專利名稱：一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程及生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型醫(yī)藥中間體3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C (cephalosporin C， CPC)發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種組份頭孢菌素C (CPC) 、 3-去乙酰基-頭孢菌素C (DCPC) 、 3-去乙酰氧基-頭孢菌素C (DOCPC),其中CPC和DCPC共占98。/q 99.8.。/。。生產(chǎn)過程中通常只提取CPC用于制備頭孢類抗生素關(guān)鍵中間體7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)，而DCPC和DOCPC—般作為有害雜質(zhì)被除去。
為了解決細(xì)菌耐藥性問題，第三代、第四代及更新型的頭孢類抗生素均需要在頭孢環(huán)的第3位和第7位進(jìn)行修飾。7-ACA的3位為乙酰化的酯鍵，由于改造成其它鍘鏈相對(duì)較難，如合成頭孢呋辛、頭孢西丁等產(chǎn)品時(shí)，需先水解除去3位的乙酰基，即先轉(zhuǎn)變?yōu)?-去乙酰基-7-ACA (D-7-ACA)再進(jìn)行3位修飾。
本發(fā)明采用酶法制備了新型醫(yī)藥中間體D-7-ACA。 D-7-ACA中間體可以合成絕大多數(shù)頭孢類抗生素，取代7-ACA中間體是必然的，并且以頭孢菌素C發(fā)酵液為起始物料，可利用的有效成份更多，生產(chǎn)D-7-ACA的摩爾數(shù)更多，等摩爾數(shù)的D-7-ACA比7-ACA成本更低，有利于整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈成本下降。整個(gè)過程均采用用酶法工藝也有利于環(huán)境保護(hù)事業(yè)，是一種可持續(xù)發(fā)展的工藝路線
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型醫(yī)藥中間體3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方法，以顯著降低頭孢類抗生素的合成成本。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
由頭孢菌素C(CPC)和3-去乙酰-頭孢菌素C(DCPC)以任意比例構(gòu)成的混合溶液作為底物溶液，采用D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶和去乙酰基酯酶三種酶通過氧化、酰化、水解催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為D-7-ACA，經(jīng)結(jié)晶、干燥獲得目的產(chǎn)品。所述酶為固定化酶或液態(tài)酶。具體反應(yīng)原理見附圖l、附圖2、附圖3，目標(biāo)產(chǎn)物D-7-ACA的結(jié)構(gòu)式見附圖4。
所述底物溶液為頭孢菌素C發(fā)酵粗提液，也可以是頭孢菌素發(fā)酵液經(jīng)層析分離精制的由有效成份CPC和DCPC組成的混合溶液，其中CPC的重量濃度為0.5% 15% 。
所述三種酶活性濃度為100 15000u/l，其使用方式有以下五種
1) 方法一底物溶液先在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10vvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后再在固定化GL-7-ACA酰化酶和去乙酰酯酶的混合酶催化作用下同時(shí)進(jìn)行酰化和酯水解反應(yīng)，混合酶催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
2) 方法二底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶和去乙酰酯酶的混合酶的催化作用下同時(shí)進(jìn)行氧化反應(yīng)和酯水解反應(yīng)，混合酶的催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10vvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后，再在固定化GL-7-ACA酰化酶的催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
3) 方法三底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10wm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后，在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件均為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C;反應(yīng)完過濾后在固定化去乙酰基酯酶催化作用下進(jìn)行酯水解反應(yīng)，催化反應(yīng)條件均為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
4) 方法四底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 lOvvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后在固定化去乙酰基酯酶催化作用下進(jìn)行酯水解反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C;反應(yīng)完過濾后在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
5) 方法五底物溶液在固定化去乙酰基酯酶催化作用下，進(jìn)行酯水解反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C;反應(yīng)完過濾后在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10vvm，壓力保持0.1 3Mpa;再在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于
1、 本發(fā)明以頭孢菌素c發(fā)酵液為起始物料，可利用的有效成份更多，
生產(chǎn)D-7-ACA的摩爾數(shù)更多，等摩爾數(shù)的D-7-ACA比7-ACA成本更低，有利于整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈成本下降。
2、 本發(fā)明提供了一種新型醫(yī)藥中間體D-7-ACA，與7-ACA相比，有利于在3位進(jìn)行修飾，可合成大多數(shù)新型頭孢類抗生素。
3、 整個(gè)工藝流程均采用酶法工藝，是一種全酶法的生產(chǎn)過程，低能耗且有利于環(huán)境保護(hù)事業(yè)，是一種可持續(xù)發(fā)展的工藝路線。


附圖1:氧化反應(yīng)附圖2:酰化反應(yīng)附圖3:水解反應(yīng)附圖4:目標(biāo)產(chǎn)物D-7-ACA的結(jié)構(gòu)式
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:由CPC發(fā)酵液制備D-7-ACA
取2.5L頭孢菌素C發(fā)酵液(31000u/ml)，濾除菌體，調(diào)節(jié)PH至3.0，樹脂脫色后，采用LX-81樹脂層析分離，醋酸鈉緩沖液脫，收集第一組份DCPC和第三組份CPC，鈉濾濃縮獲得CPC和DCPC混合溶液1000ml，用氨水調(diào)節(jié)PH至7.5備用；
在反應(yīng)器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶72g，用去離子水洗凈，加入上述反應(yīng)液，通入氧氣2vvm，壓力2Mpa，用酸或堿維持PH7.5，保持溫度25°C ，反應(yīng)60min, HPLC分析CPC和DCPC面積百分比0.5%,結(jié)束反應(yīng)，過濾得氧化液。
在反應(yīng)器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶71g和去乙酰酯酶57g，用去離子水洗凈，加入氧化液，用酸或堿維持PH8.5,保持溫度25°C，反應(yīng)65min，至PH不再變化結(jié)束反應(yīng)，HPLC分析D-7-ACA占94%，過濾得到D-7-ACA溶液。
將反應(yīng)液冰浴降溫，用酸調(diào)PH至3.5下，同時(shí)溫度降至5'C，低速攪拌2小時(shí)，過濾收集晶體，用5t丙酮洗滌3遍，4(TC下真空干燥3小時(shí)，獲得16.4gD-7-ACA結(jié)晶粉。
實(shí)施例2:由CPC結(jié)晶粉兩步酶法制備D-7-ACA
稱取40gCPC結(jié)晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，調(diào)節(jié)PH至7.5，配成4%濃度的底物溶液備用。
在反應(yīng)器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶70g，用去離子水洗凈，加入上述反應(yīng)液，通入氧氣4vvm,壓力0.5Mpa，用酸或堿維持PH7.0，保持溫度23。C，反應(yīng)49min， HPLC分析CPC和DCPC面積百分比0.5%，結(jié)束反應(yīng)，過濾得氧化液。
7在反應(yīng)器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶71和去乙酰酯酶51g，用 去離子水洗凈，加入氧化液，用酸或堿維持PH6.5,保持溫度28°C，反應(yīng) 57min，至PH不再變化結(jié)束反應(yīng)，HPLC分析D-7-ACA占96%，過濾得到 D-7-ACA溶液。
將反應(yīng)液冰浴降溫，用酸調(diào)PH至3.5下，同時(shí)溫度降至5。C，低速攪 拌2小時(shí)，過濾收集晶體，用5'C丙酮洗滌3遍，4(TC下真空干燥3小時(shí)， 獲得14.9g D-7-ACA結(jié)晶粉。
實(shí)施例3:由CPC結(jié)晶粉兩步酶法制備D-7-ACA
加固定化D-氨基酸氧化酶與去乙酰酯酶混合催化，進(jìn)行氧化和水解反 應(yīng)，反應(yīng)完成后加GL-7-ACA酰化酶進(jìn)行酰化反應(yīng)，其它條件與上述實(shí)施 例2 —致，獲得14.6 g D-7-ACA結(jié)晶粉。
實(shí)施例4:由CPC結(jié)晶粉三步酶法制備D-7-ACA
稱取50gCPC結(jié)晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，調(diào)節(jié)PH至 6.5，配成5°/。濃度的底物溶液備用。
在反應(yīng)器1中加入固定化D-氨基酸氧化酶70g，用去離子水洗凈，加 入上述反應(yīng)液，通入氧氣lvvm，壓力0.1Mpa，用酸或堿維持7.2,保持溫 度20。C，反應(yīng)59min， HPLC分析CPC和DCPC面積百分比0.5%,結(jié)束反
應(yīng)，過濾得氧化液。
在反應(yīng)器2中加入固定化GL-7-ACA酰化酶72g，用去離子水洗凈，加 入氧化液，用酸或堿維持PH8.0,保持溫度25。C，反應(yīng)66min，至PH不再變 化結(jié)束反應(yīng)，HPLC分析GL-7-ACA占2.6。/。，過濾得到酰化液。
在反應(yīng)器3中加入固定化去乙酰酯酶45 g，用去離子水洗凈，加入酰 化液，用酸或堿維持PH7.5，保持溫度3rC，反應(yīng)61min，至PH不再變化結(jié) 束反應(yīng)，HPLC分析D-7-ACA占94.2。/q，過濾得到D-7-ACA溶液。
8將反應(yīng)液冰浴降溫，用酸調(diào)PH至3.5下，同時(shí)溫度降至5°C，低速攪 拌4小時(shí)，過濾收集晶體，用4'C丙酮洗滌3遍，4(TC下真空干燥3小時(shí)， 獲得18.8gD-7-ACA結(jié)晶粉。
實(shí)施例5:由CPC結(jié)晶粉三步酶法制備D-7-ACA 將固定化去乙酰酯酯催化反應(yīng)步驟放在酰化反應(yīng)前進(jìn)行，其它條件與 實(shí)施例4 一致，獲得19.0 g D-7-ACA結(jié)晶粉。
實(shí)施例6:由CPC結(jié)晶粉三步酶法制備D-7-ACA
將固定化去乙酰酯酯催化反應(yīng)步驟放在氧化反應(yīng)前進(jìn)行，其它條件與 實(shí)施例4 一致，獲得19.2 g D-7-ACA結(jié)晶粉。 實(shí)施例7:采用液態(tài)酶制備D-7-ACA
稱取20gCPC結(jié)晶粉，加入1000ml水，并滴加氨水溶解，調(diào)節(jié)PH至 7.0，配成2%濃度的底物溶液備用。
在反應(yīng)器中加入D-氨基酸氧化酶40ml，加入上述底物溶液，通入氧氣 2vvm，壓力0.2Mpa，用酸或堿維持PH7.0,保持溫度18°C，反應(yīng)53min， HPLC分析CPC禾tl DCPC面積百分比0.5%,結(jié)束反應(yīng)。
再向反應(yīng)器中加入GL-7-ACA酰化酶35ml和去乙酰酯酶31ml，用酸 或堿維持PH7.8，保持溫度25°C，反應(yīng)55min,至PH不再變化結(jié)束反應(yīng)， HPLC分析D-7-ACA占96%，得到D-7-ACA溶液，將反應(yīng)液降溫至10 'C，經(jīng)過超濾膜用去離子水洗出反應(yīng)產(chǎn)物，再用鈉濾膜濃縮至500ml。
將上述濃縮液冰浴降溫，用酸調(diào)PH至3.8下，同時(shí)溫度降至2"C，低 速攪拌3小時(shí)，過濾收集晶體，用5"C丙酮洗滌3遍，35'C下真空干燥6小 時(shí)，獲得7.1gD-7-ACA結(jié)晶粉。
權(quán)利要求
1、一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方法，其特征在于由頭孢菌素C和3-去乙酰-頭孢菌素C以任意比例構(gòu)成的混合溶液作為底物溶液，采用D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶和去乙酰基酯酶三種酶通過氧化、酰化、水解催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為D-7-ACA，經(jīng)結(jié)晶、干燥獲得目的產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于所述底物溶液中頭孢菌素C的重量百分濃度為0.5% 15% 。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于三種酶為固定化酶或液態(tài)酶。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于底物溶液先在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化 反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10wm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后再在固定化GL-7-ACA酰化酶 和去乙酰酯酶的混合酶催化作用下同時(shí)進(jìn)行酰化和酯水解反應(yīng)，混合酶催化 反應(yīng)條件為pH6.0 8.5,反應(yīng)的溫度為10 37°C。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶和去乙酰酯酶的混合酶 的催化作用下同時(shí)進(jìn)行氧化反應(yīng)和酯水解反應(yīng)，混合酶的催化反應(yīng)條件為 pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10vvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后，再在固定化GL-7-ACA酰化酶的催化作用下進(jìn)行酰 化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反 應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10vvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后，'在固定化GL-7-ACA酰化酶 催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件均為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C;反應(yīng)完過濾后在固定化去乙酰基酯酶催化作用下進(jìn)行酯水解反 應(yīng)，催化反應(yīng)條件均為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于底物溶液在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反 應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 lOvvm，壓力保持0.1 3Mpa;反應(yīng)完過濾后在固定化去乙酰基酯酶催化作 用下進(jìn)行酯水解反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37 °C;反應(yīng)完過濾后在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催 化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于底物溶液在固定化去乙酰基酯酶催化作用下，進(jìn)行酯水解 反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C;反應(yīng)完過濾 后在固定化D-氨基酸氧化酶催化作用下進(jìn)行氧化反應(yīng)，催化反應(yīng)條件為 pH6.0 8.5，溫度為10 37°C，氧氣流量為0.1 10wm，壓力保持0.1 3Mpa;再在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下進(jìn)行酰化反應(yīng)，催化反應(yīng) 條件為pH6.0 8.5，反應(yīng)的溫度為10 37°C。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3-去乙酰基-7-氨基頭孢烯酸的制備方 法，其特征在于結(jié)晶溫度為0 10°C，結(jié)晶pH為2.0 5.5，結(jié)晶時(shí)間為 1 5小時(shí)。
全文摘要
一種新型醫(yī)藥中間體3-去乙酰基-7-氨基-頭孢烯酸的制備方法，由頭孢菌素C和3-去乙酰-頭孢菌素C以任意比例構(gòu)成的混合溶液作為底物溶液，采用D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶和去乙酰基酯酶三種酶通過氧化、酰化、水解催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為D-7-ACA。采用本發(fā)明技術(shù)有利于降低生產(chǎn)成本，整個(gè)工藝流程均采用酶法工藝，低能耗且有利于環(huán)保。
文檔編號(hào)C12P35/00GK101654694SQ20081003212
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日
發(fā)明者曾紅宇, 崗 許 申請(qǐng)人:湖南福來格生物技術(shù)有限公司