專利名稱：變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法
技術領域：
本發明涉及蕨類植物的孢子繁殖方法，具體地說是涉及一種能快速繁殖變異鱗毛蕨 (D 70/7to7;y(L.) Ktunze)的孢子繁殖方法。
背景技術：
變異鱗毛蕨為中型草本植物，在我國熱帶及亞熱帶地區有廣泛分布，其林下土生，通常 高40 80cm，株形美觀，葉色暗綠，四季常青，不但可開發成為具有觀賞價值的觀葉植物， 而且其根莖有清熱止痛的藥效，可以入藥，因此這種蕨類植物具有良好的市場開發價值。但 是目前關于繁殖變異鱗毛蕨的研究極少。

發明內容
本發明的目的在于開發出一種能快速繁殖變異鱗毛蕨的方法。
我們通過將消毒過的變異鱗毛蕨孢子在孢子萌發培養基中進行培養得到片狀原葉體，然 后將原葉體依次在增殖培養基、孢子體誘導培養基、孢子體繼代培養基中進行培養，待長出
孢子葉后轉入孢子體生根培養基中培養，待基部長出細根就可以出瓶移植，全過程只需半年 左右，從而實現了本發明的目的。
本發明的變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步驟
(1) 收集變異鱗毛蕨孢子，先在酒精中浸泡25 30s，然后再在升汞溶液中浸泡7 8min， 消毒后用無菌水漂洗；
(2) 將上述消毒過的變異鱗毛蕨孢子用無菌水配成懸浮液，加入孢子萌發培養基中，在 溫度23 25 °C，光照強度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下培養，先萌發出綠色 絲狀體，再發育成片狀原葉體，所述的孢子萌發培養基是每升含6 8g瓊脂，18 22g蔗糖， 其余為MS或1/2MS， pH 5. 7 5. 8的培養基；
(3) 將上述片狀原葉體轉接到增殖培養基中，在溫度23 25"C，光照強度2000 2500 lx， 光照時間11 13h/d條件下，培養25 35d后，轉入孢子體誘導培養基中，在溫度23 25T， 光照強度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養至原葉體出芽后轉入孢子體繼 代培養基，在溫度23 25X，光照強度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養 至形成幼孢子體，長出2 3片幼孢子葉；所述的增殖培養基每升中含有6-芐基嘌呤0. 15 0.25 mg，萘乙酸0. 15 0.25mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為MS， pH 5.7 5.8;所 述的孢子體誘導培養基每升中含有激動素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4 0.6mg，萘乙酸O. 15 0. 25mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為MS， pH 5.7 5.8;所述的孢子體繼代培養基每升中含有萘乙酸0.05 0. 15mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為 MS， pH 5. 7 5. 8;
(4)將上述幼孢子體分株轉接到孢子體生根培養基上，在溫度23 25t，光照強度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養至幼孢子體基部長出褐色帶鱗片的細根時，可 出瓶移栽，煉苗后移栽至pH值為6.3 6.4的土壤基質培養，所述的孢子體生根培養基每升 中含有萘乙酸0.25 0.35mg，活性碳4 6g，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為1/2MS培養 基，pH 5. 7 5. 8。
歩驟(l)中采用的酒精和升汞是植物材料通用的消毒劑， 一般使用濃度酒精為體積分數 75%，升滎為lg/L，最好消毒用無菌水漂洗5次。 歩驟(2)所述的光照的光源可以是日光燈。
步驟(3)所述的片狀原葉體在轉入孢子體誘導培養基后35 45d形成出芽的原葉體，所述 的原葉體在轉入孢子體繼代培養基15 25d形成幼孢子體，長出2 3片幼孢子葉，所述的增 殖培養基，孢子體誘導培養基和孢子體繼代培養基的光照的光源可以是日光燈。
步驟(4)所述的光照的光源可以是日光燈，所述的煉苗時間為3 4d，所述的土壤基質 可以由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到，也可以由塘泥、碎木、腐殖土和細 沙等混合得到。
歩驟(2)、 (3)中所述的MS為國際通用的培養基，其成分和配制方法參看文獻(譚文澄、 戴策剛主編.觀賞植物組織培養技術.北京中國林業出版社1991.);步驟(2)、 (4)中所述 的1/2 MS是將MS中的大量元素濃度減半，而其他成分濃度不變而形成的培養基。
本發明投入少，設備簡單，并有效地縮短了變異鱗毛蕨孢子的繁殖周期，從孢子萌發到 幼孢子體形成僅需110d左右，獲得大量種苗，幼孢子苗成活率可達90%，使變異鱗毛蕨成為 優良的觀葉植物并發揮其藥用價值。
具體實施例方式
以下實施例是對本發明的進一歩說明，但本發明不限于以下實施例。 實施例1:
剪取成熟的孢子葉，將孢子從葉緣小心的刮下，將收集的孢子(約O. lg)用濾紙包好， 在超凈工作臺上用lOmL體積分數75%的酒精浸泡25s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消 毒7min，無菌水漂洗5次，洗凈升汞，最后放在無菌的培養皿中待用。
將MS培養基、6g瓊脂和18g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的MS孢子萌發培養基1L,并將制成 的培養基分裝到150mL或200mL培養瓶中，每瓶約加入培養基約15mL，室溫冷卻后待用。
將無菌孢子用3mL無菌水配成懸浮液，用無菌的移液管取0. 2mL滴加入準備好的培養瓶 中，輕微搖動培養瓶，使孢子均勻分布在孢子萌發培養基上。培養溫度為23 25'C，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。在25 30d時孢子萌發培養基顯 綠，孢子大量萌發出綠色絲狀體。
將6-芐基嘌呤0. 15mg，萘乙酸0. 15mg，瓊脂6g，蔗糖28g和MS配制成pH 5. 7 5. 8 的增殖培養基1L;將激動素6-糠基氨基嘌呤0.4mg，萘乙酸O. 15mg，瓊脂6g，蔗糖28g和 MS配成pH5. 7 5.8孢子體誘導培養基1L;將萘乙酸0.05mg，瓊脂6g，蔗糖28g和MS配成 pH 5. 7 5. 8的孢子體繼代培養基1L。將制成的三種培養基分別加注到150mL或200mL培養 瓶中，每瓶約加入培養基約15mL，室溫冷卻后待用。
孢子萌發后,原葉體在孢子萌發培養基上均生長良好，約30d后發育成片狀結構，將片 狀原葉體轉接到原葉體增殖培養基上，培養溫度為23 25'C，光照強度2000 2500 lx，光 源為日光燈，光照時間11 13h/d。 30d后，原葉體增殖培養基中的原葉體增殖明顯，不僅加 寬伸長顯著，而且原葉體中間及頂端處明顯加厚，此時，將原葉體轉接入孢子體誘導培養基 中，培養溫度為23 25°C，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d， 原葉體頂端不斷加厚，約40d后，原液體頂端誘導出芽，l片原葉體頂端通常有3 4個芽。 將已出芽的原葉體轉入孢子體繼代培養基中繼代培養，培養溫度為23 25°C，光照強度 2000 2500 lx,光源為日光燈，光照時間11 13h/d，原葉體不再增殖加厚，原葉體上的芽 不斷生長，約20d后，芽陸續長出幼孢子葉，大量幼孢子體形成。從孢子萌發到幼孢子體形 成僅需110d左右。
將萘乙酸0.25mg，活性碳4g，瓊脂6g，庶糖28g, 1/2MS培養基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子體生根培養基1L，將制成的培養基分裝到150mL或200mL培養瓶中，每瓶約加入培養基約 15ml，室溫冷卻后待用。
待幼孢子體長出2 3片幼孢子葉時，將其分株轉接到孢子體生根培養基上，每瓶培養 基接種約10株幼孢子體，培養溫度為23 25'C，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈， 光照時間11 13 h/d。經過30d的生長，幼孢子體葉片逐漸長大，幼孢子體基部開始長出纖 細的根，根多而密。待幼孢子體長出3 4片幼孢子葉，基部長出較多褐色帶鱗片的細根時， 可出瓶移栽。將培養瓶從培養室內移植溫室內，置于自然光下敞瓶煉苗3d。移栽時，將幼孢 子體從瓶中取出，小心洗凈根部附著的培養基，移栽至高溫滅菌的混合土壤基質(土壤基質 由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到)，移栽后，注意噴霧保濕。25 35d后， 幼孢子苗成活率達90%。
實施例2:
剪取成熟的孢子葉，將孢子從葉緣小心的刮下，將收集的孢子(約O. lg)用濾紙包好， 在超凈工作臺上用10mL體積分數75。/。的酒精浸泡30s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消毒 8min，無菌水漂洗5次，洗凈升汞，最后放在無菌的培養皿中待用。將1/2MS和8g瓊脂和22g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的1/2MS孢子萌發培養基1L，將制成 的培養基分裝到150mL或200mL培養瓶中，每瓶約加入培養基15mL，室溫冷卻后待用。
將無菌孢子用3mL無菌水配成懸浮液，用無菌的移液管取0. 2mL滴加入準備好的孢子萌 發培養瓶中，輕微搖動培養瓶，使孢子均勻分布在培養基上，培養溫度為23 25'C，光照強 度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。在25 30d時孢子萌發培養基顯 綠，孢子大量萌發出綠色絲狀體。
將6-芐基嘌呤0. 25mg，萘乙酸0. 25mg,瓊脂8g，蔗糖32g和MS配成pH 5. 7 5. 8的 增殖培養基1L;將激動素N6-呋喃甲基腺嘌呤0.6mg，萘乙酸0.25mg，瓊脂8g，蔗糖32g和 MS配成pH5.7 5.8孢子體誘導培養基1L;將萘乙酸O. 15mg，瓊脂8g，蔗糖32g和MS配成 PH 5. 7 5. 8的孢子體繼代培養基1L。將制成的三種培養基分別分裝到150mL或200mL培養 瓶中，每瓶約加入培養基約15mL，室溫冷卻后待用。
孢子萌發后，原葉體在1/2MS孢子萌發培養基上均生長良好，約30d后發育成片狀結構， 將片狀原葉體轉接到原葉體增殖培養基上，培養溫度為23 25'C,光照強度2000 2500 lx， 光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。約30d后原葉體增殖培養基中的原葉體增殖明顯，不 僅加寬伸長顯著，而且原葉體中間及頂端處明顯加厚，此時，將原葉體轉接入孢子體誘導培 養基中，培養溫度為23 25°C ，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13h/d， 原葉體頂端不斷加厚，約40d后原液體頂端誘導出芽，l片原葉體頂端通常有3 4個芽。將 已出芽的原葉體轉入孢子體繼代培養基中繼代培養，培養溫度為23 25'C，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d，原葉體不再增殖加厚，原葉體上的芽不斷 生長，約20d后芽陸續長出幼孢子葉，大量幼孢子體形成。從孢子萌發到幼孢子體形成僅需 110d左右。
將萘乙酸0.35mg，活性碳6g，瓊脂8g，蔗糖32g， 1/2MS培養基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子體生根培養基1L，將制成的培養基加注到150mL或200mL培養瓶中，每瓶約加入培養基 15mL，室溫冷卻后待用。
待幼孢子體長出2 3片幼孢子葉時，將其分株轉接到孢子體生根培養基上，每瓶培養 基接種約10株幼孢子體，培養溫度為23 25'C，光照強度2000 2500 lx，光源為日光燈， 光照時間11 13h/d。經過約30d的生長，幼孢子體葉片逐漸長大，幼孢子體基部開始長出 纖細的根，根多而密。待幼孢子體長出3 4片幼孢子葉，基部長出較多褐色帶鱗片的細根時， 可出瓶移栽。將培養瓶從培養室內移植溫室內，置于自然光下敞瓶煉苗4d。移栽時，將幼孢 子體從瓶中取出，小心洗凈根部附著的培養基，移栽至高溫滅菌的混合土壤基質，移栽后， 注意噴霧保濕。約25 35d后，幼孢子苗成活率達90%。
權利要求
1.一種變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步驟(1)收集變異鱗毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)孢子，先在酒精中浸泡25～30s，然后再在升汞溶液中浸泡7～8min，消毒后用無菌水漂洗；(2)將上述消毒過的變異鱗毛蕨孢子用無菌水配成懸浮液，加入孢子萌發培養基中，在溫度23～25℃，光照強度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下培養，先萌發出綠色絲狀體，再發育成片狀原葉體，所述的孢子萌發培養基是每升含6～8g瓊脂，18～22g蔗糖，其余為MS或1/2MS，pH 5.7～5.8的培養基；(3)將上述片狀原葉體轉接到增殖培養基中，在溫度23～25℃，光照強度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養25～35d后，轉入孢子體誘導培養基中，在溫度23～25℃，光照強度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養至原葉體出芽后轉入孢子體繼代培養基，在溫度23～25℃，光照強度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養至形成幼孢子體，長出2～3片幼孢子葉；所述的增殖培養基每升中含有6-芐基嘌呤0.15～0.25mg，萘乙酸0.15～0.25mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子體誘導培養基每升中含有激動素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4～0.6mg，萘乙酸0.15～0.25mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子體繼代培養基每升中含有萘乙酸0.05～0.15mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；(4)將上述幼孢子體分株轉接到孢子體生根培養基上，在溫度23～25℃，光照強度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養至幼孢子體基部長出褐色帶鱗片的細根時，可出瓶移栽，煉苗后移栽至pH值為6.3～6.4的土壤基質培養，所述的孢子體生根培養基每升中含有萘乙酸0.25～0.35mg，活性碳4～6g，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為1/2MS培養基，pH 5.7～5.8。
2. 根據權利要求1所述的一種變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征是步驟(l)中所述的 酒精為體積分數75%，升汞為lg/L，消毒后用無菌水漂洗5次，步驟(4)所述的煉苗時間為3 4天，所述的土壤基質是由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到或由塘泥、碎木、 腐殖土和細沙混合得到。
全文摘要
本發明涉及一種能快速繁殖變異鱗毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)的孢子繁殖方法，其特征是將消毒過的變異鱗毛蕨孢子在孢子萌發培養基中培養至發育成片狀原葉體，然后將原葉體依次在增殖培養基培養約30天，孢子體誘導培養基中培養約40天，孢子體繼代培養基中培養約20天，待形成幼孢子體，長出2～3片幼孢子葉后轉入孢子體生根培養基中培養約30天，待基部長出褐色帶鱗片的細根就出瓶移植，煉苗后移栽至土壤基質培養。本發明投入少，設備簡單，從孢子萌發到幼孢子體形成僅需110d左右，短的時間內獲得大量變異鱗毛蕨種苗，幼孢子苗成活率可達90％，使變異鱗毛蕨能成為優良的觀葉植物并發揮其藥用價值。
文檔編號C12N5/04GK101297635SQ200810029109
公開日2008年11月5日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者唐源江, 歐陽嬋娟, 王瑞江, 董仕勇 申請人:中國科學院華南植物園