專利名稱：：一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法及其專用載體的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，特別涉及一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法及其專用載體。
背景技術：
：超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,簡稱SOD)廣泛存在于各類生物體中，是機體內超氧陰離子自由基(02—)的天然消除劑，對機體細胞起保護作用。因此，SOD在防御02—的毒性、抗衰老以及預防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用，受到國內外醫藥日用化工、食品及生化界的極大關注。根據SOD所含金屬輔基的不同，一般可將其分為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類型。SOD在臨床上有較廣泛的應用，如用于骨關節炎、急肝與慢活肝的炎癥反應，SOD可去除由炎癥反應產生的大量的超氧化自由基，對消退炎癥，恢復肝功能起到一定作用；用于治療因超氧陰離子傷害引起的疾病，如心肌缺血與缺血再灌注綜合癥、類風濕關節炎、放射性膀胱炎、紅斑狼瘡等(FattmanCL，EnghildJJ,CrapoJD，Wa/.Purificationandcharacterizationofextracellularsuperoxidedismutaseinmouselung.B/oc/ze/wCo附mww,2000,275:542—548;HuangP,FengL,OldhamEA，a/.Superoxidedismutaseasatargetfortheselectivekillingofcancer.iVam"，2000，407(6802):390-395;賈寧人，王麗珠等.化學發光法測定超氧化物歧化酶.臨床檢驗雜志，1996,14(2):59-62)。SOD在食品工業中主要應用四方面1)作為保健食品的功效因子或食品營養強化劑，添加到各種食品中。2)制成多種劑型的SOD或復合型食品。3)用作食品的天然抗氧化劑。4)以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妝品中可起到防曬、防止脂褐素的形成、防治皮膚病以及防治瘢痕形成等作用(崔慧斐，張天民.超氧化物歧化酶在食品和化妝品中的應用及其發酵法生產進展.藥物生物技術,2000,7(3):187-189)。超氧化物歧化酶SOD作為自由基清除劑，是一種可以增進人體健康的重要活性物質，我國自上世紀八十年代以來，對SOD的應用研究主要側重于動植物SOD的提取和純化，國內SOD產品大部分是從動物血液中制備的，但由于原材料有限及衛生安全性等原因，導致制品產量有限，特別是隨著世界各地瘋牛病、禽流感、口蹄疫等惡性傳染病的不時報道，動物源血液制品的風險加大，純度要求的增高也增加了產品的成本，特別是由于瘋牛病的影響，歐盟規定從1997年1月起，禁止使用牛血SOD作為食品添加劑使用后，利用基因工程是廣開SOD酶源、降低成本和獲得具有天然活性的SOD的有效途徑。釀酒酵母(Sacc/zaraw;;cesce"Ww'ae)，又名面包酵母，在釀酒業和面包業中的使用已有數千年的歷史，被認為是GRAS生物(generallyrecognizedassafe)，已被美國FDA認定為安全性的生物，其表達產物不需經過大量宿主安全性實驗(宋麗雅，于群，卜鳳榮.幾種主要的酵母表達系統研究進展.中國輸血雜志,2003,16(3):209-211)。釀酒酵母作為一種模式生物，是迄今了解最完全的真核生物，上千個基因已被分析，完整的基因組測序已于1996年完成。自1981年Hitzeman等用釀酒酵母表達人干擾素獲得成功后，人們還用釀酒酵母表達了多種原核和真核蛋白。釀酒酵母表達系統相比畢赤酵母等表達系統具有其自身表達量較低等的不足，但是，它卻具有其它表達系統不能比擬的優點。作為酵母的一種，其培養條件普通，生長繁殖迅速；用于表達基因工程產品時，工藝簡單，能夠耐受較高的流體靜壓，可以大規模生產，有效降低生產成本；作為一種GRAS生物，它已廣泛用于釀酒和食品工業，不會產生毒素，安全可靠；作為單細胞真核生物，它表達外源基因時具有一定的翻譯后加工能力，具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，有利于保持生物產品的活性和穩定性；作為一種模式生物，它的遺傳背景清楚，容易進行遺傳操作，可以利用基因表達調控機制進行高水平表達。目前大量表達蛋白最常使用的表達系統是畢赤酵母表達系統，雖然它能進行高密度發酵表達，發酵過程簡單，成本也較低廉。但由于畢赤酵母不是一種食品微生物，表達過程產生的物質不能完全確認安全；其常用的分泌型載體pPICZalphaA又含有Zeocinr抗性基因，在篩選過程中必須添加高濃度抗生素來篩選高拷貝重組子；載體含目前己知畢赤酵母中的最強啟動子A0X1，故發酵時需要添加甲醇誘導，所以畢赤酵母表達系統完全不符合食品級安全要求，要用它來生產藥品或食品需要進行多步驟的后續加工，還沒有被廣泛接受。
發明內容為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的首要目的在于提供一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法。本發明的另一目的在于提供上述食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體。本發明的目的通過下述技術方案來實現一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，包括如下步驟首先，超氧化物歧化酶基因插入釀酒酵母表達載體的多克隆位點處后，構建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達載體，通過限制性內切酶A^I和^戸LI雙酶切該表達載體，完全去除Ampicimr^抗生素篩選標志，同時切去了URA3基因片段的部分片段；然后，將被酶切去除的URA3片段部分重新與含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達載體連接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動子和終止子序列、多克隆位點、URA3片段以及不含有Ampidllii/抗生素篩選標志的食品級釀酒酵母表達載體即食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體，將改造好的釀酒酵母食品級表達載體導入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，包括如下步驟(1)選定中國擬青霉CPfle"7omyc")Cu,Zn-SOD(簡寫為psSOD)基因mRNA全長序列，進行全基因合成，psSOD基因mRNA全長序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)設計并合成一對基因特異引物pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列為如下pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3';pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，。以步驟(1)得到的含psSOD基因片段的質粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進行PCR擴增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了/^mnn和laI酶切位點(恰為多克隆位點兩端酶切位點)；得到的基因片段與pMD18-T載體連接，命名為pMD18-T-psSOD質粒，經測序與上述mRNA全長序列相符。(3)用限制性內切酶i^"JIII和laI雙酶切釀酒酵母表達載體pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD質粒，得到雙酶切載體與目的基因純化液；將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進行連接，得到的重組載體命名為pYES-psSOD。(4)上述構建的重組載體pYES-psSOD通過J/^LI和7VcoI雙酶切，去除Ampr抗性基因即Ampicillir^抗生素篩選標志，同時切去了Ampf抗性基因下游URA3基因片段的部分片段，把被酶切去除的URA3基因片段部分重新與pYES-psSOD重組載體連接。根據釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體的序列，設計上下游引物ura2和ura3，以擴增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端(即載體第2823bp端)引入^^LI酶切位點所述ura2:5,-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3,;所述扁3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3，;以pYES2/CT質粒為模板，ura2、ura3為引物進行PCR擴增，回收目的片段URA3后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，重組質粒命名為pMD18-T-ura，所述URA3片段序列為如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatectgttg3ccc3atgcgtctcccttgtc3tcte犯ccc3c紅gggtgtcat犯tc犯cc犯tcgt犯ccttc3tctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg;(5)將已經構建好的釀酒酵母重組表達載體pYES-psSOD及pMD18-T-ura重組質粒，用J/aLI禾PiVcoI進行雙酶切，分別回收純化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp大小片段；將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp大小片段以T4DNA連接酶連接，重組質粒命名為pYES-psSOD-F，即為食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體。(6)將上述的食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。所述釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體，它采用GAL1啟動子，可以以食品級的誘導物半乳糖啟動目的基因的表達；其上的URA3片段，與酵母宿主菌株上wra3-7互補，利用營養缺陷型，達到篩選目的，是食品級的選擇標記；因此，通過改造去除Ampicillir/抗生素篩選標記后的pYES2/CT載體為最優選的釀酒酵母食品級表達載體。步驟(6)中，所述的釀酒酵母為"ra3-7基因突變型的釀酒酵母，可通過尿嘧啶營養缺乏培養基篩選重組酵母。所述將食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導入釀酒酵母中的優選方法為氯化鋰化學轉化法，也可以采用其它生物工程領域中常用的方法，例如電激轉化法等。所述篩選獲得重組釀酒酵母的方法為涂布尿嘧啶營養缺乏培養基。所述誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達時需加入半乳糖，半乳糖誘導濃度為2%(m/v)，誘導時間為4896小時。本發明所提供的超氧化物歧化酶基因的食品級表達的方法，是構建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達載體，對重組載體進行食品級改造，將改造好的釀酒酵母食品級表達載體導入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。所述的食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體，是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動子和終止子序列、多克隆位點、URA3片段以及不含有AmpidllinR抗生素篩選標志的釀酒酵母表達載體。所述超氧化物歧化酶基因位于釀酒酵母表達載體的多克隆位點的III和^&al限制性內切酶酶切位點之間。所述超氧化物歧化酶基因可為任意一種超氧化物歧化酶基因，包括Cu，Zn-SOD、Mn-SOD或Fe-SOD。本發明采用了食品級基因表達系統，其必須具備以下要求(1)食品級宿主菌在食品工業中得到長期而廣泛應用的菌株；(2)食品級載體不得含有非食品級功能性DNA片段；(3)食品級選擇標記不能選用可能會引起抗性基因在物種間的水平轉移，對生物安全性有潛在的危險的抗生素抗性基因作為選擇標記；(4)食品級誘導物，誘導物必須選用可食用的物質。本發明對現有的釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體進行了改造，去除了含有抗性基因的Ampr片段即Ampicillii/抗生素篩選標記，但保留了URA3基因，構建了食品級載體；選用的釀酒酵母表達載體pYES2/CT上的URA3片段，與酵母宿主菌株上wro5-7互補，利用尿嘧啶營養缺陷型，達到篩選目的，是食品級的選擇標記，不必加入抗生素；pYES2/CT載體采用啟動子GALl，以可食用的半乳糖啟動目的基因的表達，是食品級的誘導物。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明所提供的超氧化物歧化酶基因在釀酒酵母中的食品級表達方法，能直接表達出食品級的超氧化物歧化酶產物，彌補了傳統SOD制備方法以及畢赤酵母和原核表達系統表達方式的表達產物需經復雜步驟純化后才能用于食品生產中的不足；若將本發明應用于工業化SOD生產，產物可不經過傳統的純化工藝而直接應用于食品、保健品及化妝品等領域，也可直接用于食品發酵，用以生產功能食品。此外，本發明還具有原料生物體生長周期短，生產規模大，成本低廉的優點，具有重要的工業應用前景和實際意義。圖1為釀酒酵母表達載體pYES2/CT圖譜。圖2為psSOD的PCR擴增結果圖。其中，M:DL2000,hpsSOD擴增片段。圖3為pYES-psSOD轉化子的菌落PCR鑒定圖。其中，Ml:MarkerIII;M2:DL2000;1、2:pYES2/CT菌落PCR產物;3、4:pYES-psSOD菌落PCR產物。圖4為pYES-psSOD載體的食品級改造流程圖。圖5為pYES-psSOD和pMD18-T-ura的雙酶切"paLWcoI)結果圖。其中，Ml:MarkerIII;M2:DL2000;1:pYES2/CT(JpaL1/7VcoI);24:pYES-psSOD(々aLI/7VcoI);5:pMD18-T-um(—LI/7Vco1)。圖6為w303-pYES-psSOD-F轉化子的菌落PCR鑒定圖。其中，M:DL2000;18:w303-pYES2/CT菌落PCR產物;9~12:w303-pYES-psSOD-F菌落PCR產物。圖7為w303-pYES-psSOD-F表達產物破壁液的SDS-PAGE分析圖。其中，M:蛋白質分子量標準；1:陰性對照；2:w303-pYES-psSOD-F誘導24h菌體破壁液；3:誘導48h菌體破壁液；4:誘導72h菌體破壁液；5:誘導96h菌體破壁液。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1中國擬青霉Cu,Zn-SOD在釀酒酵母中的食品級表達方法1、中國擬青霉Cu，Zn-SOD基因片段的獲得1)基因合成從GenBank中找到冬蟲夏草無性型中國擬青霉(尸aecz7omyc^w'"era&)的Cu，Zn-SOD基因mRNA全長序列(GenBank登陸號為AY438328)，進行全基因合成，基因CDS全長為465bp。其序列為如下Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaacta2)引物設計根據中國擬青霉Cu,Zn-SOD基因mRNA序列設計上下游引物pYESpsSOD(f+r)，通過引物在psSOD基因兩端分別加入歷"dIII和I酶切位點11pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3';pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，。3)PCR擴增以步驟l)合成的含psSOD基因的質粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進行PCR擴增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了III和11酶切位點。將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果如圖2所示，PCR擴增體系如下上游引物(10pM)1W下游引物(10|aM)1WexTaqDNA聚合酶0.5pl10xPCRBuffer2.5(ildNTP(2.5mMeach)2^tl模板DNA0.5piddH2017.5^Total25pi熱循環儀加熱蓋，94。C4min，然后94°C30sec，55°C30sec，72°C40sec，30個循環；接著72。C8min，擴增完畢后置4。C終止反應，得到的片段大小接近500bp，與預期大小約480bp相符。將目標條帶割膠回收后，與pMD18-T載體連接，經轉化及轉化子的篩選鑒定、序列測定分析后，得到含正確的psSOD基因序列的質粒，命名為pMD18-T-psSOD。2、重組表達載體pYES-psSOD的構建1)目的片段和載體的雙酶切用限制性內切酶///"dIII和laI雙酶切37°C6h釀酒酵母表達載體pYES2/CT及鑒定過的上述pMD18-T-psSOD質粒，得到雙酶切載體與目的基因純化液。2)載體與目的片段的體外連接將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進行連接，得到的重組質粒命名為pYES-psSOD。3)連接產物的轉化將重組質粒pYES-psSOD用熱激法轉化進入大腸桿菌DH5a感受態細胞中，用含有100pg/mLAmp的LB平板37匸培養12小時進行篩選。4)轉化子的篩選鑒定根據釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體序列(見圖1)，設計pYES2/CT載體的測序引物pYEStest(f+r)，上下游引物分別位于其多克隆位點(見圖1)上下游，由廣州英駿生物技術有限公司合成。引物序列為pYEStestf:5，-AATATACCTCTATACTTTAACGTC-3';pYEStestr:5，-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3，。用無菌牙簽挑取在Amp平板上長出的DH5a單菌落于lmlLB(Amp+)培養基，30°C250rpm過夜培養。用上述菌液作模板，以pYEStest(f+r)為引物，進行菌落PCR。PCR擴增體系同psSOD擴增，熱循環儀加熱蓋，94匸預變性10min，94°C40sec，55。C40sec，72°C40sec，30個循環后，72°C10min，擴增完畢后置4。C終止反應。反應結束后，取反應液進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，pYES2/CT空載體和pYES-psSOD的轉化子菌落PCR產物理論上應有223bp和609bp條帶，結果如圖3所示，轉化子PCR擴增時，能得到約600bp大小的片段，初步說明目的片段已與載體連接。5)序列測定與分析把經菌落PCR鑒定的陽性克隆進行序列測定與分析，得到含正確psSOD基因的pYES-psSOD重組載體。3、食品級重組表達載體pYES-psSOD-F的構建根據圖4進行pYES-psSOD載體的改造。構建好的釀酒酵母重組表達載體pYES-psSOD上，帶有Ampr抗性基因，不符合食品級的要求，根據pYES2/CT載體的序列可知，其Amp「抗性基因位于19632823bp，而J;aLI酶切位點有兩個，分別位于1458bp和2704bp處，通過JpaLI酶切可去除Ampr抗性基因的絕大部分片斷；而在Ampr抗性基因下游URA3基因中有iVcoI酶切位點，通過J/^LI和7VcoI雙酶切，可以完全去除Ampr抗性基因，達到防止抗性基因在物種水平間遷移的目的。但同時切去了Ampr抗性基因下游URA3基因片段的一部分，而由于URA3基因是重組表達載體在釀酒酵母中篩選所需的，因此必須把被酶切去除的URA3基因片段的一部分(即載體上28233513bp片段)重新與載體連接。所述URA3片段序列為如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg。1)載體補充片段(um)的獲得根據釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體的序列，設計上下游引物ura2和ura3，以擴增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端(載體第2823bp端)引入^^LI酶切位點腦2:5，隱GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3'ura3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3'以pYES2/CT質粒為模板，ura2、ura3為引物進行PCR擴增，擴增條件同psSOD擴增。割膠回收目的片段后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，進行轉化及轉化子的篩選鑒定、序列測定分析。重組質粒命名為pMD18-T-ura。2)pMD18-T-ura和pYES-psSOD的雙酶切取已經構建好的釀酒酵母重組表達載體pYES2-psS0D及鑒定過的pMD18-T-ura重組質粒，用JpaLI和iVcoI進行雙酶切，反應結束后，酶切產物用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳。pMD18-T-ura經JpaLI禾QiVcoI雙酶切后，所得片段(ura)大小約為700bp;pYES2/CT載體經相同雙酶切后，所得為一個大片段約4294bp和兩個分別為1246bp和809bp的小片段；pYES-psSOD產生的大片段為5103bp，電泳結果與此相符，如圖5所示。分別回收pYES2/CT和pYES-psSOD酶切后的大片段及pMD18-T-ura的700bp片段，用于下一步連接反應。3)重新連接表達載體將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp片段以T4DNA連接酶連接，重組質粒命名為pYES-psSOD-F。該載體是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動子和終止子序列、多克隆位點、完整URA3片段以及不含有AmpicillinK抗生素篩選標志的食品級釀酒酵母表達載體。4)重組表達載體pYES-psSOD-F的食品級鑒定把連接好的食品級載體pYES-psSOD-F轉化大腸桿菌DH5cc中(同時做pYES2/CT空載體轉化為對照)，轉化后取200|il菌液涂布于含有Amp(100嗎/mL)的LB平板上，37"C倒置培養16h后pYES2/CT長出轉化子，而pYES-psSOD-F在37。C培養72h后仍沒有轉化子長出，說明Ampf抗性基因已失效，不存在抗生素抗性基因在物種水平間遷移的危險，達到食品級的要求。4、psSOD在釀酒酵母中食品級表達菌株釀酒酵母w303-lA由中山大學生命科學學院微生物實驗室提供，基因型為(MATa,ura3畫l，leu2-3-112，trpl畫l,his3-11,ade2畫l，canl畫100)。YPD培養基稱取蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖20g，加ddH20定容至1L，高壓滅菌，4"C保存。缺乏脲嘧啶的氨基酸營養缺陷混合物(drop-outmix)組成每升溶液加入以下固體，過濾除菌。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>液體選擇培養基200ml營養缺陷混合物(drop-outmix)，100ml20。/。葡萄糖，100ml6.7%YNB(過濾除菌)，加滅菌ddH20到lOOOml。固體選擇培養基600mLddH20中加入瓊脂粉20g，高壓滅菌后冷卻至60°C，加入200mldrop-outmix,100ml20%葡萄糖，100ml6.7%YNB(過濾除菌)。選擇誘導培養基在選擇培養基的基礎上，20%葡萄糖換成20%半乳糖。1)釀酒酵母感受態細胞的制備及化學轉化(1)挑取釀酒酵母w303-lA單菌落接種至3mL液體YPD，30。C下振蕩培養過夜；(2)測定過夜培養物OD6。。，計算菌體密度(lOD=107cells/ml);(3)以YPD培養液將酵母密度稀釋至5xl06cells/ml，置3(TC，250r/min振蕩培養至菌體密度達2xl07cells/ml(約34h);(4)用10ml無菌離心管以4,000rpm離心3min，收集細胞，每5ml菌液細胞集于1管。(5)把細胞重新懸浮在500pl無菌水中，并將重懸液轉移到1.5ml離心管中，13,000rpm離心12sec;(6)棄上清，把細胞重懸于200)il的0.1mol/L醋酸鋰(LiAc)中，30°C溫浴15min，每5min輕輕振搖一次；(7)準備轉化混合液，在離心管中小心加入5plCarrierDNA(鮭魚精10mg/mL)、45|ilddH20，混合后煮沸8-10min，然后加入36|il1mol/LLiAc禾口24jil10xTE。(8)將溫浴產物13,000rpm離心12sec，棄上清后加入240^140%PEG-3350、110pl轉化混合液和5(ilpYES-psSOD-F質粒(同時轉化pYES2/CT空載體做對照)；震蕩混勻后25'C溫浴30min;(9)加入40iiLDMSO(對酵母細胞有毒害作用，加入后迅速混勻)；(10)42。C水浴熱激18min;(11)熱激完畢后取出置冰上lmin，13，000rpm離心15sec棄上清，收集菌體；(12)以100200plddH20重懸菌體，取100(il菌液涂布Ur&選擇培養基平板，30。C靜置約3060min，待液體全部吸收后，倒置培養23天。將重組酵母命名為w303-pYES-psSOD-F。2)重組酵母的菌落PCR鑒定w303-lA菌株是尿嘧啶URA營養缺陷型，選擇培養基同樣是尿嘧啶缺失，因此理論上只有pYES載體上的URA3序列與宿主菌的ura3-l互補后才能在選擇培養基中長出。用滅菌牙簽挑取上述轉化后長出的w303-lA單菌落于10|ilddH2O中，沸水浴10min后作為模板，以pYEStest(f+r)為引物進行菌落。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，理論上，w303-pYES2/CT空載體轉化子菌落PCR產物應有223bp條帶，w303-pYES-psSOD-F重組轉化子則有約609bp的條帶，實驗結果如圖6所示，挑取的轉化子條帶與目標相符，可初步斷定為重組轉化子。3)重組酵母的誘導表達pYES系列載體是GALl啟動子，葡萄糖可抑制其轉錄開始(West"a/.,1984)，半乳糖誘導其轉錄開始(Giniger^"/"簡)。(1)挑取經鑒定的w303-pYES-ps-SOD-F單菌落至15mlw303-lA選擇培養基(含2%葡萄糖)，3(TC下250rpm振蕩培養過夜；(2)測定過夜培養物OD6Q。，根據公式計算稀釋至50mlOD6。。二0.4時所需要的培養液數量。例如0D,測定后為3，則所需要的培養液為50ml*0.4OD/30D=6.67ml。(3)取出所需數量培養液，1，500g離心5min收集菌體；(4)以50ml選擇誘導培養基(含2。/^半乳糖)重懸菌體，30。C250rpm培養；(5)在24h、48h、72h、96h分別取樣5ml。4)重組酵母表達產物的鑒定玻璃珠法破碎重組酵母細胞所用溶液BreakingBuffer:10mM磷酸鈉，lmMEDTA，0.1%TritonX-100，pH7.8。鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力所用Buffer:BufferA:lOOmMTris-HCl緩沖液；BufferB:2mMDTPA;BufferC:BufferA與BufferB按體積比1:1混合，調至pH8.2;BufferD:10mMHC1，將36%HC11ml溶于116mlddH20;BufferE:20mM鄰苯三酚(lOOx，以BufferD溶解)避光放置。Bradford蛋白質濃度測定法所用溶液考馬斯亮蘭G-250染料試劑稱lOOmg考馬斯亮蘭G-250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，用水稀釋至l升，濾紙過濾，4。C保存于棕色瓶中；標準蛋白質溶液用牛血清清蛋白(BSA)配制成0.5mg/ml的標準蛋白質溶液，室溫穩定2小時。5)重組酵母的破壁檢測以玻璃珠法進行釀酒酵母細胞的破壁處理A、根據菌液OD6(M)值計算其菌體密度OOD=107cells/ml)，取出含10xlO、ells的菌液，同時記錄所取用的菌液體積，作后續酶活力的換算使用；①1，500g，4。C離心5min棄上清，收集細胞；②加入500^1ddH20重懸菌體，轉移至1.5mL無菌離心管，以最大轉速離心30sec，棄上清，收集細胞；③加入500piBreakingbuffer重懸菌體，l,500g，4。C離心5min棄上清，收集細胞；加入200jilBreakingbuffer重懸菌體；(D加入等體積酸洗玻璃珠；⑥渦旋振蕩30sec后，馬上置于冰上30sec，重復10次；⑦以最高轉速(約12,00013，000g)離心10min，將上清轉移到新EP管，上清液即為酵母破壁液。B、破壁液的SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測取誘導表達24h、48h、72h、96h各時間段樣品的破壁液2(Vl，加入20^12x上樣緩沖液，沸水煮5分鐘，離心后取上清進行SDS-PAGE電泳。每孔點樣15)il。采用不連續體系，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%。以半乳糖誘導w303-pYES-psSOD-F重組菌，對經誘導的重組釀酒酵母細胞進行破壁處理后，以破壁液進行SDS-PAGE電泳，同時用空載體pYES2/CT轉化的宿主菌的破壁液作空白對照。SDS-PAGE電泳結果如圖7顯示，從48h開始，出現一條約21kDa的蛋白條帶(箭頭所示處)，應為psSOD蛋白，此psSOD的表觀分子量稍大于其16kDa的理論分子質量，這一點與相關文獻報道的相同(YooHY,KimSS，RhoHM.OverexpressionandsimplepurificationofhumanSODinyeastanditsresistancetooxidativestress.■/S/ofec/z"o/,1999，68(l):29-35;何煒，袁漢英，高卜渝，陳向嶺，李育陽.超氧化物歧化酶在釀酒酵母系統中的高效表達.復旦學報(自然科學版),2004,43(2):156-162;李雪蓮，馬一君，武峰，史兆興，王恒梁，黃留玉.人銅鋅超氧化物歧化酶真核表達載體的構建及其在釀酒酵母中的分泌表達.鄭州大學學報(醫學版)，2007,42(1):127-130)。C、破壁液的SOD酶活力檢測采用鄰苯三酚自氧化法進行破壁液的SOD酶活力的測定。①溶液體系按照以下配方混合溶液:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>②標準曲線制定首先測定鄰苯三酚自氧化速率，取反應體系所需各種溶液，分別置于25士0.5"C水浴下預熱20min，然后迅速混合，振蕩混勻，以空白為對照測定OD42。，每間隔0.5min記錄一次讀數，連續記錄3min。描繪自氧化速率標準曲線。③破壁液SOD酶活力測定同上述流程，通過調節表達上清濃度，每0.5min記錄一次OD42。，描繪SOD抑制自氧化速率曲線圖，控制氧化速率在為鄰苯三酚自氧化的50%左右。④破壁液濃度測定利用Bradford法測定表達上清的蛋白濃度，方法如下a.制作標準曲線__123456780.5mg/mlBSA0051015202530.15mMNaCl100100959085807570按上表中數量混合溶液，然后各試管中分別加入lml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即混合(注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除)。加完試劑2min后，測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1號試管，以蛋白濃度和光吸收作標準曲線。b.樣品測定把待測樣品稀釋至10-100嗎/ml的濃度，取100|il樣品稀釋液加入lml考馬斯亮藍，后續步驟同上。測得A595值后在標準曲線上找出相應濃度。結果計算酶活力單位的定義在lml反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個酶活力單位。酶活力單位計算公式如下SOD活力(U/ml)=~"50%hA0—鄰苯三酚自氧化速率；A廣SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率；N—樣品測定前稀釋倍數；V。-反應液總體積(4.5ml);V,--加入的SOD溶液體積(O.lml)。首先測定破壁液的SOD酶活力(U/ml);通過已知的各樣品每200|il破壁液對應的發酵液體積，計算每ml發酵液的酶活力；然后利用Bradford法測定破壁液中的蛋白濃度，并通過微機掃描分析目標表達蛋白表達量占菌體可溶性蛋白的百分比，從而計算每毫克psSOD蛋白的SOD酶活力(U/mg):半乳糖誘導48小時、72小時和96小時后，表達產物蛋白的SOD酶活力分別為789.48、1320.28和1158.33U/mg。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>中山大學<120〉一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法及其專用載體<130>42<160>6<170>Patentlnversion3.2<210>1<211〉465<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>psSOD基因mRNA全長序列<400>1atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaatttt60gagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgcc120gacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctct180gctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccga240cacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccata300aaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcatt360cacgccggcactgatgacctaggca鄉gtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaat420gctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa465<210>2<211>27<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>pYESpsSODf正向引物<400>2atcaagcttatggtcaaagcagtttgc2721<210>3<211〉28<212>DNA<213〉Artificialsequence<220〉<223>pYESpsSODr反向引物<400>3acctctagattagttggcgacgccaatg28<210>4<211>26<212>DNA<213〉Artificialsequence<220><223〉引物ura2<400>4gaaggatccccatggagggcacagtt26<210>5<211>29<212>DNA<213〉Artificialsequence<220><223>引物ura3<400>5gccaagcttgtgcacactcttcctttttc29<210>6<211〉700<212>DNA<213>Artificialsequence<220>〈223>URA3片段序列<400>6gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatt60tgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcat120cttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcc180cttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccaca240tcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccg300ggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaata360aagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattct420ccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcc480tttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccg540tgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaat600ttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttg660gcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg700權利要求1、一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于包括如下步驟首先，超氧化物歧化酶基因插入釀酒酵母表達載體的多克隆位點處后，構建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達載體，通過限制性內切酶NcoI和ApaLI雙酶切該表達載體，完全去除AmpicillinR抗生素篩選標志，同時切去了URA3基因片段的部分片段；然后，將被酶切去除的URA3片段重新與含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達載體連接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動子和終止子序列、多克隆位點、URA3片段以及不含有AmpicillinR抗生素篩選標志的食品級釀酒酵母表達載體即食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體；將改造好的釀酒酵母食品級表達載體導入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。2、根據權利要求l所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于包括如下歩驟(1)將中國擬青霉Cu,Zn-SOD即psSOD基因mRNA全長序列，進行全基因合成，所述psSOD基因mRNA全長序列如下Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgccc3cc3ccatctcctggg3gatctct犯cc3cgatgccgacgcc^gcgtggcttcc3C3tc3C3Ccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa;(2)設計并合成一對基因特異引物pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列為如下pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3，;pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，;以步驟(1)得到的含psSOD基因片段的質粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進行PCR擴增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了III和laI酶切位點；得到的基因片段psSOD與pMD18-T載體連接，命名為pMD18-T-psSOD質粒，經測序與上述mRNA全長序列相符；(3)用限制性內切酶III和1"I雙酶切釀酒酵母表達載體pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD質粒，分別得到雙酶切載體與目的基因純化液；將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進行連接，得到的重組載體命名為pYES-psSOD;(4)根據釀酒酵母表達載體pYES2/CT載體的序列，設計上下游引物ura2和ura3，以擴增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端即載體第2823bp端引入^aLl酶切位點所述ura2:5，-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3';所述ura3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3，;以釀酒酵母表達載體pYES2/CT質粒為模板，ura2、ura3為引物進行PCR擴增，回收目的片段URA3后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，重組質粒命名為pMD18-T-ura，所述URA3片段序列如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg;(5)將已經構建好的釀酒酵母重組表達載體pYES-psSOD及pMD18-T-ura重組質粒，用JpaLI和WcoI進行雙酶切，分別回收純化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp片段；將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp片段以T4DNA連接酶連接，重組質粒命名為pYES-psSOD-F，即為食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體；(6)將上述的食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。3、根據權利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于步驟(6)中，所述的釀酒酵母為wra3-7基因突變型的釀酒酵母。4、根據權利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于步驟(6)中，所述將食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體導入釀酒酵母中的方法為氯化鋰化學轉化法或電激轉化法。5、根據權利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于步驟(6)中，所述篩選獲得重組釀酒酵母的方法為涂布尿嘧啶營養缺乏培養基。6、根據權利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法，其特征在于步驟(6)中，所述誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達時需加入半乳糖，半乳糖誘導濃度為2%，誘導時間為4896小時。7、用于權利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法的食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體，其特征在于所述食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動子和終止子序列、多克隆位點、URA3片段以及不含有Ampidllir^抗生素篩選標志的釀酒酵母表達載體。8、根據權利要求7所述的用于超氧化物歧化酶基因的食品級表達方法的食品級表達超氧化物歧化酶基因的專用載體，其特征在于所述超氧化物歧化酶基因位于釀酒酵母表達載體的多克隆位點的Hind111和XbaI限制性內切酶酶切位點之間。全文摘要本發明公開了一種超氧化物歧化酶基因食品級表達方法及其專用載體。該方法是構建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母食品級表達載體，將構建的釀酒酵母食品級表達載體導入釀酒酵母中，獲得重組釀酒酵母，誘導重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達。本發明能直接表達出食品級的超氧化物歧化酶產物，彌補了傳統SOD制備方法以及畢赤酵母和原核表達系統表達方式的表達產物需經復雜步驟純化后才能用于食品生產中的不足；本發明還具有原料生物體生長周期短，生產規模大，提取成本低的優點，具有重要的工業應用前景和實際意義。文檔編號C12N15/53GK101255436SQ200810025998公開日2008年9月3日申請日期2008年1月24日優先權日2008年1月24日發明者張文慶,朱倩婷,趙士煒,黃曉峰申請人:中山大學