一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法
【專利摘要】一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，涉及乳酸。將菌種接入含甘油的種子培養基中培養得種子液，再接入含甘油的擴大培養液擴大培養，流加堿溶液將擴大培養液的pH值控制在4.5～7.5，當擴大培養液中的菌體細胞濃度達到1.0～15.0g/L時，利用泵將擴大培養液泵入反應器內，當擴大培養液完全充滿反應器后，維持擴大培養液在發酵罐和反應器中的循環，當游離菌體細胞濃度降至最低點時，視為固定化過程結束；菌體細胞固定化完成后，加入含甘油的發酵培養基控制初始甘油濃度為5～200g/L，或直接更換初始甘油濃度為5～200g/L的發酵培養基，進行固定化發酵后得乳酸。
【專利說明】—種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及乳酸，尤其是涉及一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法。
【背景技術】 [0002]乳酸，學名-羥基丙酸，可按其旋光性分為L型、D型和DL型。乳酸是一種十分重要的有機酸，可廣泛用于食品、制藥、紡織、印染、化妝品等領域。以乳酸為原料合成的聚乳酸(PLA)是一種強度高、可塑性強、環境友好的有機高分子材料，高品質的聚乳酸可用于醫用手術縫合線、骨骼固定材料、組織缺損部位補強材料等，具有很好的生物相容性；較低品質的聚乳酸可用于農用大棚、一次性飯盒等，可在自然環境下被微生物降解，被認為是極佳的塑料替代品。隨著對乳酸及其衍生物的研究越來越廣泛和深入，乳酸的需求量也隨之不斷增加。
[0003]目前，乳酸的生產方法主要有化學合成法、酶催化法和微生物發酵法。化學合成法的乳酸產品光學純度低，且使用的原料具有很強的毒性；酶催化法生產乳酸條件苛刻、成本很高，很難實現工業化生產；微生物發酵法生產乳酸，其原料來源廣泛、能耗小、安全性好，并且可以通過菌種的選育或控制其代謝途徑來獲得高光學純度的乳酸，故微生物發酵法在世界范圍內成為生產乳酸的主要方法。
[0004]21世紀，石油供需矛盾日益尖銳，石油化工及石化燃料燃燒造成的環境問題日益突出，開發新的對環境無害的可再生能源日益得到各國的重視。生物柴油是一種環境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年來，生物柴油產業迅速崛起，蓬勃發展，而甘油是生物柴油生產過程中的主要副產物，每生產I噸生物柴油會同時產生0.1噸粗甘油。隨著世界范圍內生物柴油需求量和生產量的迅猛增長，其副產物粗甘油成為豐富而廉價的原料，對它的有效利用也成為緊迫的課題。同時，傳統乳酸發酵產業的主要原料葡萄糖、淀粉等糖質原料的成本不斷增加，使得乳酸產業受到很大的原料成本壓力。因此利用廉價的粗甘油生產高附加值的乳酸逐漸成為新的研究方向。目前，國內外利用微生物轉化甘油生產乳酸的研究較少，其中清華大學的學者利用大腸桿菌可以以純甘油為底物發酵得到85.8g/L的乳酸(洪安安，程可可，孫燕，等.代謝甘油高產乳酸的菌種選育及培養基優化[J].微生物學通報，2009，36 (8): 1195-1199)。但是，運用傳統發酵工藝，直接以甘油作為原料發酵乳酸往往存在著底物抑制嚴重、生物量低、生產強度低等問題，限制了微生物轉化甘油生產乳酸的工業化應用。
[0005]纖維床生物反應器(FBB)是在傳統填充床反應器基礎上改進設計出的一種簡單、高效的生物反應器，尤其適用于厭氧或微氧條件下的微生物固定化發酵。纖維床生物反應器選擇棉纖維織物等纖維材料作為固定菌體細胞的基質，具有以下優點:①材料化學惰性，不會對菌體細胞有毒害作用，也不會被菌體所降解，不影響菌體在發酵過程中的生長情況；②具有較高的比表面積和空隙率，傳質性能良好；③單位體積可固定的細胞數量多；④價格便宜，易獲得，固定化成本低制備方法簡單，適合工業放大；⑥有較好的機械強度，能經受較長時間的使用；⑦穩定性好。
【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供可資源化利用廉價的生物柴油副產物粗甘油，降低乳酸發酵的原料成本，提高單位操作體積菌體密度，省去重復的菌種活化與接種等操作，提高乳酸生產強度的一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法。
[0007]本發明包括以下步驟:
[0008]I)將菌種接入含甘油的種子培養基中培養，得到種子液；
[0009]2)將種子液接入含甘油的擴大培養液，在發酵罐中進行擴大培養，同時用補料裝置流加堿溶液將擴大培養液的PH值控制在4.5~7.5的范圍內，培養過程中測定培養液中的菌體濃度；
[0010]3)當擴大培養液中的菌體細胞濃度達到1.0~15.0g/L時，利用泵將擴大培養液泵入纖維床生物反應器內，當擴大培養液完全充滿纖維床生物反應器后，維持擴大培養液在發酵罐和纖維床生物反應器中的循環，菌體細胞固定化過程中測定擴大培養液中游離菌體細胞的濃度，當游離菌體細胞濃度降至最低點時，視為固定化過程結束；
[0011]4)菌體細胞固定化完成后，加入含甘油的發酵培養基控制初始甘油濃度為5~200g/L，或直接更換初始甘油濃度為5~200g/L的發酵培養基，進行固定化發酵后，得到乳酸。
[0012]在步驟I)中，所述菌種為戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) R3-8,該菌種已于2011年3月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，該保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.4726 ；
[0013]所述菌種接入含甘油的種子培養基中的接種量按質量百分比可為1%~15% ;所述種子培養基(/L)的組成為甘油40g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g，pH6.5 ；所述培養的條件可為30~45°C培養5~25h。
[0014]在步驟2)中，所述甘油的濃度可為20~80g/L，所述擴大培養液(/L)的組成可為甘油40g，酵母粉6g，胰蛋白胨IOg,乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g，MnCl2 -H2O0.15g，消泡劑0.05g,pH6.0~6.2 ;所述擴大培養的條件可為:培養溫度為30~45°C，攪拌速率為50~350rpm，并利用通氣裝置通入O~1.0vvm的空氣；所述堿溶液的摩爾濃度可為4~7M。
[0015]在步驟3)中，所述固定化過程中，培養溫度可為25~45°C，攪拌速率可為O~550rpm,并通入O~2.0vvm的空氣，同時流加4~7M堿溶液將培養液的pH值控制在4.5~
7.5的范圍內。
[0016]在步驟4)中，所述發酵培養基(/L)的組成可為甘油60g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑0.05g, ρΗ6.0~6.2 ;所述固定化發酵過程中，發酵溫度為25~45°C，通入O~2.0vvm的空氣，同時流加4~8M堿溶液將發酵液的pH值控制在4.5~7.5的范圍內。
[0017]本發明固定化發酵生產乳酸的底物，既可來源于生物柴油生產過程中的副產物粗甘油、化學法生產的粗甘油或生物發酵法生產的粗甘油等。
[0018]本發明固定化 發酵生產乳酸的底物為各行業所得的粗甘油，只需進行簡單的分離提純或直接利用，不需要精制成甘油純品。[0019]本發明固定化發酵生產乳酸所使用的纖維床生物反應器是由同心式內、外圓筒構成的帶夾層的填充柱體。
[0020]本發明固定化發酵生產乳酸所使用的纖維床生物反應器的夾層中通循環水控制溫度，內圓筒中填充棉纖維織物作為填充基質，不銹鋼絲網為支撐材料。
[0021]本發明的優點在于:
[0022]I)本發明將廉價的生物柴油副產物甘油資源化利用，進一步轉化為高附加值的乳酸，有效利用甘油，從而延長了生物柴油的產業鏈，可用于生物柴油和乳酸的聯產。
[0023]2)本發明利用纖維床生物反應器固定化菌體細胞，進行乳酸的發酵，較之傳統發酵工藝，可顯著提高微生物轉化甘油發酵生產乳酸的生產強度，同時省去反復的菌種活化、接種、擴大培養以及清洗發酵罐體等工序，大大簡化了操作流程，提高了生產效率。
[0024]3)本發明所使用的固定化裝置結構簡單、成本低、固定化效果好，有利于工業放大；且該裝置可連續長期穩定運行，有利于工業化連續生產。
[0025]4)本發明所使用的底物甘油無需嚴苛的精制純化，節省了原料的提純分離費用。
[0026]5)本發明所使用的戊糖乳桿菌是一種益生菌，產品乳酸無生物安全性方面的隱
串
[0027]6)本發明所使用的發酵培養基可以不進行滅菌，直接用于發酵，從而減少了能耗，進一步降低生產成本。
[0028]7)本發明利用纖維床生物反應器固定化細胞直接轉化甘油(包括未精制的化學法、生物發酵法生產的甘油及生物柴油產業的副產物粗甘油)發酵生產乳酸的工藝技術，用于提升以甘油為底物發酵乳酸的生產強度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發明所用的利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的發酵裝置示意圖。其中:1.發酵罐；2.纖維床生物反應器；3.泵；4.通氣裝置；5.補料裝置。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例將對本發明作進一步說明。
[0031]實施例1:
[0032]本實施例給出的是以生物柴油副產物粗甘油為原料進行纖維床生物反應器固定化戊糖乳桿菌批次發酵乳酸的工藝:
[0033]1.培養基(培養基中所加甘油均為生物柴油副產物粗甘油，培養基中的甘油濃度是指所加粗甘油中所含甘油的濃度):
[0034]I)種子培養基(/L):
[0035]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸鈉6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0036]2)擴大培養液(/L):甘油40g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g,消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0037]3)發酵培養基(/L ):
[0038]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸鈉 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;[0039]2.菌種:戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) R3-8 ;
[0040]3.發酵過程:
[0041]I)將戊糖乳桿菌接入種子培養基中(250mL三角瓶，裝液量IOOmL),培養溫度34°C，搖床轉速150rpm，培養12h，得到種子液；
[0042]2)擴大培養使用5L攪拌式發酵罐，裝入2L擴大培養液，將種子液以10%的接種量接入，培養溫度為34°C，以6M氨水控制培養液pH為6.0，通入0.3vvm的空氣，攪拌轉速250rpm,進行擴大培養,過程中測定菌體濃度；
[0043]3)當培養液中菌體濃度達到lg/L時，利用蠕動泵以160mL/min的流速將培養液泵入如圖1所示的纖維床生物反應器內，充滿反應器后將泵的流速降為16mL/min保持循環，進行菌體細胞的固定化，固定化過程中，過程中保持溫度為34°C，以6M氨水控制pH為6.0，通入0.3vvm的空氣,攪拌轉速250rpm,同時測定游離的菌體濃度，當菌體濃度下降至最低點時，視為固定化過程結束；圖1中攪拌式發酵罐I通過管路連接帶有恒溫循環水夾套的亞克力材質纖維床固定化裝置(50_X345mm),內部填充的固定化基質為700_X300_的棉纖維織物(厚約2_)，以不銹鋼絲網固定成螺旋狀，置于纖維床生物反應器2柱體內，反應器柱體底部裝有布流器，使發酵液進入柱體時分布均勻，纖維床生物反應器的實際工作體積為468mL ；
[0044]4)停止循環，并利用泵3將發酵罐I和纖維床生物反應器2中的培養液泵出，并立即加入2L新鮮發酵培養基，保持發酵液在發酵罐I和纖維床生物反應器2中循環，發酵溫度為34°C，以6M氨水控制發酵液pH為6.0，利用通氣裝置4通入0.3vvm的空氣，攪拌轉速250rpm,進行固定化發酵,過程中測定發酵液中的菌體濃度、甘油濃度和乳酸濃度，當發酵液中甘油濃度降至10g/L以下時，視為固定化批次發酵結束。在圖1中，標記5為補料裝置。
[0045]4.檢測方法:
[0046]采用高效液相色譜(AgilentllOOSeries HPLC,北京安捷倫公司，Aminex-HPX_87H色譜柱)檢測甘油濃度，采用生化分析儀(Bioprofile300, Nova)測定乳酸濃度。
[0047]5.發酵結果:
[0048]批次發酵33.4h后，發酵液中乳酸濃度為50.2g/L，乳酸對甘油的質量得率為0.960，乳酸生產強度達到1.50g/L/h。
[0049]實施例2:
[0050]本實施例給出的是以生物柴油副產物粗甘油為原料進行纖維床生物反應器固定化戊糖乳桿菌補料批次發酵乳酸的工藝:
[0051]1.培養基(培養基中所加甘油均為生物柴油副產物粗甘油，培養基中的甘油濃度是指所加粗甘油中所含甘油的濃度):
[0052]I)種子培養基(/L):
[0053]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸鈉6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0054]2)擴大培養液(/L):
[0055]甘油40g,酵母粉 6g,胰蛋白胨 IOg,乙酸鈉 6g, K2HPO4L 5g, MnCl2.H2O0.15g,消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0056]3)初始發酵培養基(/L):[0057]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸鈉 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0058]2.菌種:戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus R3-8)
[0059]3.發酵過程:
[0060]I)將戊糖乳桿菌接入種子培養基中(250mL三角瓶，裝液量IOOmL),培養溫度34°C，搖床轉速150rpm，培養12h，得到種子液；
[0061]2)擴大培養使用5L攪拌式發酵罐，裝入2L擴大培養液，將種子液以10%的接種量接入，培養溫度為34°C，以6M氨水控制培養液pH為6.0，通入0.3vvm的空氣，攪拌轉速250rpm,進行擴大培養,過程中測定菌體濃度；
[0062]3)當培養液中菌體濃度達到lg/L時，利用蠕動泵以160mL/min的流速將培養液泵入如圖1所示的纖維床生物反應器內，充滿反應器后將泵的流速降為16mL/min保持循環，進行菌體細胞的固定化，固定化過程中，過程中保持溫度為34°C，以6M氨水控制pH為6.0，通入0.3vvm的空氣,攪拌轉速250rpm,同時測定游離的菌體濃度，當菌體濃度下降至最低點時，視為固定化過程結束；
[0063]4)停止循環，并利用泵將發酵罐和纖維床生物反應器中的培養液泵出，并立即加入2L新鮮初始發酵培養基，保持發酵液在發酵罐和纖維床生物反應器中循環，發酵溫度為34°C,以6M氨水控制發酵液pH為6.0,通入0.3vvm的空氣,攪拌轉速250rpm,進行固定化發酵，過程中測定發酵液中的菌體濃度、甘油濃度和乳酸濃度，當發酵液中甘油濃度降至IOg/L以下時，向發酵罐中流加IL粗甘油水溶液(其中甘油含量為250g/L)，直至發酵產物乳酸的濃度增長速率小于0.lg/L/h，視為固定化補料批次發酵結束。
[0064]4.檢測方法同實施例1。
[0065]5.發酵結果:
[0066]發酵145.5h后，發酵液中乳酸濃度為88.5g/L，乳酸對甘油的質量得率為0.871，乳酸生產強度為0.6lg/L/h。
[0067]實施例3:
[0068]本實施例給出的是以生物柴油副產物粗甘油為原料進行纖維床生物反應器固定化戊糖乳桿菌反復批次發酵乳酸的工藝:
[0069]1.培養基(培養基中所加甘油均為生物柴油副產物粗甘油，培養基中的甘油濃度是指所加粗甘油中所含甘油的濃度):
[0070]1)種子培養基(/L):
[0071]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸鈉6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0072]2)擴大培養液(/L):
[0073]甘油40g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸鈉 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0074]3)發酵培養基(/L ):
[0075]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸鈉 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0076]2.菌種:戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) R3-8 ;
[0077]3.發酵過程:[0078]I)將戊糖乳桿菌接入種子培養基中(250mL三角瓶，裝液量IOOmL),培養溫度34°C，搖床轉速150rpm，培養12h，得到種子液；
[0079]2)擴大培養使用5L攪拌式發酵罐，裝入2L擴大培養液，將種子液以10%的接種量接入，培養溫度為34°C，以6M氨水控制培養液pH為6.0，通入0.3vvm的空氣，攪拌轉速250rpm,進行擴大培養,過程中測定菌體濃度； [0080]3)當培養液中菌體濃度達到lg/L時，利用蠕動泵以160mL/min的流速將培養液泵入如圖1所示的纖維床生物反應器內，充滿反應器后將泵的流速降為16mL/min保持循環，進行菌體細胞的固定化，固定化過程中，過程中保持溫度為34°C，以6M氨水控制pH為6.0，通入0.3vvm的空氣,攪拌轉速250rpm,同時測定游離的菌體濃度，當菌體濃度下降至最低點時，視為固定化過程結束；
[0081]4)停止循環，并利用泵將發酵罐和纖維床生物反應器中的培養液泵出，并立即加入2L新鮮發酵培養基，保持發酵液在發酵罐和纖維床生物反應器中循環，發酵溫度為34°C,以6M氨水控制發酵液pH為6.0,通入0.3vvm的空氣,攪拌轉速250rpm,進行固定化發酵，過程中測定發酵液中的菌體濃度、甘油濃度和乳酸濃度，當發酵液中甘油濃度降至IOg/L以下時，視為單個固定化批次發酵結束；
[0082]5)將發酵罐和纖維床生物反應器中上一批次的發酵液全部泵出，立即加入下一批次的發酵培養基，發酵參數同步驟4)，本實施例共連續反復進行了 5個批次發酵。
[0083]4.檢測方法同實施例1。
[0084]5.發酵結果:
[0085]反復5個批次發酵平均發酵時間為31.2h，平均乳酸終濃度為50.6g/L，平均乳酸對甘油質量得率為0.968，平均乳酸生產強度為1.626g/L/h。
[0086]表1
[0087]
【權利要求】
1.一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將菌種接入含甘油的種子培養基中培養，得到種子液；所述菌種為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) R3-8,該菌種已于2011年3月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.4726 ； 2)將種子液接入含甘油的擴大培養液，在發酵罐中進行擴大培養，同時用補料裝置流加堿溶液將擴大培養液的PH值控制在4.5~7.5的范圍內，培養過程中測定培養液中的菌體濃度； 3)當擴大培養液中的菌體細胞濃度達到1.0~15.0g/L時，利用泵將擴大培養液泵入纖維床生物反應器內，當擴大培養液完全充滿纖維床生物反應器后，維持擴大培養液在發酵罐和纖維床生物反應器中的循環，菌體細胞固定化過程中測定擴大培養液中游離菌體細胞的濃度，當游離菌體細胞濃度降至最低點時，視為固定化過程結束； 4)菌體細胞固定化完成后，加入含甘油的發酵培養基控制初始甘油濃度為5~200g/L，或直接更換初始甘油濃度為5~200g/L的發酵培養基，進行固定化發酵后，得到乳酸。
2.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟I)中，所述菌種接入含甘油的種子培養基中的接種量按質量百分比為1%~15%;所述種子培養基(/L)的組成為甘油40g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g，pH6.5。
3.如權利要求1所述 一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養的條件為30~45°C培養5~25h。
4.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟2)中，所述甘油的濃度為20~80g/L，所述擴大培養液(/L)的組成可為甘油40g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 IOg,乙酸鈉 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡劑 0.05g，ρΗ6.0 ~6.2。
5.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟2)中，所述擴大培養的條件為:培養溫度為30~45°C，攪拌速率為50~350rpm，并利用通氣裝置通入O~1.0vvm的空氣；所述堿溶液的摩爾濃度可為4~7M。
6.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟3)中，所述固定化過程中，培養溫度為25~45°C，攪拌速率為O~550rpm，并通入O~2.0vvm的空氣，同時流加4~7M堿溶液將培養液的pH值控制在4.5~7.5的范圍內。
7.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟3)中，所述纖維床生物反應器是由同心式內、外圓筒構成的帶夾層的填充柱體，夾層中通循環水控制溫度，內圓筒中填充棉纖維織物作為填充基質，不銹鋼絲網為支撐材料。
8.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟4)中，所述發酵培養基(/L)的組成為甘油60g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸鈉6g，K2HPO4L 5g, MnCl2.H2O0.15g,消泡劑 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2。
9.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于在步驟4)中，所述固定化發酵過程中，發酵溫度為25~45°C，通入O~2.0vvm的空氣，同時流加4~8M堿溶液將發酵液的pH值控制在4.5~7.5的范圍內。
10.如權利要求1所述一種利用固定化細胞轉化甘油生產乳酸的方法，其特征在于所述甘油來源于生物柴油生產過程中的副產物粗甘油、化學法生產的粗甘油或生物發酵法生產的粗甘油。
【文檔編號】C12N11/12GK103555777SQ201310576790
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】方柏山, 嚴正平 申請人:廈門大學