專利名稱：轉基因水稻tt51-1轉化事件外源載體整合位點全序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域中轉基因水稻的安全評估和檢測，具體地說， 涉及一種轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列及其應用。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種 植和生產，有的被加工成食品、飼料或用作食品添加劑。由于轉基因產品的生態 安全和食用安全一直備受爭議，30多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制 度。轉化事件包含的轉化載體的序列、編碼基因序列、重組方式、插入位點等序 列信息是進行轉基因安全評價的基礎。根據這些信息，可以獲得該轉基因品系編 碼的蛋白的序列、完整性、編碼蛋白的組織和時間特異性，并進一步分析其潛在 的毒理特征、致敏性等安全性問題。同時，根據外源載體插入的位點，判斷宿主 基因組插入失活和缺失的情況，可以推測該轉化事件對宿主的影響和導致的安全 性問題。同時，序列資料也是轉基因產品身份驗證和檢測的基礎。只有建立了有效的 檢測方法，才能對轉基因產品的研究和生產進行有效的管理和監督。根據轉基因 產品中外源基因的序列信息，外源基因在轉基因構建體上的組合方式，以及構建 體在基因組上的整合位點，可以采用基因特異性、載體特異性和事件特異性的檢 測方法。1、 基因特異性檢測方法由于大量的轉基因載體使用了相同的外源基因，因此基因特異性檢測方法并 不適合當前轉基因產品不斷涌現的現實。2、 載體特異性檢測方法載體特異性檢測方法利用基因元件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定使用 類似基因元件的不同構建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研 宄者所使用。但是，由同一構建體可能獲得不止一個不同特性的轉化株，甚至可 能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部經過了安全評估。因此載體特 異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系，也不能判別該轉基因品系是否己經過 安全評估。
3、事件特異性的檢測方法
事件特異性檢測的基礎是轉基因構建體在基因組DNA序列上的整合位點具 有高度特異性，即使是相同的載體多次轉化，整合的位置和整合位點特征也是不 可重復的。因此，根據不可重復的整合位點特征序列，開發出了事件特異性的檢 測方法。與前兩種方法相比，事件特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉基 因產品的定性和定量檢測。但轉基因構建體的完整信息通常難以獲得，而已知序 列基因元件可能距邊界有相當的距離，而且在整合的過程中，載體和基因組之間 可能發生復雜的重組，因此，分離旁側序列成為事件特異性檢測的關鍵。2000 年2月，歐盟為此資助了 Qpcrgmofood European Project項目，該項目現已成 功分離獲得多個品種旁側序列并用于建立事件特異性檢測方法。當前，事件特異 性檢測方法已經被用于轉基因Roundup Ready soybean, Mon810 maize等一系列 轉基因商品化品種的檢測。
經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現任何關于轉基因水稻TT51-1事 件外源插入載體全序列及兩側旁側序列和利用此序列建立事件特異性定性、定量 PCR (聚合酶鏈式反應)檢測的報道。
發明內容
本發明的目的就在于克服現有技術在轉基因水稻TT51-1事件和轉基因水稻 TT51-1衍生品種安全評估和檢測工作中存在的不足，提供一種轉基因水稻 TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列及其應用。
本發明的目的是這樣實現的
一、轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列 本發明以轉基因水稻品種TT51-1為材料，提取基因組DNA，并利用引物FraglF : 5，AAAAGTTGMTTTGGGMTAGTCAGCCA 3， 和引物FraglR : 5， CTCACCCAGAAACGCTTTACGG 3'擴增出包含TT51-1事件5'端673bp水稻基因序 列和部分TT51-1事件的全長3403bp的片段1;利用片段1內部引物Frag2F: 5' AATATAMCCATGCTCACTCA3，和引物Frag2R: 5， CGGTTTCMTGCGTTCTCCACCAAGTA 3'擴增出包含TT51-1事件的長2202bp的片段2;利用片段2內部引物Frag3F: 5， MTCCCTCAGCATTGTTCATCG 3， 和引物 Frag3R: 5， AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3'擴增出包含TT51-1事件的長3043bp的片段 3;利用片段3內部引物Frag4F: 5， AGAGGTGGCGMACCCGACAGGACTAT 3，和引 物Frag4R: 5， ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3，擴增出包含TT51-1 事件的長2659bp的片段4;根據分離獲得的4個片段，拼接出一種轉基因水稻 TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列(簡稱本序列)，該系列包含TT51-1 事件及其兩側水稻基因組序列的長10536bp的全長序列，如SEQ NO. 1。轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體全序列及其兩側旁側序列，其特征是1、 堿基序列如SEQ NO. 1所示，由來源于水稻基因組的第1至673個堿基， 來源于載體序列的第674至9364個堿基和來源于水稻基因組的第9365至10536 個堿基共同組成；2、 由來源于外源插入載體的第1至673個堿基和來源于油菜基因組序列的 第674至9364個堿基共同組成的DNA序列，轉基因水稻TT51-1事件外源插入載 體5'端邊界旁側序列；3、 由來源于油菜基因組序列的第674至9364個堿基和來源于外源插入載體 的第9365至10536個堿基共同組成的DNA序列，轉基因水稻TT51-1事件外源插 入載體3'端邊界旁側序列；4、 以上所述序列是轉基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于區分轉基 因水稻TT51-1和其他轉基因和非轉基因水稻，以及轉基因水稻TT51-1的定性檢 測和定量分析。二、轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列的應用 1、利用該序列特征設計的轉基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特異 性定性PCR檢測方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAMAGGAATA 3，和TT511V:5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，；提取樣品總DNA，分別利用TT511G/TT511V 引物組合進行PCR擴增；PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存 在擴增產物，如存在擴增產物則說明樣品中含有TT51-1來源的成分。
2、利用該序列特征設計的轉基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事件特異 性定量PCR檢測方法
合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA 3，和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，； 合成TaqMan探針序列如下TT511P: 5， FAM —ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG —朋Q1 3，;提取樣品總DNA，分別利用上述引物 TT511G/TT511V和探針TT511P組合進行熒光定量PCR擴增；轉基因水稻TT51-1 基因組DNA被相同濃度非轉基因水稻基因組DNA稀釋至不同含量，以20ng的混 和水稻基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應并建立標準曲線；以標準曲線 為參照測定含有TT51-1基因組DNA的混和水稻基因組DNA樣品中TT51-1基因組 DNA的量。
與現有技術相比，本發明具有下列優點和積極效果
1、 本發明首次公布轉基因水稻TT51-1轉化事件全序列；
2、 本發明首次公布轉基因水稻TT51-1轉化事件基因組插入位點的旁側序
列；
3、 本發明首次確認轉基因水稻TT51-1轉化事件基因組插入位點的旁側序列 中不同堿基的來源，并確定外源插入載體序列和水稻基因組序列的接合位點；
4、 利用本發明發現的序列特征，首次建立轉基因水稻TT51-1事件特異性定 性和定量PCR檢測方法；
5、 本發明適用于對轉基因水稻TT51-1 (包括親本、雜種Fl和后代)及其 制品(包括植株、組織、稻谷、大米及其制品)實施檢測、監測和安全管理。
圖1是轉基因水稻TT51-1事件及其兩側旁側序列結構圖。 圖2是轉基因水稻TT51-1事件定性定量檢測引物及其位置圖。 圖3是轉基因水稻TT51-1事件特異性定性PCR擴增圖；其中 M:分子量Marker;1— 雙蒸水模板；2— 非轉基因水稻基因組DNA模板；3— 轉SCK基因水稻基因組DNA模板； 4一轉基因水稻TT51-1基因組DNA模板；5— 轉基因大豆RBS基因組DNA模板；6— 轉基因油菜RT73基因組DNA模板；7— 轉基因油菜MS8RF3基因組DNA模板；8— 玉米基因組DNA模板；9— 棉花轉基因組DNA模板。圖4是轉基因水稻TT51-1事件特異性定量PCR擴增圖。
具體實施方式
1、轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列的PCR擴增 先將20% SDS預熱到65° C，取15 ml SDS抽提buffer (0. lTrisHCl, 0. 05M EDTA, 1M NaCl pH8. 0)加入到50ml離心管，再加入2.5 e-巰基乙醇，混 勻；液氮研磨3g左右的葉片，將粉末轉至50ml含抽提buffer的50 ml離心管 中，在振蕩器上振蕩混勻，加入2 ml預熱的20%SDS，混勻，65° C水浴至少 30分鐘，其間要輕輕搖動試管；水浴后，迅速將離心管置于冰上，加入3ml 3M KAc， 混勻，在冰上放置30分鐘；4° C 5000g離心5min;將上清轉移到新的50 ml 離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，-20° C放置30min以上；6000g ， 4 ° C離心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超純水溶解DNA， 溶解后，將溶液轉移到15ml的離心管中；按DNA溶解體積的W加蛋白酶K， 55 ° C水浴30min;加入等體積苯酚，混勻，輕搖30min， 8000g離心10min;轉移 上清至新的tube中，加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25: 24: 1)，輕搖20min， 8000g離心15min;轉移上清至新的tube中，加等體積的氯仿-異戊醇(24:1)， 輕搖20min， 8000g離心15min;吸取上清，每管加入RNase，混勻，37° C 水浴lhr降解RNA;用等體積的苯酚抽提一次，輕搖20min , 8000g離心15 min; 轉移上清至新的離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇(24:l),輕搖20min， 8000g 離心15min;吸上清加入1/10體積3MNaAC，混勻，加入等體積異丙醇，-20°C放置30min，沉淀DNA; 6000g， 4° C離心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗2 遍，離心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超純水溶解DNA備用。合成引物序列如下FraglF: 5' AMAGTTGAATTTGGGAATAGTCAGCCA 3'; FraglR : 5， CTCACCCAGAMCGCTTTACGG3， ； Frag2F : 5，AATATAAACCATGCTCACTCA3， ； Frag2R: 5， CGGTTTCAATGCGTTCTCCACCAAGTA 3 ，； Frag3F : 5， AATCCCTCAGCATTGTTCATCG3， ； Frag3R : 5，AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT 3，； Frag4F : 5，AGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTAT 3'; Frag4R : 5'ATCTATTTGTTAGATACGTATGTTTATAGATCAC 3'。以提取的轉基因水稻TT51-1基因組DNA為模板，利用PCR技術分4段擴增 轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列。在50ul反應體系中，取 Oxy-235基因組DNA 100ng，其他各組分終濃度為，KOD Plus Buffer lx， dNTPs 每種200uM， MgS04lmM,引物各100nM， KOD Plus酶lu。反應條件為，94° C2 分鐘預變性，94° C15秒，60° C30秒，68° C3分鐘，循環35次，68° C保 溫7分鐘。其中，利用引物FraglF和引物FraglR可以擴增出包含TT51-l事件 5'端水稻基因序列和部分TT51-1事件的片段1。利用片段1內部引物Frag2F 和引物Frag2R可以擴增出包含TT51-l事件的片段2。利用片段2內部引物Frag3F 和引物Fmg3R可以擴增出包含TT51-l事件的片段3。利用片段3內部引物Frag4F 和引物Frag4R可以擴增出包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3'端水稻基因 組序列的片段4。分別進行PCR擴增后，瓊脂糖電泳分離DNA， EB染色鑒定。以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit純化PCR產物。將PCR產物與EcoRV酶切的pZero2 (Invitrogen)載體連接。連接體系 ■ mixture 22 u 1; 2. 5 P 1 10XT4腿Ligase Buffer with ImM ATP; 0. 5 u 1 T4 DNA Ligase(NEB)。 22° C連接至少lhr。根據《分子克隆實驗指南》提供的方法制備大腸桿菌TOPIO (Invitrogen)感 受態細胞，并以連接產物轉化。挑取單克隆，以突變位點特異引物進行菌落PCR 檢測重組子。將篩選出的克隆擴大培養，小量制備質粒，酶切驗證。將篩選出的克隆送測序公司測序。將獲得的序列信息，利用NCBI提供的 Blastn軟件，分析不同部分序列的來源，從而判斷基因組和載體的結合位點。2、應用方法
1) 利用本發明中所提供的序列進行轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的 安全性分析
利用NCBI提供的Blastn軟件，分析不同部分序列的來源，可以發現TT51-1 事件中包含了氨芐青霉素和潮霉素抗性基因片段。在包含的2個抗蟲基因中，有 1個因為啟動子的斷裂導致其可能無法正常表達。同時，根據兩側旁側序列，可 以發現TT51-1事件中外源基因的整合導致水稻宿主基因組片段的缺失和插入失 活，可能會影響到宿主的正常發育。
2) 利用本發明中所提供序列設計轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的事 件特異性定性PCR檢測方法
合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAAMGGAATA 3'和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，。
分別取非轉基因水稻基因組DNA模板，轉SCK基因水稻基因組DNA模板，轉 基因水稻TT51-1基因組DNA模板，轉基因大豆RBS基因組DNA模板，轉基因油 菜RT73基因組DNA模板，轉基因油菜MS8RF3基因組DNA模板，玉米基因組DNA 模板，棉花轉基因組DNA模板，分別利用TT511LG/TT511LV引物組合進行PCR 擴增。在25ul反應體系中，以100ng不同來源基因組DNA為模板，其他各組分 終濃度為，PCR Buffer lx (含10mM Tris'HCl pH8. 3， KC1 50mM)， dNTPs每 種200uM， MgCl2 2.5mM，引物各250nM， Hot Start Taq酶lu。反應條件為， 94° C2分鐘預變性，94° C15秒，60° C30秒，72° C30秒，循環35次，72° C 保溫2分鐘。PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物。
3) 利用本發明中所提供序列設計轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的事 件特異性定量PCR檢測方法
合成TaqMan探針序列如下TT511P: 5， FAM—ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG— 朋Q1 3'。
針對轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體3'端旁側序列的引物、探針組 合被用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺MJR DNA Engine Opticon 2 Continuous Fluorescence Detector上進行，檢測及分析軟件為Opticon Monitor 2 Version 2.02。TT51-l事件定量檢測反應體積25ul，含模板DNA20ng，其他組分含量為 lx TaqMan Universal Master,引物TT511G和TT511V 800uM,探針TT511P 400uM。TaqMan反應條件為50° C 2分鐘和95° C 10分鐘預變性以后，進行50 次PCR循環95° C 15秒變性，60° C 1分鐘退火及延伸，收集熒光信號。轉基因水稻TT51-1基因組DNA被相同濃度非轉基因水稻DNA稀釋至不同含 量，以20ng的混和水稻基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋 倍數，分別含20， 4.7， 0.47， 0.047， 0. 0047ng TT51-1基因組DNA的混和DNA 樣品被用于建立標準曲線。所有的熒光定量反應都重復4次。根據標準曲線優化的結果，利用與建立標準曲線相同的PCR反應條件，以標 準曲線為參照測定含有TT51-1基因組DNA的混和水稻基因組DNA樣品中TT51-1 基因組DNA的量。取20ng基因組DNA為模板，利用不同含量標準樣品做標準曲 線，根據獲得的標準曲線和轉基因樣品的Ct值,計算TT51-1基因組DNA的質量， 從而計算出TT51-1在樣品中的含量。所有熒光定量反應都重復4次。3.實驗結果1)轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體全序列及其兩側旁側序列的PCR 擴增和測序分析利用引物FraglF和引物FraglR擴增出3403bp的片段1，測序和序列比對 分析結果表明其中包含TT51-1事件5'端673bp水稻基因序列和部分TT51-1事 件。利用片段1內部引物Frag2F和引物Frag2R擴增出包含TT51-1事件的長 2202bp的片段2。利用片段2內部引物Frag3F和引物Frag3R擴增出包含TT51-1事件的長 3043bp的片段3。利用片段3內部引物Frag4F和引物Frag4R擴增出長2659bp的片段4，測 序和序列比對結果表明其中包含部分TT51-1事件和TT51-1事件3'端1172bp 水稻基因組序列。拼接以上片段，可以獲得轉基因水稻TT51-1事件全序列及其兩側旁側序列。 根據以上分析，本發明分離獲得的序列包含轉基因水稻TT51-1事件外源插入序列全序列及其兩側旁側序列，其特征如圖1所示。
2) 利用本發明中所提供序列設計轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的事 件特異性定性PCR檢測方法
以不同來源轉基因和非轉基因作物基因組DNA為模板，利用TT51-1事件外 源插入載體3，端旁側序列特異性引物組合TT511G/TT511V (圖2)，進行PCR擴 增，結果如圖3。只有TT51-1基因組DNA可以擴增出特異的PCR產物，而其他 轉基因和非轉基因水稻基因組DNA做模板時都沒有擴增產物可觀察到。同時以其 他非水稻轉基因和非轉基因植物基因組DNA為模板，也沒有可見的PCR擴增產物。 因此，我們認為，該引物組合具有良好的特異性，適合用于事件特異性的檢測。
3) 利用本發明中所提供序列設計轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的事 件特異性定量PCR檢測方法
利用如圖2所示的引物探針組合，進行TT51-1事件特異性的熒光定量PCR 反應。根據梯度稀釋模板，4次重復獲得的熒光曲線信息，針對TT51-1事件的 特異性熒光定量PCR反應標準曲線被建立起來，如圖4所示，其1 2值為0.997， 表明外源基因的拷貝數與熒光強度都具有良好的對應關系，適合用于外源基因的 精確定量。
為了驗證本研究中建立的定量方法的精確性，我們使用了從標準轉基因水稻 TT51-1產品中提取的基因組DNA用非轉基因水稻基因組DNA稀釋至一定含量， 并以不含轉基因水稻TT51-1基因組DNA的相同量基因組DNA做對照，作為實時 熒光定量PCR反應的模板，并根據相同條件下獲得的標準曲線，計算不同樣品中 轉基因水稻基因組DNA的含量。
以不含轉基因水稻TT51-1的非轉基因水稻基因組DNA為模板，沒有擴增產 物被檢測到。對于混和實驗樣品，用本研究中建立TT51-1事件特異性熒光定量 檢測方法來檢測，都和理論值非常接近，誤差小于15%。
以上結果可以看出，本發明為轉基因水稻TT51-1事件及其衍生品種的定量 檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于不同來源、不同含量的混 和產品中轉基因油菜0xy-235事件以及轉基因油菜品種0xy-235的定量。本發明 為轉基因標識提供了一種有用的參考，對轉基因產品的控制提供了必要的手段。序列表〈110〉中國農業科學院油料作物研究所〈120〉轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列及其應用〈160〉1〈210〉1〈211〉10536〈212〉DNA〈213〉水稻((2zyza sa〃ra cv. TT51-1) 〈400〉aaaagttgaa tttgggaata gtcagccaag gttttgtagc tactttggaa gctaaaccta 60ctctgtttga tcaaattaga gaagctcaag tgaatgatcc tgatatccag gaaataaaga 120agaacatgag aaggggtaaa gccatcggtt ttgtagaaga tgagcaggga actgtgtggt 180taggagaaag aatttgcgtc ccag犯aata aggagttgaa ggatactatc atgaaagaag 240ctcatgaaac tctgtattcc attcaccctg gaagcactaa gatgtaccaa gacttaaagc 300agcaattttg gtgggctagt atgcgacgtg agctagcaga atacgtggct ctatgtgatg 360tatgtcagcg ggtcaaagca gaacatcaga agccagctgg actattacaa ccattgaaga 420ttccagagtg gaagtgggaa gaaataggaa tggattttat aaccggtcta cccagaacgt 480cagcaggacs tgattctatt tgggtagtgg ttgatcggtt gacaaaagtc gctcacttca 540taccggtcaa aacaacctat acgggacata agcttgcaga gttata/tatg gctagagtgg 600tatgtttgca tggtgttcct aagaagatag tgtcagatag aggtagccag tttacttcga 660agttttggca gaagacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 720tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 780cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 840tgagctgata ccgctcgccg 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gggatttgta taagsaatat ctttaaaaaa acccstatgc taatttgaca 4320taatttttga gaaaaatata tattcaggcg aattctcaca atgaacaata ataagattaa 4380aatagctttc ccccgttgca gcgcatgggt attttttcta gtaaaaataa aagataaact 4440tagactcaaa acatttacaa aaacaacccc taaagttcct aaagcccaaa gtgctatcca 4500cgatccatag caagcccagc ccaacccaac ccaacccaac ccaccccagt ccagccaact 4560
ggacaatagt ctccacaccc ccccactatc accgtgagtt gtccgcacgc accgcacgtc 4620
tcgcagccaa aaaaaaaaaa agaaagaaaa aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc 4680
cgggtcgtgg gggccgg犯a cgcgagg鄉atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc 4740
ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcgc cactatatac ataccccccc ctctcctccc 4800
atccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg 4860
gacgacgagc tcctcccccc tccccctccg ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc 4920
tctcctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag 4980
tttgggtggg cg卿ggcgg cttcgtgcgc gccc卿tcg gtgcgcggga ggggcgggat 5040
ctcgcggctg gggctctcgc cggcgtggat ccggcccgga tctcgcgggg aatggggctc 5100
tcggatgtag atctgcgatc cgccgttgtt gggggagatg atggggggtt taaaatttcc 5160
gccatgctaa 3caagatcag gaagsgggga a犯gggcact atggtttata tttttatatEL 5220
tttctgctgc ttcgtcaggc ttagatgtgc tagatctttc tttcttcttt ttgtgggtag 5280 aatttgaatc cctcagcatt gttcatcggt agtttttctt ttcatgattt gtgacaaatg
cagcctcgtg cggagctttt ttgtaggtag acgataagct tgatatcgaa ttcctgcagc 5400
cccatggaca actgcaggcc atacaactgc ttgagtaacc cagaagttga agtacttggt 5460
ggagaacgca ttgaaaccgg ttacactccc atcgacatct ccttgtcctt gacacagttt 5520
ctgctcagcg agttcgtgcc aggtgctggg ttcgttctcg gactagttga catcatctgg 5580
ggtatctttg gtccatctca atgggatgca ttcctggtgc aaattgagca gttgatcaac 5640
cagaggatcg aagagttcgc caggaaccag gccatctcta ggttggaagg attgagcaat 5了00
ctctacca3a tctatgcaga gagcttcaga gagtgggaag ccgatcctac taacccagct 5760
ctccgcgagg aaatgcgtat tcaattcaac gacatgaaca gcgccttgac cacagctatc 5820
ccattgttcg cagtccagaa ctaccaagtt cctctcttgt ccgtgtacgt tcaagcagct 5880
aatcttcacc tcagcgtgct tcgagacgtt agcgtgtttg ggcaaaggtg gggattcgat 5940
gctgcaacca tcaatagccg ttacaacgac cttactaggc tgattggaaa ctacaccgac 6000
cacgctgttc gttggtacaa cactggcttg gagcgtgtct ggggtcctga ttctagagat 6060
tggattagat acaaccagtt caggagagaa ttgaccctca cagttttgga cattgtgtct 6120
ctcttcccga actatgactc cagaacctac cctatccgta cagtgtccca acttaccaga 6180
gaaatctata ctaacccagt tcttgagaac ttcgacggta gcttccgtgg ttctgcccaa 6240
ggtatcgaag gctccatcag gagcccacac ttgatggaca tcttgaacag cataactatc 6300
tacaccgatg ctcacagagg agagtattac tggtctggac accagatcat ggcctctcca 6360
gttggattca gcgggcccga attcaccttt cctctctatg gaactatggg aaacgccgct 6420
ccacaacaac gtatcgttgc tcaactaggt cagggtgtct acagaacctt gtcttccacc 6480
ttgtacagaa gacccttcaa tatcggtatc aacaaccagc aactttccgt tcttgacgga 6540
acagagttcg cctatggaac ctcttctaac ttgccatccg ctgtttacag aaagagcgga 6600
accgttgatt ccttggacga aatcccacca cagaacaaca atgtgccacc caggcaagga 6660
ttctcccaca ggttgagcca cgtgtccatg ttccgttccg gattcagcaa cagttccgtg 6720
agcatcatca gggctcctat gttctcttgg atacaccgta gtgctgagtt caacaacatc 6780
atcgcatccg atagtattac tcaaatccct gcagtgaagg gaaactttct cttcaacggt 6840
tctgtcattt caggaccagg attcactggt ggagacctcg ttagactcaa cagcagtgga 6900
aacaacattc agaatagagg gtatattgaa gttccaattc acttcccatc cacatctacc 6960
agatatagag ttcgtgtgag gtatgcttct gtgaccccta ttcacctcaa cgttaattgg 7020
ggtaattcat ccatcttctc caatacagtt ccagctacag ctacctcctt ggataatctc 7080
caatccagcg atttcggtta ctttgaaagt gccaatgctt ttacatcttc actcggtaac 7140atcgtgggtg ttag犯actt tsgtgggact gctggagtga ttatcgacag attcgagttc 了200
attccagtta ctgcaacact cgaggctgaa taagtcgagg taccgagctc gaatttcccc 7260
gatcgttc犯acatttggca at犯agtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 7320
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 7380
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 7440
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataa^t tatcgcgcgc ggtgtc已tct 7500
atgttactag atcgggaatt catcgatgat atcagatctg ccggtctccc tatagtgagt 7560
cgtattaatt tcgataagcc aggttaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 7620
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 7680
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 7740
atcaggggat aacgcagg犯agaacatgtg 3gca^aaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 7800
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 7860
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 7920
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 7980
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 8040
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 8100
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 8160
atcgccBctg gcELgcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 8220
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 8280
ctgcgctctg ctg犯gccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 8340
ac犯accacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 8400
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 8460
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaa^a aggatcttca cctagatcct 8520
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 8580
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 8640
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 8700
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 8760
犯accagcca gccgg犯ggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 8820
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 8880
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 8940
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgc犯aaa 9000
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 9060
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 9120
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 9180
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaacccc 9240
cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgatt tgtagagaga 9300
gactggtgat ttcagcgggc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccg gacgagtgct 9360
ggggcagata agcagtagtg gtggggctac gaacatattc cttttccttc tggacgctac 9420
cactcatatg ttccaaaatt acaaatttgt cctttgtatt tgttgcaatt ttcatgtaag 9480
aaatccaacg aggctctgtt tttttttatt ggccttgttt ggatcctcag agctattaaa 9540
tagccctgca gaatcttact atttaggagt attaaacgta gattaccgac aaaaccgatt 9600
ccataaccct aggctatttt gcaagacaaa tctaatgatg tatattaatc catgattagc 9660
gactgattac tgtagcatca ctgtagcaaa tcatggatta atatacctcg ttagattcgt 9720
ctcgtaaaat agcctatggg ttttgtcatt aatctacgtt taatacttct aaatagcaag 9780attccggagg gctatttaat agccctccgg atccaaacag agccattgat catgtcgacg 9840 gaactctaac ttctcaattt aacttacttt acactttcta tcactttcta ttttcttggt 9900 gtcctaagaa aaccctacat ctttctgggt atatcataat acaagtggat tttctttttc 9%0 cttttttggc aacgctaccc ctgtaaactc agcatagcca tgctgcattt gtgcatgttg 10020 gtatatacac catcatccat gtcagagtac tgtattgcaa aacacatcta ttatctatct 10080 attataatac tacaagtcca ttaaatttcc tacaaacact tctaagctgc cacttggcgc 10140 tctaataaat tagagaaatc aaagaaattc taaggaaaaa gcatatattc taacactttg 10200 catgctacca acaatcgtga aatattatag aacaatttaa tatgttgatt atgctaccat 10260 acatttattc catcctaa犯tat犯acata tttagaaaag tgctaagtca aacattttaa 10320 ctttaattat ttatagtgaa aataaataaa agatcaatca tataaaaatg atattaaata 10380 caatgtcact cttctatcta gaacaattta ttttttataa atataaatat tattagtcaa 10440 agtagtatcc taaagaccgt tccaaaataa aacaaacgta tatttttagg acagaatgtg 10500 gagtgatcta taaacatacg tatctaacaa atagat 1053權利要求
1、一種轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列，其特征是堿基序列如SEQ NO.1所示，由來源于水稻基因組的第1至673個堿基，來源于載體序列的第674至9364個堿基和來源于水稻基因組的第9365至10536個堿基共同組成；由來源于外源插入載體的第1至673個堿基和來源于油菜基因組序列的第674至9364個堿基共同組成的DNA序列，轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體5’端邊界旁側序列；由來源于油菜基因組序列的第674至9364個堿基和來源于外源插入載體的第9365至10536個堿基共同組成的DNA序列，轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體3’端邊界旁側序列；以上所述序列是轉基因水稻TT51-1事件的特征序列，可以用于區分轉基因水稻TT51-1和其他轉基因和非轉基因水稻，以及轉基因水稻TT51-1的定性檢測和定量分析。
2、 按權利要求1所述的轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體旁側序列的應 用，其特征是利用該序列特征設計的轉基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事 件特異性定性PCR檢測方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGMGGAAAAGGAATA 3，和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，；提取樣品總DNA，分別利用TT511G/TT511V 引物組合進行PCR擴增；PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存 在擴增產物，如存在擴增產物則說明樣品中含有TT51-1來源的成分。
3、 按權利要求1所述的轉基因水稻TT51-1事件外源插入載體旁側序列的應 用，其特征是利用該序列特征設計的轉基因水稻外源基因整合事件TT51-1的事 件特異性定量PCR檢測方法合成引物序列如下TT511G: 5， GCGTCCAGAAGGAMAGGMTA 3'和TT511V: 5， AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG 3，； 合成TaqMan探針序列如下TT511P: 5， FAM 一ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG —BHQ1 3，;提取樣品總DNA，分別利用上述引物TT511G/TT511V和探針TT511P組合進行熒光定量PCR擴增；轉基因水稻TT51-1 基因組DNA被相同濃度非轉基因水稻基因組DNA稀釋至不同含量，以20ng的混 和水稻基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應并建立標準曲線；以標準曲線 為參照測定含有TT51-1基因組DNA的混和水稻基因組DNA樣品中TT51-1基因組 DNA的量。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因水稻TT51-1轉化事件外源載體整合位點全序列及其應用，涉及生物工程技術領域中轉基因水稻的安全評估和檢測。本發明以轉基因抗蟲水稻品種TT51-1為材料，提取基因組DNA為模板，分四段擴增出包含旁側水稻基因組序列的TT51-1事件全序列，如SEQ NO.1所示，由來源于水稻基因組的第1至673個堿基，來源于載體序列的第674至9364個堿基和來源于水稻基因組的第9365至10536個堿基共同組成；本發明適用于對轉基因水稻TT51-1(包括親本、雜種F1和后代)及其制品(包括植株、組織、稻谷、大米及其制品)實施檢測、監測和安全管理。
文檔編號C12Q1/68GK101302520SQ20081004824
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月1日 優先權日2008年7月1日
發明者盧長明, 剛 吳, 曹應龍, 均 李, 武玉花, 玲 肖 申請人:中國農業科學院油料作物研究所