專利名稱：一種大豆基因啟動子序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物基因啟動子及其應用，屬于生物工程領域。
背景技術：
啟動子是基因表達調控的重要順式作用元件，在某種程度上決定基因表達的時空順序。 同時，啟動子也是基因工程研究的一個重要工具。因此，分離啟動子、弄清楚啟動子的分子 本質是研究基因表達調控、構建基因工程表達載體的關鍵。目前應用較廣泛的組成型啟動子 有花椰菜花葉病毒的CaMV35s啟動子，但由于CaMV35s啟動子來自于病毒，應用在植物基因 工程中可能會存在一定的安全隱患，所以近年來人們更傾向于使用來自高等植物的啟動子。 目前，已有報道的來自于高等植物的組成型啟動子的有水稻肌動蛋白基因啟動子(McElroyD, et al. Plant Cell. 1990， 2(2) : 163 71)、玉米泛素基因啟動子(Alan H. Christensen, et al. Plant Molecular Biology. 1992， 18(4) :675~689)等；組織特異型啟動子有番茄果實專 一性啟動子2A12 (毛自朝等.科學通報.2002, 47(6) :444-448)、大豆Gmhspl7. 32B熱誘導 表達啟動子(Ralf Prandl， et al. Plant Molecular Biology. 1996， 31:157 162)等。
大豆是一種重要的經濟作物，但生殖器官(花和莢)脫落率高達55%~70%。研究表明，大 豆的落花落莢率與溫度、水分、光照、植物體內生長素及乙烯的含量等因素有關(張興文等. 大豆科學.2002, 21(4) :290 294)。乙烯是一種重要的植物激素(Yang S-F, et aL Annu. Rev. Plant Physiol, 1984, 35:155~189)，在植物生長發育、果實成熟、脫落等過程中起重要作 用。ACC(l-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, 1-氨基環丙烷-1-羧酸)合酶是乙烯 合成途徑中的限速酶，它在植物組織內活性的大小往往決定著乙烯合成的速率(LiuY-D， et al. The Plant Cell. 2004， 16:3386~3399),因此ACC合酶基因的表達調控對于乙烯的體內 合成是至關重要的，而對于大豆ACC合酶基因啟動子調控機制的研究具有重要的現實意義。 迄今為止關于ACC合酶基因啟動子的研究卻相對較少，目前僅報導了從番茄(Shiu， 0. Y., etal. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998， 95:10334~10339),擬南芥(S5nke Holtorf， et al. Plant Molecular Biology. 1995， 25(4) :637~646)以及綠豆(Cazzonelli CI, et al. Transgenic Research 2005, 14: 941~967)等植物中分離得到ACC合酶基因啟動子，有關大 豆ACC合酶基因啟動子的研究截止目前尚未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種新克隆的來源于大豆的植物基因啟動子，用于驅動外源基因在
轉基因植物中表達。
本發明的另一個目的是提供一種含有上述啟動子序列的植物基因表達載體。 本發明的另一個目的是提供含有上述啟動子序列的轉基因細胞系、組織或植物個體 本發明的另一個目的是上述啟動子序列在培育轉基因植物中的應用。
、本發明的技術方案是， 一種大豆基因啟動子序列，包括-
(1) 具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或
(2) 與(1)所述的核酸序列互補的核酸序列；或
(3) 與(1)或(2)得核酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或
(4) 可與(1)、 (2)或(3)所述核酸序列在雜交條件下雜交，并具有相同功能的核酸序列。 含有核苷酸序列的基因表達載體。含有核苷酸序列的轉基因細胞、組織或個體。本發明在培 育轉基因植物中的應用。
本發明提供的DNA序列，如SEQ ID N0:1所示，代表的是大豆ACC合酶基因的啟動子序 列。其序列共573bp。其中165 167bp是翻譯起始密碼子，lbp處為轉錄起始位點，-44 -50bp 為推測的TATA-box, -223~-227bp為推測的CAAT-box。此外還有三個脅迫誘導元件光應答 元件Boxl位于-168 -174bp，Box4位于-21(T-215bp，誘導物應答元件W-box位于-268 -272bp。
本發明從大豆中分離克隆出一種大豆ACC合酶基因的啟動子，基本技術路線為啟動子 序列克隆——序列分析——表達載體構建——啟動子活性分析。其中，啟動子克隆可利用的方法為本領域研究人員熟知，包括有啟動子陷阱技術、錨定PCR、反向PCR (I-PCR)、接頭 PCR以及熱不對稱交錯PCR (TAIL-PCR)等；獲得序列可利用植物啟動子順式元件數據庫，例 如 PLANTCARE ( http: 〃s。hinx. rug, ac. be: 8080/PlantCare/ )， 或 PLACE (http:〃www.dna,affrc. go. Jp /htdocs/PLACE/)對得到的啟動子序列進行分析，初步確 定啟動子的核心元件和相關功能原件；將該序列進一步克隆到含有GUS、 GFP、 GRP等常用報 告基因或抗抗生素、抗除草劑等常用抗性基因、或編碼某一功能蛋白的結構基因的常用植物 雙元表達載體或線性基因表達載體中，利用本領域研究人員熟知的多種轉化手段可以實現將 本發明所涉及的植物表達載體轉入植物中，任何適用于植物或植物細胞的轉化方法都可以使 用，如使用農桿菌介導侵染法、蘸花法、電擊法，基因槍轟擊法、花粉管導入法、細胞和原 生質體顯微注射法、直接轉化法等，轉化煙草、擬南芥等模式植物，或其他單子葉、雙子葉 植物細胞、組織。被轉化的細胞在合適的條件下可再生成完整的轉基因植株。最后，通過檢 測報告基因的表達情況確定該啟動子的活性，如GUS報告基因編碼e-葡萄糖苷酸酶，可以在 體外催化裂解人工合成的X-gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖羧酸)底物，產生深藍色化合物 沉淀于植物組織。
本發明的有益效果是，本發明所闡述的來自于大豆ACC合酶基因啟動子區域的序列可作 為一個啟動子元件插在DNA雙元載體中而用于所有能夠使用該啟動子的植物(即該植物的RNA 聚合酶能與本文公開的啟動子序列結合)的轉化來表達目的基因。在構建的表達載體中，與 該啟動子連接的可以是任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以來自同源植物、外源植 物、真菌、藻類、細菌、病毒或動物基因，也可以是人工設計合成的DNA序列。這些序列可 以是一段編碼有功能的蛋白質或其一部分的正義序列或一段反義序列。本發明克隆到的啟動 子是國內首次克隆到的大豆ACC合酶基因的啟動子。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。圖1為本發明的ACC合酶基因的5' -RACE結果電泳圖
圖2為本發明的TAIL-PCR結果電泳圖3為本發明的植物表達載體的構建流程圖4為本發明的大豆ACC合酶基因啟動子驅動的GUS報告基因在煙草葉片中的瞬時表達 結果的煙草葉瞬時表達GUS染色結果；
圖5為本發明的大豆ACC合酶基因啟動子驅動的GUS報告基因在煙草葉片中的瞬時表達 結果的煙草空白對照。
具體實施例方式
植物材料大豆種子為鐵豐-29,在實驗室栽培菌種為本實驗室保存pMD19 simple-T載 體、各種酶、試劑和試劑盒均購自TaKaRa (大連)公司；測序及引物合成均由TaKaRa (大連) 公司完成。
實施例1
使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit進行ACC合酶基因的5' -RACE實驗。具體步驟如下
1. 大豆DNA的提取
以大豆葉片為材料，采用SDS-CTAB改進法法提取其總DNA，取2yLDNA樣品，瓊脂糖凝 膠電泳檢測其濃度。
2. ACC合酶基因的擴增
根據已知的大豆ACC合酶基因序列(GenBank Accession No: dq273840),在其兩側設計 引物CTA798F : 5' -AGACTATATGGGGTTGATGGCTGC-3' ， CTA79服5' -GAGCTATCGCAC-ATAACTGGAACA-3',然后以大豆基因組DNA為模板，以CTA798 F/CTA798 R為引物擴增目的 基因片段，pcr反應條件94。C 5min;94。C 30s, 56°C 30s,72。C lmin，共30個循環；72°C lOmin。 切膠回收PCR產物，進行瓊脂糖凝膠電泳后進行測序，獲得ACC合酶基因序列。
3. ACC合酶基因的5'-cDNA末端快速擴增(5'-RACE)先根據1.2.2獲得的ACC合酶基因序列設計兩個嵌套的反向特異弓j物GSP:5' -GGCCTTCTCATACGCATCTTCCAA-3' ，GSPN:5' -CCAGTTGCTCCACCGCTCATGACA-3'，再使用TaKaRa RNAiso Reagent提取大豆嫩葉總RNA，然后使用TaKaRa 5' -Full RACE Kit進行5' -Full RACE 實驗(圖1)。
實施例2
采用TAIL-PCR的方法從大豆DNA中克隆出ACC合酶基因啟動子片段。具體步驟如下
根據實施例1中獲得的ACC合酶基因序列，設計三個嵌套的反向特異引物CTA798 spl,
CTA798 sp2, CTA798 sp3，用CTA798 spl， CTA798 sp2， CTA798 sp3分別與4個AD引物(表
1)配對進行TAIL-PCR擴增，首先以大豆基因組DNA為模板，CTA798 sp3為下游引物，4個
AD引物為上游引物進行TAIL-PCR。反應體系luL模板，5p L10XLA Buffer (Mg2 + ), 1 u L
LA Taq酶，特異引物20pmol， AD primer lOOpmol，補水至50uL;反應條件見表2。然后
以第一次的TAIL-PCR產物為模板,CTA798 sp2為下游引物，4個AD引物為上游引物進行
TAIL-PCR，反應體系及反應條件與第一次PCR的相同；再以第二次TAIL-PCR產物為模板，
CTA798 spl為下游引物，4個AD引物為上游引物進行TAIL-PCR ，三次PCR的反應體系及反
應條件與第一、二次PCR的相同。最后將一、二、三次TAIL-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，
回收合適片段,測序。 一 表l TAIL-PCR擴增引物
Table 1The primers used in TAIL-PCR_
CTA798 SP1: 5' -GACCCATTTGGATAACCCCGTTAG-3' CTA798 SP2: 5' -GGGGTTTTCATCATAAGCCTTCCA-3' CTA798 SP3: 5' -GGGGATGCTTCACCATGTCCATCT-3' AD1:5' -NTCGASTWTSGWGTT- 3' AD2: 5' -NGTCGASWGANAWGAA- 3' AD3: 5' - WGTGNAGWANCANAGA- 3'
AD4: 5' - AGWGNAGWANCAWAGG- 3'_
實施例3以pBI121為基礎，構建由ACC合酶基因上游調控序列啟動的GUS基因植物表達載體，并
轉入農桿菌EH105，構建流程如圖3所示。 (l)中間載體的構建
根據實施例2中得到的ACC合酶基因啟動子片段序列設計引物NEF， NER，并加上酶切表2
TAIL-PCR擴增反應步驟 Table 2TA化一PCR procedure
1 x93 °Clmin95 。Clmin
1 X94 。C30s62 °Clmin72 。C 2min
1 X94 。C30s25 °Clmin72 。C 2min
94 °C30s60 °Clmin72 °C 2min
15 X94 。C30s60 °Clmin72 °C 2min
94 °C30s44 °Clmin72 °C 2min
IX72 °C5min4 °Coo
位點(斜體下劃線部分)。NEF: 5' -/MgOTACTTTATGTAGCGTGTGCAC-3' (Hind III),NER: 5， H6GGAAGCCTTTTGAGTGTGGT-3' (BamH I) ， PCR得到全長啟動子片段，切膠回收并將此 片段克隆到PMD19 simple-T載體，并轉化到大腸桿菌topl0;從含卡那霉素50ng/mL的LB 平板上挑取單菌落進行酶切鑒定，然后堿法提取質粒。
(2)表達載體的構建將(l)中提取的質粒用Hind ni/BamHI酶切，回收啟動子片段，然后與 pBI121載體的BamH I /HindlII雙酶切大片段回收產物進行連接反應，轉化大腸桿菌Topl0; 從含卡那霉素50ng/mL的LB平板上挑取單菌落進行酶切鑒定，并提取質粒。 (3將實施例3中構建由ACC合酶基因上游調控序列啟動的GUS基因植物表達載體采用凍融 法轉入農桿菌EH105,具體方法參照Cui W等[Rapid， high efficient transformation of foreign腿to Agrobacterium tumefaciens. Chinese Journal of Biotechnology, 1995， 11 (4) :35(T355]。
實施例4
采用農桿菌介導的葉盤法對煙草葉片進行轉化，方法參照李靜等[萵苣高效瞬時表達體系 的建立.園藝學報，2005， 32(5) :885-888]，然后GUS組織化學染色檢測瞬時表達結果，方法參照Jefferson等[Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion systeml Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5 (4) :387 405]，結果如圖4所示，這表明該啟動子 片段能夠調控GUS基因在煙草內進行瞬時表達，具有啟動子活性。序列表
SEQUENCE LISTING
〈110〉大連理工大學
<120〉大豆ACC合酶基因啟動子序列及其應用
<130〉 AppFileReference :
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〈141〉 CurrentFilingDate : 2008-03-28
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<213〉 OrganismName : Glycine max 〈400> PreSequenceString :1
gattacta犯ctttatgt agcgtgtgca -301 caaagtctat tctctttctc ccattgggtt gacaaaaata ttacgagtgg catcttgcta -241 gctctcacta gggLC犯ttat ttctaattaa tagtgggtcc tgtctgcgta ccaactactg -181 cctaattttc a犯cctaaga agcataatag ctgatgttga actcttctct ccttcgtggg -121 aaccttcatt ttatttggac taaagatatt cctctctctg aaggtcaagg tgaatttgtg -61 cactacatgc tata犯taag cacccctctc ggtgttgttg ttcattgcta gacact犯ac -l atttcctccg taaattattc atagcatatt tcaaaccaca ctcaaaaggc ttccctccct 60 gacttggatt tgattgattt cattacattg ctacactata ttctttttat "tggtgaattg 120 ctatttgcta cactacattt taaggacaat tatacataga ctatatgggg ttgatggctg 180 cgaaccaaac tcaattgttg tctaagatgg ccatcggaga tggacatggt gaagcatccc 240 caatc 24權利要求
1、一種大豆基因啟動子序列，其特征在于，包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)與(1)所述的核酸序列互補的核酸序列；或(3)與(1)或(2)得核酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或(4)可與(1)、(2)或(3)所述核酸序列在雜交條件下雜交，并具有相同功能的核酸序列。
2、 根據權利要求l所述的一種大豆基因啟動子序列，其特征在于，含有核苷酸序列的基因表 達載體。
3、 根據權利要求l所述的一種大豆基因啟動子序列，其特征在于，含有核苷酸序列的轉基因 細胞、組織或個體。
4、 根據權利要求l所述的一種大豆基因啟動子序列，其特征在于，在培育轉基因植物中的應 用。
全文摘要
本發明提供一種大豆ACC合酶基因啟動子序列及其應用。本發明所提供的啟動子具備以下序列特征1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或2)具有與1)所述序列互補的核酸序列；或3)具有與1)或2)基本序列同源性，并具有相同功能的核酸序列；或4)具有可與上述序列雜交的核酸序列。本發明提供的啟動子可作為植物基因工程操作的工具啟動子，廣泛用于植物基因表達調控研究和培育具有較高生物安全性的轉基因植物。
文檔編號C12N15/11GK101413000SQ20081001100
公開日2009年4月22日 申請日期2008年4月11日 優先權日2008年4月11日
發明者安利佳, 君 楊, 燚 趙 申請人:大連理工大學