專利名稱：一種產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑的制備方法，適用于功能性酸奶及益生菌制劑等發酵乳制品干粉發酵劑的生產。
背景技術：
開菲爾是以牛乳或羊乳為原料，添加含有乳酸菌和酵母菌的開菲爾粒發酵劑，經發酵釀制而成的一種傳統酒精發酵乳飲料。目前工業化生產的開菲爾乳品是以牛乳為原料，利用從開菲爾粒(又稱藏靈菇)中分離的乳酸菌和酵母菌進行發酵制得。開菲爾起源于俄羅斯北高加索地區，當地牧民將牛乳或山羊乳注入羊皮口袋經自然發酵生產酸乳酒，其殘留物再補加牛乳或山羊乳繼續發酵，經長期發酵后在皮口袋中形成不規則顆粒狀物體， 即為開菲爾粒。此后人們便直接將開菲爾粒添加到牛乳中，使之發酵成具有爽快酸味和起泡性的保健飲料，即為開菲爾。開菲爾乳品中含有消化吸收效果好的乳蛋白質和乳脂肪，其中有益菌群將牛乳中的乳糖大部分水解為對人體有益的L (+)-乳酸，只生成極少量的D (-)-乳酸。據測定，開菲爾中D(-)_乳酸的含量僅為2% 5%，遠低于普通酸奶的25% 60%，故開菲爾乳品適于乳糖不耐癥者飲用。同時，開菲爾中的L(+)_乳酸可改善人體對鈣、磷、鐵的吸收，且可提高人體中B族維生素(VB1、VB2、VB6、VB12、葉酸、尼克酸等)的含量。一些研究證實，開菲爾乳品具有較好的降血脂和降血糖的功效，并對結核病具有治療效果。此外，開菲爾乳品中含有抑制癌細胞增殖的莢膜多糖和溶解癌細胞的四碳二羧酸，可降低癌癥的發病率。同時還有降低血清膽固醇含量，增強肝臟功能，提高機體免疫力和抗衰老作用。開菲爾粒中的活菌對結核分枝桿菌、大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等病原菌均有強烈的抑制作用。乳酸菌是開菲爾粒中含量最多、最具活力的一部分菌群，屬于益生菌，主要存在于人體腸道。當其在人體腸道中達到一定數量時，能夠改善或調節腸道微生物菌群的平衡。乳酸菌的代謝產物可以降低腸道內的PH，抑制腸道中的腐敗菌生長和減弱腐敗菌在腸道的產毒作用，并有助于幫助消化，預防便秘，防止細胞老化，增強機體免疫力，降低血清膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥及抑制腫瘤細胞的形成等。早在1963年人們就證實攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發酵的酸奶具有降低血清膽固醇含量的功效。迄今為止，國內外學者對乳酸菌降膽固醇作用機理的研究尚存在不同觀點，主要集中于以下三點1.乳酸菌菌體細胞直接吸收同化膽固醇；2.乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結合態膽鹽降解為游離態膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發生共同沉淀作用；3.其他理論，如吸收同化與共沉淀聯合作用。本發明所用干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx作為益生菌， 可在生長代謝過程中產生大量高活力的膽鹽水解酶，經過體外牛津杯試驗和動物實驗證明有降低機體血清膽固醇含量的功效。目前，國內申請各種發酵劑制備方法的專利較多，如天津科技大學肖冬光和汪建明申請的“益生乳酸菌發酵劑的制備方法及其在新鮮干酪中的應用”(CN1560231)是制備直接添加于酸奶、干酪等發酵乳制品中的益生乳酸菌發酵劑；哈爾濱美華生物技術股份有限公司張柏林和吳榮榮申請的“德氏乳桿菌保加利亞亞種酸奶或發酵乳干粉發酵劑”(CN1628528)是利用單一的德氏乳桿菌保加利亞亞種制備用于酸奶或其他發酵乳生產的發酵劑；陜西師范大學張富新和雷長鵬申請的“羊奶酸奶專用發酵劑的制備方法”(CN102113556A)是利用從商品牛奶酸奶中分離所得的乳酸菌制備羊奶酸奶專用發酵劑。但關于利用分離篩選自藏靈菇的產膽鹽水解酶的乳酸菌，利用自動發酵罐高密度培養， 并制備干粉發酵劑的方法未見國內外相關文獻報道和專利報道。

發明內容
本發明的目的在于提供利用干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株產膽鹽水解酶的菌種制備干粉發酵劑的方法。本發明是通過以下技術方案實現的所述方法中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) KLl,乳酸乳球菌乳亞種 (Lactococcus lactis subsp. lactis)KS4，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) Tx三株菌種，均分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)，并已于 2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號分別為CGMCCNo. 1809 (菌株 KLl)，CGMCCNo. 1807 (菌株 KS4)和 CGMCCNo. 1810 (菌株 Tx)。 所述方法中，在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養基上，干酪乳桿菌KLl菌株的菌落大小為2 3mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規則，無光澤，扁平，灰白色，半透明， 菌落周圍有溶解CaCO3的透明圈，菌落有較高黏性；個體形態呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時菌體呈球形，G+無芽孢桿菌；乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx菌株的菌落大小為I 2_，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，菌落周圍有溶解 CaCO3的透明圈，菌落有較高黏性。個體形態呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，G+兼性厭氧菌。干酪乳桿菌KLl、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx作為益生菌，均可在生長代謝過程中產生膽鹽水解酶。所述方法中，菌種所用培養基均為市售蒙牛純牛奶，并于115°C滅菌15min。所述方法中，以2% (V/V)的接種量將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的干酪乳桿菌KLl，乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株菌種分別接種于裝有IOmL滅菌牛奶的試管中，37°C培養12h至牛乳凝固，得到活化后的菌種。所述方法中，在上述試驗結果基礎上，以3%的接種量將三株活化后的菌種分別接種于裝有IOOmL滅菌牛奶的三角瓶中，37°C培養12h至牛乳凝固，得到擴大培養液。所述方法中，在上述試驗結果基礎上，將2000mL蒙牛純牛奶加入5L自動發酵罐， 并加入5% (即IOOmL)新鮮胡蘿卜原汁作為生長因子，利用發酵罐于115°C滅菌15min，滅菌后利用冷水機將發酵罐中的牛奶冷卻至培養溫度。將KL1、KS4和Tx三株菌種擴大培養液以3 : I : 2的比例接種于發酵罐內，總接種量為4%，利用發酵罐自動控溫系統維持培養溫度為40°C，培養過程中流加濃度為10%的滅菌Na2CO3溶液，以維持培養液pH6. 5，設置攪拌機轉速為50r/min，培養時間6h，得到液體發酵劑。所述方法中，上述5L發酵罐由上海高機生物工程有限公司生產，其型號為 BI0F6005GBN。上述新鮮胡蘿卜原汁為將市售新鮮胡蘿卜去皮、煮熟，用九陽牌食物料理機直接榨汁所得。所述方法中，在上述試驗結果基礎上，將2000mL液體發酵劑于4°C、8000r/min條件下離心lOmin，收集得到菌泥。所述方法中，在上述試驗結果基礎上，將收集的菌泥平均加入2只盛有IOOmL滅菌乳的600mL凍干瓶中，加入2. 5%甘油(V/V)、2. 5%谷氨酸鈉(W/V)和2. 5%脫脂奶粉(伊利牌)的凍干保護劑，混合均勻后，得到濃縮發酵劑。將濃縮發酵劑于-30°C預凍13h至完全凍結狀態，得到預凍發酵劑。所述方法中，在上述試驗結果基礎上，利用6L LABCONCO真空冷凍干燥機(美國) 將預凍發酵劑于凍干溫度_55°C、真空度O. 16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態，得到凍干發酵劑。所述方法中，所得產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑活菌數可達101(lCfU/g以上，菌種存活率可達70%以上。干粉發酵劑發酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠細膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風味。上述方法得到的產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑的制備方法屬于本發明保護范圍。
具體實施例方式下述實施例對本發明作進一步說明而不限制本發明的保護范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量對體積的百分含量。實施例I、產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑的制備方法I、活化將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株菌種分別以2% (V/V)的接種量接種于IOmL滅菌牛奶中，37°C培養至牛乳凝固。如此傳代培養3次得到活化后的菌種。2、擴大培養將上述活化后的菌株KLl、KS4和Tx以3 %的接種量分別接種于裝有IOOmL滅菌牛奶的三角瓶中，37°C培養12h至牛乳凝固，得到擴大培養液。3、高密度培養將2000mL蒙牛純牛奶加入5L自動發酵罐，按表I加入不同組合的生長因子，利用發酵罐于115°C滅菌15min，滅菌后利用冷水機將發酵罐內的牛奶冷卻至培養溫度。將KU、 KS4和Tx三株菌種以3 I 2的比例接種于發酵罐內，總接種量為4% (即80mL)，利用發酵罐控溫系統維持培養溫度為40°C，按表2流加濃度為10%的滅菌Na2CO3溶液，以維持一定的培養液PH，設置攪拌機轉速為50r/min，培養時間6h，得到液體發酵劑。采用平板菌落計數法測定活菌數。表I不同生長因子對發酵劑活菌數的影響
權利要求
1. 一種利用菌株KLl CGMCCNo. 1809為干釀乳桿菌菌(Lactobacillus casei),菌株 KS4 CGMCCNo. 1807 為乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp. Iacti),菌株 Tx CGMCCNo. 1810為嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)三種產膽鹽水解酶乳酸菌制備干粉發酵劑的方法，其特征在于將菌株KL1、KS4和Tx分別于接種量2% (V/V)，培養溫度37°C，培養時間12h的條件下進行活化，得到活化菌種；將活化菌種于接種量3%，培養溫度37°C，培養時間12h的條件下分別進行擴大培養，得到擴大培養液；將KLU KS4和Tx 菌株的擴大培養液按3 I 2的比例接種于蒙牛純牛奶中，總接種量為4%，并按純牛奶體積5%的量加入新鮮胡蘿卜原汁作為生長因子，利用5L自動發酵罐進行滅菌和高密度培養，培養溫度40°C，培養液pH6. 5，攪拌轉速50r/min，培養時間6h，得到液體發酵劑；將液體發酵劑于4°C、8000r/mmin離心IOmin,棄掉上清液，收集得到菌泥；按離心前發酵劑1/10 體積的量，取滅菌牛奶作為凍干基質，分裝于600mL的凍干瓶中，將離心收集后的菌泥置于凍干基質中，加入2. 5%甘油(V/V)、2. 5%谷氨酸鈉(W/V)和2. 5%脫脂奶粉(W/V)的凍干保護劑，混合均勻后，得到濃縮發酵劑；將每個凍干瓶裝量為IOOmL的濃縮發酵劑于_30°C 預凍13h至凍結狀態，得到預凍發酵劑；利用美國產6L LABC0NC0真空冷凍干燥機將預凍發酵劑于凍干溫度_55°C、真空度O. 16mBar條件下，凍干48h至完全干燥狀態，得到產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑。
全文摘要
本發明涉及一種產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑的制備方法，適用于功能性酸奶及益生菌制劑等發酵乳制品干粉發酵劑的生產。本發明利用篩選自藏靈菇的干酪乳桿菌KL1、乳酸乳球菌乳亞種KS4和嗜熱鏈球菌Tx三株產膽鹽水解酶的菌種，經過活化和擴大培養，利用自動發酵罐進行高密度培養，再經離心濃縮和加入凍干保護劑，預凍和凍干，制備產膽鹽水解酶乳酸菌干粉發酵劑。本發明優化高密度培養、預凍和凍干條件，使菌種存活率達到70％以上，且干粉發酵劑活菌數可達1010cfu/g以上。本發明制備的干粉發酵劑發酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠細膩幼滑，甜酸度適中，有濃郁的酯香風味。
文檔編號C12R1/46GK102586137SQ20121000553
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者劉慧 , 張紅星, 熊利霞, 謝遠紅, 賈慧, 鐘思瓊, 高秀芝 申請人:北京農學院