經殺菌、冷卻后利用三株乳酸菌與一株酵母菌進行二步發酵。所述方法中，利用三株乳酸菌與一株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇蛋乳飲料最佳發酵工藝條件是前期乳酸菌發酵(一次發酵)條件發酵溫度為43'C，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例l:l:l，接種量3%;后期酵母菌發酵(二次發酵)條件發酵溫度32"C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，發酵時間26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)，接種量1。/。(K1或M3菌株)。在此優化發酵條件下制作的產品經4"C低溫后熟ld后，原料中膽固醇降低率為59.6。/o(Kl菌株)75.0。/。(M3菌株)，產品乙醇含量為0.7。/o(M3菌株)1.0。/o(Kl菌株)(m/m)，酸度60。T(M3菌株)62。T(K1菌株)。成品蛋乳飲料呈乳黃色，口感細膩、滑幼，爽口，風味獨特，有濃郁的酯香風味伴著清淡的醇香，酸甜度適中；質地不分層也不絮凝，呈均勻一致的起泡性乳濁液，是一種營養豐富，對人體健康有益的功能性飲品。上述方法得到降膽固醇蛋乳發酵飲料配方、最佳發酵工藝條件及其產品與專用生產菌株也屬于本發明保護范圍本發明的第四個目的是提供利用三株乳酸菌及兩株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法。本發明所提供制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法是由具有高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的干酪乳桿菌(丄flctoZ)aci//^caw')KLl,嗜熱鏈球菌OS^tococcus//^ww^i/泌)Tx，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄flctococc附/flc泡subsp./ac故)KS4三株乳酸菌及馬克斯克魯維酵母(X/M"eraw;;caswam'a"t^)Kl與M3兩株酵母菌制得。所述方法中，原輔料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%，料水比1:1(『/F)，蔗糖添加量7%(『/F)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉膠用量0.2%。全蛋液最佳殺菌條件為67'C，20min。原料經殺菌、冷卻后利用三株乳酸菌與兩株酵母菌進行二步發酵。所述方法中，利用三株乳酸菌與兩株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇蛋乳飲料最佳發酵工藝條件是前期乳酸菌發酵(一次發酵)條件發酵溫度43'C，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例1:1:1，接種量3%;后期酵母菌發酵(二次發酵)條件發酵溫度30'C，發酵時間24h，Kl/M3菌種比例l:l，接種量1%。在此優化發酵條件下制作的產品經4'C低溫后熟ld后，原料中的膽固醇降低率為89.3%，產品乙醇含量為0.75。/。(m/m)，酸度為60°T。成品蛋乳飲料色澤呈乳黃色，口感細膩、幼滑、爽口，酸甜度適中；風味獨特，有濃郁的酯香風味伴著清淡的醇香，蛋腥味不明顯；質地不分層亦無絮凝沉淀，組織狀態呈均勻一致的起泡性乳濁液。在63'Cx30min熱處理條件下進行巴氏殺菌，蛋乳飲料未出現乳清分離和沉淀現象。其風味和感官狀態未發生變化。利用三株高產膽鹽水解酶的乳酸菌與兩株酵母菌通過在優化條件下進行二步發酵，以及全蛋液在適宜條件下巴氏殺菌(67-C，20min)，既掩蓋解決了全蛋液濃厚的蛋腥味問題，又可高效降低原料中的膽固醇含量，是一種集營養與保健為一體的功能性飲品。故可利用高產膽鹽水解酶的益生乳酸菌與酵母菌株大規模生產降膽固醇的蛋乳發酵飲料。上述方法得到降膽固醇蛋乳發酵飲料配方、最佳發酵工藝條件及其產品與專用生產菌株也屬于本發明保護范圍。應用干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4、嗜熱鏈球菌Tx、馬克斯克魯維酵母Kl和M3菌株生產降膽固醇蛋奶發酵飲料工藝流程圖說明如下1、原料乳的處理(l)原料乳制作蛋奶發酵飲料的原料乳要求菌數一般低于1(^個/mL，不含抗生素和消毒藥，不宜選用患乳房炎乳。(2)凈化以離心機除去牛乳中的白細胞和其他肉眼可見的雜質。(3)標準化原料乳的主要成分指標應符合食品衛生國家標準GB5408-85。其總干物質應不低于11.5%，脂肪含量根據產品不同大體調整為4種3.2%、2.5%、1.0%和<0.1%,可通過脫除奶油或添加1%3%的脫脂奶粉或稀奶油以調整總干物質或脂肪含量。(4)預熱、均質將原料乳加熱至6070'C，均質機中于1315MPa壓力下對預熱原料乳均質處理。目的是使牛乳質地更加細膩、平滑，亦可使脂肪球變小而防止脂肪上浮。(5)殺菌、冷卻將原料乳加熱至9095。C，保溫510min，迅速冷卻至43。C。2、全蛋液的處理(l)全蛋液將經過洗蛋機清洗(用含有清洗劑的流動清水)、消毒(用消毒劑)燈檢后的合格雞蛋自動接收逐個用打蛋機打破，蛋殼掰開，蛋液經管道流入容器。(2)勻質用勻質機乳化1030min。利用勻質機的剪切力和蛋黃含有的卵磷脂(乳化劑)，可使脂肪膽固醇乳化成極小顆粒。(3)加糖水、穩定劑配料將原料用水加熱至6(TC，加入7%(『/^)的蔗糖，0.3%CMC-Na，0.2%卡拉膠，攪拌溶解后，與勻質后的全蛋液混合。(4)殺菌、冷卻將全液蛋加熱至67'C，保溫20min，迅速冷卻至43""C。3、混合將原料乳處理液與全蛋處理液混合后[原料奶與全蛋液各占總量的35%和15%，料水比為l:l(,AO]，待接種。4、接種乳酸菌發酵劑、一次發酵(前期發酵)將干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4、嗜熱鏈球菌Tx菌株的單一發酵劑按1:1:1比例混合，加入復合發酵劑的總接種量為3%,于發酵罐中保溫43'C靜置發酵8h后，進行酵母菌的二次發酵。5、接種酵母菌發酵劑、二次發酵(后期發酵)二次發酵工藝l:加入馬克斯克魯維酵母M3或K1菌株單一發酵劑，總接種量1%,于發酵罐中保溫32°C(K1菌株)及34°C(M3菌株)靜置發酵26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)后，進行低溫后熟。二次發酵工藝2:將馬克斯克魯維酵母M3和Kl菌株的單一發酵劑按1:1比例混合，加入復合發酵劑的總接種量1%，于發酵罐中保溫3(TC靜置發酵24h后，進行低溫后熟。6、低溫后熟發酵罐通入-4'CNaCl鹽水，使發酵蛋乳溫度降至04"C后熟ld。目的是利用生產菌種分泌的膽鹽水解酶在低溫下繼續作用于原料膽固醇而提高降低率，并防止雜菌污染繁殖。低溫條件下的后熟有利于蛋乳發酵飲料風味物質的形成，最終獲得風味柔和、清涼爽口、濃郁的成品蛋乳發酵飲料。7、罐裝與巴氏殺菌將發酵蛋乳罐裝于瓶中，壓蓋后，于63。C保溫殺菌30min(為保持蛋乳發酵飲料的生物活性可省去加熱殺菌工序)，冷卻后即為成品。干酪乳桿菌(丄acto6ac///^cme/)KLl乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcMS/acfesubsp./ac泡)KS4，嗜熱鏈球菌(5Vre;tococcw;yAwwop/K7ws)Tx、馬克斯克魯維酵母(7a"_yveram，ycasmara^m^)Kl和M3菌株，分離篩選于東北普通家庭的藏靈燕(又稱開菲爾粒)，具有可靠的安全性，利用高產膽鹽水解酶的三株乳酸菌株和兩株酵母菌株制備的功能性蛋乳發酵飲料，可使原料中的膽固醇降低率為59.6%75.0%(酵母菌單一發酵劑)，最高可達89.3%(酵母菌復合發酵劑)，產品乙醇含量為0.7。/。1.0。/。(m/m)，酸度為6062°T。成品色澤呈乳黃色，口感細膩、幼滑、爽口，酸甜度適中；風味獨特，有濃郁酯香風味伴隨清淡醇香，蛋腥味不明顯；質地不分層亦無絮凝沉淀，組織狀態呈均勻一致的起泡性乳濁液。本發明制作降膽固醇蛋乳發酵飲料的原料來源方便，發酵工藝簡單，發酵周期短，操作簡單，對原料膽固醇的降低率高，對設備要求低，成本較低，適于工業化生產。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積百分含量。實施例i、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的干酪乳桿菌0:"ctoto"7/^owe/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亞種(丄"ctococcw/flcfosubsp./ac他)KS4,嗜熱鏈球菌CS^取ococcwsAermopMws)Tx菌株的篩選與鑒定1、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶乳酸菌株的篩選取藏靈菇濾液5mL注入帶玻璃珠的45mL無菌生理鹽水中，充分振蕩30min，制成菌懸液，而后10倍梯度稀釋成10—410—6的稀釋菌液。以稀釋傾注法接種平板，倒入含碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養基，37"C培養24h，挑取有溶解圈的單菌落劃線接種于MRS斜面培養基中，于37。C培養24h。革蘭氏染色，視其個體形態和純度。轉接種于MRS液體培養基中，37"C增菌培養23代，再以1%2%接種量轉接入含膽固醇的1號培養基，37'C培養20h后，以鄰苯二甲醛比色法測定I號培養基中發酵前后膽固醇的含量，并計算膽固醇降低率(％)。根據膽固醇降低率確定高效降膽固醇的菌株。具體測定方法取0.4mL培養前后的發酵液于比色管中，加入0.2mL鄰苯二甲醛(lmg/mL，無水乙醇配制)和4mL混合酸(r冰醋酸/F濃硫酸=1:1)，充分混合后室溫靜置10min，以不含膽固醇的I號培養基為空白調O，于550nm測定吸光值(A)，在膽固醇-吸光值標準曲線上查得發酵前后膽固醇的含量(結果見表1)。表l不同乳酸菌株降低膽固醇的初篩試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>研究表明，采用高通量篩選技術和鄰苯二甲醛法獲得高效降低膽固醇的乳酸菌是KS4、KL1和Tx菌株。其中KS4菌株降低膽固醇能力最強，其次是KL1和Tx菌株。它們在有關文獻報道中屬于降低膽固醇能力較強菌株。將初篩后獲得的具有高效降膽固醇的菌株，在含0.1%膽固醇和0.3%牛黃膽酸鈉的MRS培養基平板上(分別以含0.1%膽固醇的MRS培養基、0.3%牛黃膽酸鈉的MRS培養基作為對照)，對稱放置牛津杯，加入O.lmLMRS培養菌液，于37'C厭氧培養34d后，觀察牛津杯周圍是否有銀色沉淀現象，其結果見表2。陽性者以茚三酮法檢測銀色沉淀物中是否有膽鹽的水解產物——氨基酸存在，根據藍紫色反應初步確定菌株是否產生膽鹽水解酶。將茚三酮反應陽性菌株劃線接種于MRS斜面試管，培養后保存備用。表2產膽鹽水解酶乳酸菌株復篩試驗結果、一---一一一一菌株代號試驗項目""""^^—KS4KL1Tx含膽固醇和牛黃膽酸鈉的MRS培養基沉淀現象含膽固醇的MRS培養基沉淀現象含牛黃膽酸鈉MRS培養基沉淀現象茚三酮反應檢測膽鹽的水解產物++++++++++++注"+"表示牛津杯周圍有不同程度的銀色沉淀現象；"_"表示無沉淀現象。由表1和表2結果顯示，沉淀圈的大小與膽鹽水解酶的活力和降低膽固醇的百分率成正比。復篩試驗總體比較，菌株KS4、KL1和Tx能夠高產膽鹽水解酶，其中菌株KS4產酶能力最強，其次是KL1和Tx菌株。高效降低膽固醇的乳酸菌株源于其產生多量或高活力的膽鹽水解酶。可利用這些高產膽鹽水解酶的乳酸菌株進一步開發研制高效降膽固醇的蛋奶發酵飲料。2、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶乳酸菌株的鑒定常規生理生化試驗鑒定糖醇類發酵試驗，耐鹽試驗(7，/。NaCl)，不同溫度試驗(1(TC、40°C)。Biolog全自動微生物鑒定儀鑒定挑取MRS平板上的目的單菌落劃線接種于BUA+B平板上(含5%無菌脫纖維綿羊血)，37t:培養得到注"+"95%以上的菌株為陽性；"-"95%以上的菌株為陰性。實施例2、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶的馬克斯克魯維酵母(《/"pew加F幼附ara:/fl"附)Kl和M3菌株的篩選與鑒定1、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶酵母菌株的篩選取藏靈菇濾液5mL注入帶玻璃珠的45mL無菌生理鹽水中，充分振蕩30min，制成菌懸液，而后10倍梯度稀釋成10'410'6的稀釋菌液。以稀釋傾注法接種平板，倒入含抗生素的馬鈴薯乳糖選擇性培養基，28'C培養23d。根據酵母菌的菌落特征和水浸片鏡檢結果，將上述平皿目的菌落分別劃線接種于相應斜面培養基上，28'C培養23d。轉接種于馬鈴薯乳糖液體培養基中，28'C增菌培養23代，再以1%2%接種量分別轉接入含膽固醇的I號培養基與含膽固醇和2°/。乳糖的1號培養基中，28'C培養20h后，以鄰苯二甲醛比色法測定I號培養基中發酵前后膽固醇的含量，并計算膽固醇降低率(％)。根據膽固醇降低率確定高效降膽固醇的菌株。具體測定方法將培養前后的10mL發酵液以10000r/min離心10min，分別取0.4mL離心上清液于比色管中，加入0.2mL鄰苯二甲醛(lmg/mL)和4mL混合酸(F冰醋酸/F濃硫酸=1:1)，充分混合后室溫靜置10單菌落后，以Biolog的專用接種液調整菌懸液的濁度至65±2%T，接種于AN微量鑒定板中，3537。C厭氧培養2448h后，于鑒定儀上讀取鑒定結果。鑒定結果如表3所示。鑒定菌株KL1為干酪乳桿菌a。cto6acz'"wscasd),菌株KS4為乳酸乳球菌乳酸亞種(丄actococcMs/aWssubsp./acto)，菌株Tx為嗜熱鏈球菌表3菌株KL1、KS4、Tx的鑒定項目與結果鑒定項目菌株代號KS4KL1++++++++i+++++i++i++++i++++i+a糖糖醇糖糖苷糖苷糖糖糖糖wcc、=1籽藻梨三葉萄楊二二,o。o^w棉海山蔗松七葡水松果蜜乳^S§料min，以不含膽固醇的I號培養基為空白調O，于550nm測定吸光值(A),在膽固醇-吸光值標準曲線上查得發酵前后膽固醇的含量(結果見表4)。表4不同酵母菌株降低膽固醇的初篩試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注表中數據為n=3測定之平均值。研究表明，Kl和M3菌株在含有乳糖與不含乳糖的I號培養基中降低膽固醇能力有所不同。Kl菌株在無乳糖的I號培養基比有乳糖的降低膽固醇的百分率相對較高；相反，M3菌株在有乳糖的I號培養基比無乳糖的降低膽固醇的百分率相對較高。初篩試驗總體比較，M3菌株比K1菌株降低膽固醇能力較強。將初篩后獲得的具有降膽固醇的菌株，在含0.1%膽固醇和0.3%牛黃膽酸鈉的馬鈴薯乳糖培養基平板上(分別以含0.1%膽固醇的馬鈴薯乳糖培養基、含0.3%牛黃膽酸鈉的馬鈴薯乳糖培養基作為對照)，對稱放置牛津杯，加入O.lmL馬鈴薯乳糖培養菌液，于28'C厭氧培養3d后，再經4-C冷藏7d，分別測定牛津杯周圍培養基內沉淀圈的大小，其結果見表2。根據沉淀圈的大小初步確定菌株是否產生膽鹽水解酶及其活力和產量的高低。將產膽鹽水解酶的菌株劃線接種于馬鈴薯乳糖斜面試管，培養后保存備用。表5產膽鹽水解酶酵母菌株復篩試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表4和表5結果顯示，沉淀圈的大小與膽鹽水解酶的活力和降低膽固醇的百分率成正比，而且發現冷藏溫度下一周內沉淀圈會繼續擴散，說明冷藏溫度下酵母菌的膽鹽水解酶活性較高于適宜生長溫度條件。復篩試驗總體比較，M3菌株比Kl菌株產生的膽鹽水解酶活力較高。高效降低膽固醇的酵母菌株源于其產生多量或高活力的膽鹽水解酶。可利用這些高產膽鹽水解酶的酵母菌株進一步開發研制高效降膽固醇的蛋奶發酵飲料。2、高效降膽固醇及高產膽鹽水解酶酵母菌株的鑒定常規生理生化試驗鑒定糖類發酵試驗，碳源同化試驗，氮源同化試驗。Biolog全自動微生物鑒定儀鑒定挑取28'C培養2d的馬鈴薯乳糖平板上的目的單菌落，劃線接種于BUY平板上，2628t:培養2d得到單菌落后，用無菌超純水接種液調整菌懸液的濁度至47±2°/。丁，接種于YT微量鑒定板中，2628'C培養24h、48h、72h后，于鑒定儀上讀取鑒定結果。鑒定菌株K1和M3為馬克斯克魯維酵母C^wjveram;^esww;a'am^)。其結果如表6所示。表6菌株K1、M3的鑒定項目與結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注"+"95%以上的菌株為陽性；"-"95%以上的菌株為陰性。實施例3、利用高產膽鹽水解酶的三株乳酸菌及一株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇的蛋乳發酵飲料1、乳酸菌單一發酵劑的制備將lOmL脫脂乳裝入試管，經0.07Mpa滅菌20min，冷卻至37"C,以蝸巻接種環釣取23環分別接種產膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KL1，乳酸乳球菌乳酸亞種KS4，嗜熱鏈球菌Tx脫脂乳保藏菌株，37。C培養至乳凝固，如此活化23代。將上述活化好的菌株分別以1%2%接種量轉接至10ml無菌脫脂乳中，37"C培養過夜至乳凝固，再以2%3%接種量轉接至盛200ml滅菌牛奶三角瓶中，37。C培養至乳凝固，即為單一菌種發酵劑。2、酵母菌單一發酵劑的制備將lOmL改良馬鈴薯乳糖培養基裝入試管，經0.07Mpa滅菌20min，冷卻至28'C，以接種環釣取12環分別接種產膽鹽水解酶的馬克斯克魯維酵母M3和Kl斜面保藏菌株，于28'C培養至培養液混濁，再以1%2°/。轉接10ml改良馬鈴薯乳糖培養基中，28。C培養2021h(有大量氣泡和菌體沉淀產生)，如此活化23代，以血球計數板法測定菌數達5xl(^7xl(^個/ml，冷藏備用。將上述活化菌株分別以1%2%接種量轉接至10ml無菌脫脂乳中，28'C培養20h左右，如此活化23代，再以2。/。接種量轉接至盛200ml滅菌牛奶三角瓶中，28'C培養20h左右，即為單一菌種發酵劑。3、降膽固醇蛋乳飲料生產發酵條件的優化(1)乳酸菌一次發酵(前期發酵)條件的優化原輔料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%，料水比l:l(附fO，蔗糖添加量7%(『/^)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉膠用量0.2%。原料經殺菌、冷卻后進行乳酸菌一次發酵條件的優化。根據初步單因素多水平試驗結果，選取影響降膽固醇蛋乳飲料品質較大的發酵溫度、發酵時間、菌種比例和接種量進行四因素三水平[L9(3"]正交試驗(見表7)，以酸度、感官評價綜合評分(總分50分，其中色澤5分、滋味和氣味30分、組織狀態15分)作為試驗測定指標，通過極差分析和方差分析確定其最佳一次發酵工藝條件。表7乳酸菌一次發酵條件優化正交試驗設計因素水平表因素水平發酵溫度rc)發酵時間(h)菌種比例接種量(％)Tx/KS4/KLl13761:0.5:0.5224081:1:13343102:0.5:0.54表8乳酸菌一次發酵條,化結果與初始發酵條件結果對照指標發酵發酵菌種比例接種量感官評價A550nm膽固醇降低率/%溫度廠c時間/minTx/KS4/KLl/%/分ir鎌后對照組優化組3743881:1:11:1:13346.548.00.2710.2090.2710.18926.134.5通過對酸度、感官評價試驗指標進行極差分析和方差分析，確定發酵時間是影響蛋乳發酵飲料品質的主要因素，發酵溫度次之，接種量相對影響較小，菌種比例影響最小。為了獲得高效降低膽固醇和優良品質的蛋乳發酵飲料，針對乳酸菌一次發酵條件進行了優化。通過正交試驗，以酸度、感官評價為評價指標，確定降膽固醇的蛋乳飲料最佳一次發酵條件為發酵溫度43i:，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例l:l:l，總接種量3%。由表8可見，在此優化發酵條件下，原料中膽固醇降低率為34.5%，而對照組為26.1%。(2)酵母菌二次發酵(后期發酵)條件的優化在乳酸菌最佳一次發酵條件前提下，根據初步單因素多水平試驗結果，選取影響降膽固醇蛋乳飲料品質較大的發酵溫度、發酵時間和接種量進行三因素三水平[L9(3"]正交試驗(見表9、10)，以測定酸度、感官評價綜合評分(總分20分，其中色澤5分、口感5分、滋味5分、香氣5分〉作為試驗指標，通過極差分析和方差分析確定其最佳二次發酵工藝條件。表9M3菌株二次發酵條件優化正交試驗設計因素水平表水平因素發酵溫度('c)發酵時間(h)接種量(％)13020123224233428表10Kl菌株二次發酵條件優化正交試驗設計因素水平表水平因素發酵溫度rc)接種量t(%)發酵時間(h)130122232226334330表ll酵母菌最佳二次發酵條件及產品指標測定結果指標發酵溫度廠C發酵時間Anin乾《鵬*感官評價乙醇含量酸度/。T550nm膽固醇降低率/%/分/%繊后M3菌株Kl菌株323424261117.515.30,71.060620.4210.4210.1300.19075.059.6通過對酸度、感官評價試驗指標進行極差分析和方差分析，確定發酵時間是影響蛋乳發酵飲料品質的主要因素，發酵溫度次之，接種量相對影響較小。為了獲得高效降低膽固醇和優良品質的蛋乳發酵飲料，針對K1或M3酵母菌株二次發酵條件進行了優化。通過正交試驗，以酸度、感官評價為評價指標，確定降膽固醇的蛋乳飲料最佳二次發酵條件為發酵溫度32'C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，發酵時間26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)，接種量P/。(K1或M3菌株)。由表11可知，在此優化發酵條件下制作的產品經4'C低溫后熟ld后，M3和K1菌株對原料中的膽固醇降低率分別為75.0%和59.6%，進一步證明了M3菌株比K1菌株降低膽固醇能力較強。產品乙醇含量為0.7。/。1.0。/。(m/m)，酸度為6062°T。成品蛋乳飲料呈乳黃色，口感細膩、滑幼，爽口；風味獨特，有濃郁的酯香風味伴著清淡的醇香，酸甜度適中；質地不分層也不絮凝，呈均勻一致的起泡性乳濁液。本試驗利用三株高產膽鹽水解酶的乳酸菌與一株酵母菌通過在優化條件下進行二步發酵，以及全蛋液在適宜條件下巴氏殺菌(67'C20min)，既掩蓋了全蛋液濃厚的蛋腥味問題，又可降低原料中的膽固醇含量，是一種營養豐富，對人體健康有益的功能性飲品。故可利用產膽鹽水解酶的益生菌株大規模生產降膽固醇的蛋乳發酵飲料。實施例4、利用高產膽鹽水解酶的三株乳酸菌及兩株酵母菌二步發酵法制備降膽固醇蛋乳發酵飲料1、乳酸菌復合發酵劑的制備按實施例3所述方法制備乳酸菌單一菌種發酵劑。在接種前將菌株Tx、KS4、KL1單一菌種發酵劑按l丄l比例均勻混合，即為乳酸菌復合發酵劑。2、酵母菌復合發酵劑的制備按實施例3所述方法制備酵母菌單一菌種發酵劑。在接種前將菌株M3和Kl單一菌種發酵劑按1:1比例均勻混合，即為酵母菌復合發酵劑。3、降膽固醇蛋乳飲料生產發酵條件的優化(1)乳酸菌一次發酵(前期發酵)條件的優化按實施例3所述方法，原輔料配方全蛋液用量15%,原料奶用量35%，料水比1:1(『/F)，蔗糖加量7。/。(『/F)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉膠用量0.2%。原料經殺菌、冷卻后進行乳酸菌一次發酵條件的優化。乳酸菌最佳一次發酵條件為發酵溫度43'C，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例為1:1:1，接種量3%。(2)酵母菌二次發酵(后期發酵)條件的優化在乳酸菌最佳一次發酵條件前提下，根據初步單因素多水平試驗結果，選取影響降膽固醇蛋乳飲料品質較大的發酵溫度、發酵時間和接種量進行三因素三水平[L9(3"]正交試驗(見表12)，以測定酸度、感官評價綜合評分(總分50分，其中色澤5分、滋味和氣味30分、組織狀態15分)作為試驗指標，通過極差分析和方差分析確定其最佳二次發酵工藝條件。表12M3與Kl菌株二次發酵條件優化正交試驗設計因素水平表水平因素發酵溫度rc)發酵時間(h)接種量(％)130241232262334283表13酵母菌二次發酵條件優化結果與初始發酵條件結果對照發酵發酵蓉《鄉iS感官評價/分乙醇含量/%酸度/。TA550nm膽固醇指標溫度廠c時間/hmttr纖后降低率/%對照組優化組343028243140.146.71.050.7564600.2920.0750.2920.06383.989.3通過對酸度、感官評價試驗指標進行極差分析和方差分析，確定發酵溫度是影響蛋乳發酵飲料品質的主要因素，發酵時間次之，接種量相對影響較小。為了獲得高效降低膽固醇和優良品質的蛋乳發酵飲料，針對M3與Kl酵母菌株二次發酵條件進行了優化。通過正交試驗，以酸度、感官評價為評價指標，確定降膽固醇的蛋乳飲料最佳二次發酵條件為發酵溫度30。C,發酵時間24h，Kl/M3菌種比例1:1，接種量1%。由表13可知，在此優化發酵條件下制作的產品經4。C低溫后熟ld后，原料中的膽固醇降低率為89.3%,產品乙醇含量為0.75%(m/m)，酸度為60°T。成品蛋乳飲料色澤呈乳黃色，口感細膩、幼滑、爽口，酸甜度適中；風味獨特，有濃郁的酯香風味伴著清淡的醇香，蛋腥味不明顯;質地不分層亦無絮凝沉淀，組織狀態呈均勻一致的起泡性乳濁液。在63°O30min熱處理條件下進行巴氏殺菌，蛋乳飲料未出現乳清分離和沉淀現象。其風味和感官狀態未發生變化。但是，為了保持蛋乳發酵飲料的生物活性，可省去加熱殺菌工序。4、鄰苯二甲醛法測定蛋乳發酵飲料中膽固醇的含量試管中加入發酵蛋奶樣品l.OOg，加入23mL甲醇氯仿混合液(F甲e/T氣仿=2:1)，混勻，于45'C水浴加熱15min，濾紙過濾于具塞比色管中，并補充甲醇氯仿混合液至10mL。取上述樣品處理液0.4mL，加入lmg/mL的鄰苯二甲醛(無水乙醇配制)0.2mL、混合酸(K蹄酸/F濃硫酸=l:l)4.0mL，于2037。C靜置10min。以試劑空白(甲醇氯仿混合液0.4mL、鄰苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL)調零，于波長550nm處測定樣品的吸光值。將測得樣品吸光度y值代入膽固醇-吸光值標準曲線中的線性回歸方程少=0.0026x+0.0333(及2=0.9959)求得膽固醇含量x值(mg/100mL)。膽固醇降低率(％)=(發酵前膽固醇含量-發酵后膽固醇含量)/發酵前膽固醇含量。蛋乳飲料不同發酵階段降低膽固醇的效果如表14所示。表14乳酸菌與酵母菌在不同發酵階段降低膽固醇的效果指標A550nm膽固醇降低率/%s-酵母菌二次發酵后熟享,爛-酵母菌二^次發酵后熟優化組0.2920.1970.0730.06136.784.789.3對照組0.2920.2210.0930.07527.576.983.9由表14可見，利用乳酸菌復合發酵劑在最佳一次發酵條件下(發酵溫度43°C，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例1:1:1，總接種量3%)進行前期發酵，乳酸菌對原料膽固醇的降低率為36.7%，由此證明乳酸菌產生的膽鹽水解酶在體外具有較好降膽固醇作用。為了進一步增強降低膽固醇效果，本試驗在乳酸菌最佳一次發酵條件前提下，利用酵母菌復合發酵劑在最佳二次發酵條件下(發酵溫度3(TC，發酵時間24h，M3/K1菌種比例1:1，總接種量1%)進行后期發酵。結果表明，酵母菌對原料膽固醇的降低率為84.7%，說明馬克斯克魯維酵母合成的膽鹽水解酶活力及其產量明顯高于乳酸菌，在體外具有高效降低食品中膽固醇的作用。發酵產品經4t:低溫后熟ld,原料膽固醇的降低率提高至89.3%，進一步證明了馬克斯克魯維酵母膽鹽水解酶在冷藏溫度下仍然維持較高活性。顯示發酵后的產品經過后熟階段，不僅繼續降低原料膽固醇含量，而且能夠提高產品品質，使蛋乳發酵飲料的風味更加柔和，清涼爽口。本試驗利用三株高產膽鹽水解酶的乳酸菌與兩株酵母菌通過在優化條件下進行二步發酵，以及全蛋液在適宜條件下巴氏殺菌(67-C，20min)，既掩蓋解決了全蛋液濃厚的蛋腥味問題，又可高效降低原料中的膽固醇含量，是一種集營養與保健為一體的功能性飲品。故可利用高產膽鹽水解酶的益生乳酸菌與酵母菌株大規模生產降膽固醇的蛋乳發酵飲料。本專利所屬項目h北京市自然科學基金"藏靈菇克魯維酵母菌降膽固醇作用及機理的研究"項目編號5092008項目起止時間2009.01-2011.12項目負責人劉慧本專利所屬項目2:北京市自然科學基金"藏靈菇益生菌產生物活性物質及生理功能的研究"項目編號5062006項目起止時間2006.01-2008.12項目負責人劉慧本專利所屬項目3:北京市大學生科學研究與創業行動計劃"藏靈菇源益生菌降膽固醇蛋乳發酵飲料的研制"項目起止時間2008.09-2009.06項目申請人賈慧項目指導教師劉慧。權利要求1、利用產膽鹽水解酶的乳酸菌、酵母菌制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法，其技術特征在于從藏靈菇中篩選獲得5株高產膽鹽水解酶(BSH)的乳酸菌、酵母菌，均具有高效降低膽固醇和優良發酵性能。菌株產生的BSH及胞外多糖不僅具有免疫調節、降膽固醇及抗腫瘤等功效，而且通過蛋液適當殺菌及蛋乳二步發酵，既解決原料蛋腥味問題，又可高效降低原料膽固醇含量，發酵產品屬于一種功能性飲品。2、根據權利要求1所述的用于生產降膽固醇蛋乳發酵飲料的5株具有高效降低膽固醇及高產膽鹽水解酶的乳酸菌、酵母菌屬于本發明保護范圍。3株乳酸菌的分類命名是菌株虹1為干酪乳桿菌(丄""0&"7/"1^0^/)(00^10:]^1809)，菌株Tx為嗜熱鏈球菌(5^e/tococcwAem7o/M^)(CGMCCJ^1810)，菌株KS4為乳酸乳球菌乳酸亞種(丄"ctococc^/ac泡subsp./acfe)(CGMCC地1807);2株酵母菌的分類命名是菌株Kl為馬克斯克魯維酵母CS:/w"eram;;cesm^jd^ms)(CGMCCJV21812),菌株M3為馬克斯克魯維酵母(《/w;^era/w;;caswarar/am^)(CGMCCW1811)。3、根據權利要求1所述的利用5株具有高效降低膽固醇及高產膽鹽水解酶的乳酸菌、酵母菌制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的配方、最佳發酵工藝條件及其產品與專用生產菌株也屬于本發明保護范圍。原輔料配方全蛋液15%，牛奶35%，料水比1:1(附D，蔗糖7。/。(附F)，CMC-Na0.3%，卡拉膠0.2%。全蛋液最佳殺菌條件67。C，20min。利用干酪乳桿菌KL1，乳酸乳球菌乳酸亞種KS4，嗜熱鏈球菌Tx的一次最佳發酵工藝條件為發酵溫度43°C，發酵時間8h，Tx/KS4/KLl菌種比例1:1:1，復合發酵劑接種量3%。利用馬克斯克魯維酵母M3和Kl的二次最佳發酵工藝條件為①發酵工藝1:Kl或M3菌株單一發酵劑接種量為1%，發酵溫度32°C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，發酵時間26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)；②發酵工藝2:發酵溫度3(TC，發酵時間24h，Kl/M3菌種比例l:l，復合發酵劑接種量1%。二次發酵后于4t:后熟ld。全文摘要本發明涉及一種利用產膽鹽水解酶(BSH)的乳酸菌、酵母菌制備降膽固醇蛋乳發酵飲料的方法，屬于一種功能性飲品。配方全蛋液15％，牛奶35％，料水比1∶1(W/V)，蔗糖7％，CMC-Na0.3％，卡拉膠0.2％。一次發酵條件嗜熱鏈球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亞種KS4、干酪乳桿菌KL1按1∶1∶1比例混合，接種量3％，43℃發酵8h。二次發酵條件馬克斯克魯維酵母M3和K1復合(1∶1)或單一菌種接種量1％，30℃(復合菌)或32～34℃發酵24～26h，4℃后熟1d，原料膽固醇降低率最高達89.3％。利用菌株高產BSH、胞外多糖等特性，不僅有免疫調節、降膽固醇及抗腫瘤等功效，而且通過蛋液適當殺菌及蛋乳二步發酵，既解決蛋腥味問題，又可高效降低原料膽固醇含量。本發明制作蛋乳飲料的發酵工藝簡單，周期短，成本較低，適于工業化生產。文檔編號A23L2/38GK101642274SQ20091009138公開日2010年2月10日申請日期2009年8月21日優先權日2009年8月21日發明者慧劉,嵩張,張紅星,徐振杰,彥梁,慧賈,趙貴龍,鐘思瓊申請人:北京農學院