專利名稱：：人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒orf5基因及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于動物病毒學與動物傳染病學
技術領域：
。具體涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株ORF5基因的修飾，利用該修飾后基因在制備繁殖與呼吸綜合征病DNA疫苗中的應用。
背景技術：
：豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome'PRRS,下文簡稱PRRS)是近年發現的一種新的病毒性傳染病，以母豬發熱、厭食、早產、流產、死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬的呼吸系統疾病和高死亡率為特征。該病最早于1987年報道于美國南部，不久即傳播到了中西部，并在全美迅速蔓延。隨后加拿大、德國、荷蘭等一些國家也先后暴發了該病(BilodeauRetal,PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinQuebec.VetRec,1991，129:102-103;DeaS，BilodeauR，AthanassiousRetal.SwinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinQuebec:isolationofanenvelopedvirusseralogically-relatedtolelystadvirus.CanVetJ.1992,33:801-808);亞洲地區報道此病的時間相對較晚，中國臺灣地區1991年出現此病(張志成等，臺灣地區豬繁殖與呼吸道征候群I病毒鑒定，中華獸醫雜志，1993,19(4):268-276);日本1994年暴發PRRS(HiroyoshiKuwaahara.AnoutbreakofPRRSinJapan.JVetMedSci,1994,56(50):901-909);中國大陸1996年報道此病開始流行，并分離到病毒(郭寶清等，從疑似PRRS流產胎兒分離豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究，中國畜禽傳染病，1996，87(2):1-5)。上述文獻顯示豬繁殖與呼吸綜合征給全球養豬業造成了巨大的經濟損失，僅1991年歐洲PRRS的暴發就造成了100萬頭豬的死亡。2006年5月以來，我國暴發了由高致病性PRRSV引發的所謂"豬高熱綜合癥"，該病以高熱、皮膚潮紅、呼吸急促、神經癥狀等臨床癥狀為主要特征，存在高發病率、高死亡率和低治愈率等發病特點，對我國養豬業造成了極大的危害和重大的經濟損失，嚴重影響了農民增收和豬肉消費市場穩定及養豬業的生產安全。同豬的其它病毒性傳染病的防制一樣，PRRS的防制也主要是免疫預防。目前用于預防PRRS的疫苗的主要是弱毒苗和滅活苗。盡管弱毒疫苗能提供較好的免疫保護，但存在毒力返強的危險，并且返強的機率相當高，這一點在幾年前丹麥等國因廣泛使用弱毒苗而導致該病大暴發中得以證實。與弱毒苗相比，滅活疫苗雖然安全，但往往需要反復多次的免疫接種，而且效果不穩定，還經常導致免疫失敗。可以說，目前對該病的防制一直不盡人意，迫切需要更加安全、有效的疫苗來預防和控制該病的發生與流行。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV,下文簡稱PRRSV)ORF5基因編碼的搪蛋白GP5是PRRSV中最主要的保護性抗原，可誘導體液免疫和細胞免疫，而且目前確定的最主要的中和表位也位于其N端胞外區，因此是設計PRRS新型疫苗的首選目標基因(DeaS，GagnonCA,MardassiH.Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates.ArchVirol,2000a,145:659-688)。1998年Pirzaden等(PirzadehB,DeaS.ImmuneresponseinpigsvaccinatedwithplasmidDNAencodingORF5ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus.JGenVirol,1998a,79:989-999)用編碼GP5的,真核表達質粒免疫豬，可使接種豬產生抗GP5的特異性抗體，接種豬可免于強毒攻擊造成的全身性病毒血癥和肺部病變，并使間質性肺炎和支氣管肺泡炎明顯減輕。1999年Kwang等(KwangJ,ZuckermannF,RossG,etal.AntibodyandcellularimmuneresponsesofswinefollowingimmunizationwithplasmidDNAencodingthePRRSvirusORFs4，5,6and7.vetSci,1999,67:199~201)用編碼GP4、GP5、M、N4種結構蛋白的基因構建了4種DNA疫苗，免疫豬中，表達GP5的質粒激發的抗體具有最強的中和病毒的能力。但上述研究均發現表達GP5蛋白的DNA疫苗誘導的中和抗體不高(<1:8)。最近，Ostrouski等(OstrowskiM,GaleotaJA,JarAM，etal.IdentificationofneutralizingandnonneutralizingepitopesintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGP5ectodomain.JVirol,2002,76:4241~4250)在采用噬菌體表面展示技術確定GP5中和表位時，發現與中和表位緊鄰的上游存在一個非中和表位，此表位具有類似于HIV中覆蓋表位的覆蓋效應，也正是這一覆蓋表位的覆蓋效應，導致GP5中和表位無法充分暴露，從而難以激發很強的中和抗體。另外，高致病性PRRSV的GP5蛋白氨基端胞外域高度糖基化，推測具有5個N-糖基化位點(N30、N34、N35、N44禾DN51)。為了研究糖基化在PRRSV中和抗體反應中的作用，IsrarulH.Ansari等[10]利用PRRSV的反向遺傳系統構建了一系列PRRSVGP5蛋白糖基化位點發生點突變的突變株，研究結果表明在中和表位兩端的糖基化的突變既提高了病毒在中和試驗中的敏感性，也增強了糖基化位點附近的抗原表位的免疫原性。蛋白的表達水平與其引起的免疫反應直接相關，而編碼氨基酸密碼子的搖擺性導致了不同物種的細胞在蛋白翻譯過程中具有密碼子使用的偏嗜性，哺乳動物細胞在蛋白翻譯過程中與病毒蛋白氨基酸密碼子使用頻率存在著明顯差異。很多文獻也報道了基因改造成功的例子。基于這三個發現，申請人對ORF5基因進行了修飾，即將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸插入ORF5的中和表位和覆蓋表位間，將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)消除，并把ORF5基因的密碼子改造為豬體嗜好的密碼子，以DNA疫苗的方式比較了修飾與未修飾的ORF5基因的免疫原性與免疫反應。
發明內容本發明的第一個目的是人工合成高致病型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF5基因，并對其進行修飾，以暴露其中和表位，提高蛋白的表達量從而誘發更有效的免疫應答，獲得一種免疫原性更好的ORF5基因。本發明的另一個目的是制備一種表達高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5基因的DNA疫苗及其在制備豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗中的應用。本發明通過以下技術方案實施一種人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。一種人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因是將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸序列插入GP5的中和表位和覆蓋表位間，將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)消除，并把GP5基因的密碼子改造為豬體嗜好的密碼子而獲得。所述的表達高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒修飾的ORF5基因的DNA疫苗是將修飾的ORF5基因插入真核表達載體.pcDNA3.1的KpnI與XhoI位點構建而成，含有該質粒的大腸桿菌^&c/!en'cWaco/ZZ)//5ff/pcDNA3.1-SynORF5，于2008年7月25日保藏在中國湖北省武漢市的武漢大學內中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏編號為CCTCCNO:M208U2。本發明還包括上述修飾的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗上的應用。本發明的發明效果本發明與申請號為2004100'09838.3的主要技術特征和實施效果的比較分析如表1所示:表l3K發明與現有技術的主要技術差別<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>更詳細的技術方案如下列步驟如《具體實施方案》所述。序列表SEQIDNO:1是本發明修飾后的ORF5基因的序列圖1:顯示了高致病性PRRSV修飾的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5和未修飾的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5的結構2:顯示了未修飾的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5的酶切鑒定結果圖3:顯示了修飾的ORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5的酶切鑒定結果圖4:顯示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后的ELISA抗體水平圖5:顯示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后的中和抗體水平，圖5A顯示針對高致病性PRRSV(JXA1)產生的中和抗體水平，圖5B顯示針對經典毒株(CH-la)產生的中和抗體水平圖6:顯示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后誘導的細胞免疫水平(脾淋巴細胞剌激指數)。圖7:顯示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠啟，用ELISA方法檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后分泌IFN-y的水平圖8:顯示了高致病性PRRSVORF5基因DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5免疫Balb/c小鼠后，用熒光定量RT-PCR方法檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-y的mRNA相對水平。具體實施方式以下結合說明書附圖對本發明作進一步的說明，但不是限制本發明的保護范圍。—、PRRSVORFS基因的修飾和表達修飾的ORF5基因的DNA疫苗的構建1、修飾的ORF5基因的人工合成該修飾的高致病性的豬繁殖與綜合征病毒(簡稱PRRSV,下同)ORF5基因是將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆蓋表位間，將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)消除，并把ORF5基因的密碼子改造為豬體嗜好的密碼子而獲得。該基因的上游引入KpnI酶切位點，下游引入XhoI酶切位點，改造后的基因序列全長為663bp，由寶生物工程(大連)有限公司協助合成。合成后的序列如下申請人將該修飾好的基因命名為SynORF5。2、表達修飾的ORF5基因的DNA疫苗質粒的構建將上述合成的基因產物SynORF5用Kpnl+Xho1酶切后，將純化回收的酶切產物與用KpnI+XhoI酶切的pcDNA3.1真核表達質粒連接，獲得表達修飾改造的ORF5基因的真核表達質粒pcDNA3.1-SynORF5,經KpnI、XhoI單酶切和Kpnl+XhoI雙酶切鑒定證實構建正確。質粒的重組、制備、酶切分析均按常規方法進行(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版)。二、用于對比試驗的表達未修飾的ORF5基因的DNA疫苗表達質粒pcDNA3.1-ORT5的構建設計一對可擴增高致病性PRRSVORF5完整編碼區的引物PORF5F和PORF5R，上下游引物兩端分別設計了Kpnl和Xhol位點。引物序列如下PORF5F:5，-GCCGGTACCACCATGTTGGGGAAGTGCTTGAC-3'PORF5R:5'-GCACTCGAGCTAGAGACGACCCCATAGTTC-3'提取高致病性PRRSVJXA1株((Tian等，2007，EmergenceofFatalPRRSVVariants:UnparalleledOutbreaksofAtypicalPRkSinChinaandMolecularDissectionoftheUniqueHallmark))總RNA為模板，進行RT-PCR擴增(參見(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002版))，擴增的片段大小為624bp。RT-PCR反應條件為50°C30min，94'C5min;進入PCR循環，94°C1min,57°C1min，72°Cmin,35個循環后，72。C延伸10min。反應結束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。純化回收目的片段，純化的擴增產物經Kpnl和Xhol雙酶切后，直接克隆到真核表達載體pcDNA3.1的Kpnl和Xhol位點，獲得的重組質粒pcDNA3.1-ORF5經KpnI、Xhol單酶切及Kpnl和Xhol雙酶切與PCR鑒定證實構建正確，測序證實無堿基誤配。質粒的重組、制備、酶切分析均按常規方法進行(J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學出版社，2002年)。三、質粒pcDNA3.1-ORF5、pcDNA3.1-SynORF5的大量制備(1)挑取含有質粒的菌落接種于75mL含終濃度為60ng/mL氨芐青霉素的LB培養液，37'C300r/min培養過夜，6000r/min5min，收集細胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-Cl(pH8.0),高壓滅菌后置4'C保存備用)懸浮(吹散或渦旋)。(2)加6mL溶液n(0.2mol/LNaOH,1%SDS，現配現用)，冰浴7-10min。(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸鉀，冰醋酸調pH值至4.8),冰浴7-10min。4。C10000r/min10-15min。(4)取上清，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，-20°C30min或室溫5min。室溫，10000r/min6-15min。(5)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mLTE(10.0mmol/LTris-HCl,l.Ommol/LEDTA)懸浮(洗壁20min左右)。(6)力Q1.5ml即1倍體積冰預冷的5mol/LNH4Ac,混勻。4°C10000r/min10min。(7)將上清轉移至7mL的離心管，加l倍體積(3mL)的異丙醇混勻，-2(TC作用30min。12000r/min15min。(8)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500nLTE懸浮(洗壁20min左右)，并轉移至1.5mL的離心管。(9)加入適量的RNase,37°Clh,去RNA。(10)力[]l倍體積的13。/。的PEG8000(含1.6mol/LNaCl),混勻，-20°C30min(可以過夜)。離心，棄上清，用400nLTE重溶。(11)加等體積酚氯仿異戊醇抽提2次，氯仿異戊醇抽提l次。(12)力Q100nl10mol/LNH4Ac,充分混勻后，加入2倍體積的無水乙醇，-20。<:沉淀30min。4'C12000r/min離心5-10min。(13)棄上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50nLTE或H2O重溶，置-20'C備用。四、DNA疫苗的生產工藝疫苗生產工藝的主要流程質粒的轉化、質粒的大量提取、質粒濃度的測定與稀釋。1、質粒的轉化將DNA疫苗表達質粒pcDNA3.1-ORF5和pcDNA3.1-SynORF5(氨芐抗性)分別轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。具體操作是1)取100nl感受態細胞懸液轉移到無菌的1.5mlEP管中，加入10^1連接產物，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min。2)將離心管放到預先加溫到42'C的循環水浴中熱沖擊90秒。3)快速將離心管轉移到冰浴中，使細胞冷卻l2min。4)每管加400WLB培養基。用水浴將培養基加溫至37'C,然后將離心管轉移到37'C搖床上，溫育45min,使細菌復蘇。為達到有效轉化，復蘇時轉速不宜超過225轉/分。5)取100nl轉化的感受態細胞轉移到含終濃度為60pg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上，用一無菌彎頭玻棒將轉化的細胞均勻地涂布到瓊脂平板表面。6)將平皿置37'C培養，直至液體被吸收，然后倒置平皿培養，12-16h可出現菌落。2、質粒的大量提取同本說明書的"三、質粒pcDNA3.l-SynORF5的大量制備"的方法(制備步驟同上述"三")。3、質粒濃度的測定、稀釋利用分光光度計測定大量制備的質粒的濃度，用磷酸鹽緩沖液(8.0gNaC1,0.2gKC1,2.9gNa2HP04'12H20，0.2gKH2P04加ddH20至lOOOmL)(PBSpH7.4)將其稀釋到lug/u1，即可用于動物注射。五、疫苗的免疫效力檢驗疫苗對Balb/c小白鼠的免疫效力試驗將DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5和pcDNA3.1-ORF5分別經后腿肌肉注射6周齡的Balb/c小鼠，每組6只，每只小鼠100nl(含100嗎質粒)，共免疫2次，間隔3周；同時用空白質粒載體pcDNA3.1作為核酸免疫的陰性對照。于首次免疫后3、6周經尾靜脈負壓采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體，結果表達修飾的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5誘導的ELISA抗體和中和抗體均明顯高于表達未修飾的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5(詳見實施例2)。實施例1:含有本發明修飾的基因的質粒和含有對照基因的質粒的制備1、表達未修飾的ORF5基因(對照)的真核表達質粒pcDNA3.1-ORF5的構建提取高致病性PRRSVJXAl(Tian等，2007，EmergenceofFatalPRRSVVariants:UnparalleledOutbreaksofAtypicalPRRSinChinaandMolecularDissectionoftheUniqueHallmark)總RNA為模板，PORF5F禾口PORF5R為引物RT-PCR擴增ORF5基因。純化的擴增產物經KpnI和XhoI酶切后，直接克隆到真核表達載體pcDNA3.1的Kpnl和XhoI酶切位點，獲得的重組質粒pcDNA3.1-ORF5，其結構見附圖l,酶切與PCR鑒定結果見附圖2(Kpnl、Xhol單酶切均只有一條約6000bp的帶、Kpnl和XhoI雙酶切產生一條約600bp和一條約5400bp的帶)。2、表達修飾的ORF5基因的真核表達質粒pcDNA3.1-SynORF5的構建將人工合成的SynORF5基因用Kpnl和XhoI酶切，回收純化后，同時與用Kpnl和Xhol酶切的真核表達載體pcDNA3.1連接，獲得表達修飾后的ORF5基因的真核表達質粒pcDNA3.1-SynORF5，結構見附圖1,酶切鑒定結果見附圖3(Kpnl、.Xhol單酶切均只有一條約6000bp的帶、Kpnl和Xhol雙酶切產生一條約660bp和一條約5400bp的帶)。實施例2:本發明的DNA疫苗和對照疫苗對小鼠免疫效力的生物學實驗1、Balb/c小鼠的免疫程序將Balb/c小鼠分為3組，每組6只，釆用后腿肌肉注射，每只小鼠100nl(含100ng質粒)，共免疫2次，間隔3周，同時用空白質粒載體pcDNA3.1作為核酸免疫的陰性對照。在首免后3、6周經尾靜脈負壓采血，分離血清，檢測ELISA抗體和中和抗體。于首免后6周，通過頸椎處死所有免疫小鼠，無菌取出脾臟，利用淋巴細胞分離液(購自天津TBD公司)分離脾淋巴細胞，進行細胞免疫(包括脾淋巴細胞刺激增殖指數禾tlIFN-Y的mRNA轉錄、分泌水平)檢測(Xiao等ComparisonofimmuneresponsesandprotectiveefficacyofsuicidalDNAvaccineandconventionalDNAvaccineencodingglycoproteinCofpseudorabiesvirusinmice.Vaccine.2004'22,345-351)。2、ELISA抗體水平采用大腸桿菌表達和純化的GP5蛋白作抗原，檢測血清中的ELISA抗體水平，結果顯示經修飾改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫組誘導的ELISA抗體水平要明顯高于未經修飾的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫組(P<0.05,t-test),表明修飾后的ORF5具有更好的免疫原性，結果如附圖4。3、中和抗體水平采用Yoon等(YoonIJ,JooHS,GoyalSM.Amodifiedserumneutralizationtestforthedetectionofantibodytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinswinesera.JVetDiagnInvest,1994,6:289-292)報道的改良的中和抗體檢測方法，檢測血清中的中和抗體水平。用高致病性PRRSV毒株與經典PRRSV毒株進行的中和試驗，結果都與ELISA抗體結果一致，未經修飾的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫組的中和抗體水平不高，并且上升得較為緩慢，而修飾改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫組的中和抗體快速上升，個別免疫小鼠的中和抗體于第6周達到了l:32，與pcDNA3.1-ORF5免疫組相比差異極顯著(P0.01,t-test),試驗結果如附圖5。4、脾淋巴細胞剌激增殖指數檢測采用MTT法測定小鼠脾淋巴細胞的刺激指數(SI)(沈關心等主編.現代免疫學實驗技術.湖北科學技術出版社，1998年版)。結果本發明經修飾改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫組的刺激增殖指數要顯著高于未經修飾的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫組(P<0.01,t-test)。試驗結果如附圖6。5、ELISA方法檢測脾淋巴細胞分泌的IFN-y水平采用ELISA方法(龍振洲，醫學免疫學(第2版).北京人民衛生出版社,2000年版)檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后分泌IFN-y的能力。結果本發明經修飾改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫組分泌IFN-y水平要顯著高于未經修飾的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫組(P<0.01,t-test)。試驗結果如附圖7。6、熒光相對定量RT-PCR方法檢測淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-Y的mRNA水平采用熒光相對定量RT-PCR方法(參見章靜波等.細胞生物學實驗技術.化學工業出版社，2006年版)檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后IFN-Y的mRNA水平。小鼠脾淋巴細胞在體外經特異抗原(紫外線照射滅活的PRRSV)刺激后，提取總RNA,利用oligodT將mRNA體外轉錄成cDNA。利用引物p-actins:5，-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-3',(3-actinr:5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3，擴增小鼠看家基因(3-actiib并將其作為相對定量RT-PCR的內參；引物IFN-ys:5'-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3',IFN-丫r:5，-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3，，擴增小鼠IFN-y基因。熒光定量PCR反應體系(25^1)包括IFN-y和P-actin上下游引物各0.5pl(lO)aM),2xSYBR⑧GreenRealtimePCRMasterMix(包括反應緩沖液、dNTP、Mgcl2、SYBRGreenI、Taq酶)(購自ToYoBo公司，上海)12.5pi,雙蒸水11.0pl，cDNA樣品0.5|al。每個樣品做三個重復。反應擴增條件為50°C2min,94°C預變性lOmi，進入PCR循環94°C變性15s和60°C退火與延伸1min,共40個循環。整個反應過程中的熒光信號的變化由ABIPrism7500實時熒光定量PCR儀(購自美國AppliedBiosystems公司)檢測。結果本發明經修飾改造后的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5免疫組IFN-y的mRNA水平要明顯髙于未經修飾的DNA疫苗pcDNA3.1-ORF5免疫組(P<0.01，t-test)。試驗結果如附圖8。附錄術語定義英文名稱中文名稱pcDNA3.1空白質粒載體pcDNA3.1-ORF5表達未修飾的ORF5基因的DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5表達修飾型的ORF5基因的DNA疫苗序列表<110>華中農業大學<120>人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因及應用<130><141>2008-08-04<160>2〈170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211>663<212〉DNA〈213>豬(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..(663)<223><220><221>CDS<222>(10)..(657)<223>〈400〉1gccggtaccaccatgctgggcaagtgcctgacegcctgctgttgcteccgc51ThrMetLeuGlyLysCysLeuThrAlaCysCysCysSerArg1510ttgctgttcctgtggtgtategtgcccttctatctggccgtgctggtg99LeuLeuPheLeuTrpCyslieValProPheTyrLeuAlaValLeuVal15202530gccgcctecgccaagttcgtggetgcctggaccctgaaggetgccget147AlaAlaSerAlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla354045aacgccgcctegteccacatecagctgatetacaacctgaccctgtgt195AsnAlaAlaSerSerHislieGinLeulieTyrAsnLeuThrLeuCys505560gagctggccggcaccgactggctggcccagaagttcgactgggccgtg243GluLeuAlaGlyThrAspTrpLeuAlaGinLysPheAspTrpAlaVal657075gagaccttcgtgatettccccgtgctgacccacategtgtectacggc291GluThrPheValliePheProValLeuThrHislieValSerTyrGly808590gccctgaccaccteccacttcctggacaccgtgggcctggccaccgtg339AlaLeuThrThrSerHisPheLeuAspThrValGlyLeuAlaThrVal95100105110tecaccgccggctactaccacggccgctacgtactgtectecatetac387SerThrAlaGlyTyrTyrHisGlyArgTyrValLeuSerSerlieTyr115120125gccgtgtgcgccctggccgccctgatetgcttcgtgatecgccttgcc435AlaValCysAlaLeuAlaAlaLeulieCysPheVallieArgLeuAla130135140aagaactgcatgtectggcgctacagetgtacacgctacaccaacttc483LysAsnCysMetSerTipArgTyrSerCysThrArgTyrThrAsnPhe145150155ctgctggacaccaagggccgcctgtaccgctggcgcagecccgtgate531LeuLeuAsp160gtggag肌gVaiGluLys17533gCgCgtgLysArgValtecgccgagSerAlaGluThrLysggcggcGlyGlygtgctgValLeu195ctgtggLeuTrp210<210>2<211〉214〈212〉PRT<213>豬(Susscrofa)〈400>2ThrMetLeuGlyArg165aaggtgLysVal180gacggcAspGlyggccgcGlyArg1PheLeuSerAlaAlaSer50AlaGly65PheValGlyLysCysLeu5TrpLys35SerCys20PhelieValProValAlaAlaHislieGinThrAspTrpliePheThrThrSerAlaGlyCysAla130CysMet145Tyr115LeuHis100TyrPro85PheLeu70ValLeu55AlaLeuLeuAspHisGlyArgAlaAlaLeuSerTrpArgTyr150lie135SerLeuTyrArggaggtggagGluValGlutecgccgccSerAlaAla200ctgtagetcLeuLeu215TrpArg170ggccacGlyHis1853CCcccThrProgagtgcSerProVallieThrAlaCys10PheTyrLeu25TrpThrLeu40lieTyrAsnGinLysPheThrHislie90ThrValGly105TyrValLeu120CysPheValCysThrArgCysCysAlaValLysAlaLeuAsp75VallieTyr155Ctg3tCg3CLeulieAspctgacccgcLeuThrArg205Thr60TrpSerLeuAlaSerSerArg140ThrctgLeu190gtgValSerArgLeu15LeuValAla30AlaAlaAsn45LeuCysGluAlaValGluTyrGlyAla95ThrValSer110lieTyrAla125LeuAlaLysAsnPheLeuLeuAlaAlaLeuThr80LeuThrValAsnLeu160579627663AspThrLysGlyArgLeuTyrArgTrpArgSerProVallieValGlu165170175LysGlyGlyLysValGluValGluGlyHisLeulieAspLeuLysArg180185190ValValLeuAspGlySerAlaAlaThrProLeuThrArgValSerAla195200205GluLeuTrpGlyArgLeu210權利要求1、一種人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、包含人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因質粒的大腸桿菌^sc/en'c力/acoiZW5ff/pcDNA3.1-Syn0RF5，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208112。3、包含人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因質粒的大腸桿菌的DNA疫苗，所述的大腸桿菌是￡c/en'c/u'aco7/ZW5tz/pcDNA3.1-SynORF5，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M208112。4、權利要求1所述人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF5基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗中的應用。全文摘要本發明屬于動物病毒學與動物傳染病學
技術領域：
，具體涉及一種人工合成的修飾型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的克隆及作為疫苗的應用。特征是，將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆蓋表位間，將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)進行消除，并把ORF5基因的密碼子改造為豬體嗜好的密碼子而獲得，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。該修飾基因包含在真核表達質粒pcDNA3.1-SynORF5中，含有該質粒的大腸桿菌EscherichiacoliDH5α/pcDNA3.1-SynORF5，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCCNOM208112。本發明還公開了該基因在制備豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗中的應用。文檔編號C12R1/19GK101392261SQ200810048768公開日2009年3月25日申請日期2008年8月12日優先權日2008年8月12日發明者方六榮,彬李,江云波,肖少波,陳煥春申請人:華中農業大學