專利名稱：一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，特別是涉及脂肪酶基因工程菌的構建 方法。
背景技術：
在能源危機越演越烈的今天，尋找高效、清潔的可再生能源是一項極 為重要和迫切的任務，而利用廢棄動、植物油脂轉化生產生物柴油無疑是 最有效、最直接的辦法。目前生物柴油轉化主要有化學法和酶法兩種，其 中化學法能耗高、污染大；酶法則具有反應條件溫和、無污染等優點，是 解決能源危機的有效途徑。
酶法制備生物柴油的工藝中，脂肪酶的成本最高是制約工藝進一步發 展的主要瓶頸之一，不同來源脂肪酶制備生物柴油的效率和得率也不同。 研究表明洋蔥假單胞菌脂肪酶在眾多脂肪酶中能夠催化的反應類型最多， 反應活性和穩定性最高，對酸、堿、短鏈醇等物質的耐受性最高(Jaeger K E，Eggert T， lipases for biotechnology. 2002)，是生物柴油制備工藝中 最理想的催化酶。然而，洋蔥假單胞菌脂肪酶需要在其本身分子伴侶的幫 助下才能正確表達，它的分泌還和胞內Dsb復合體等十幾個蛋白質有密切 關系，由于缺乏相應的表達和分泌機制，洋蔥假單胞菌脂肪酶的異源表達 往往沒有活性，即便體外復性，效率和產量也非常低。但是脂肪酶產生菌' 本身也存在代謝調控機理不明確、產酶量低、表達不穩定等問題。因此只 有通過分子生物學手段構建洋蔥假單胞菌脂肪酶同源表達菌株才能從根本 上解決上述問題。
T7大腸桿菌表達系統是非常成熟的重組蛋白表達系統，它包括T7 RNA 聚合酶和一個能被T7RNA酶驅動的T7啟動子。該系統嚴格依賴T7 RNA聚 合酶對其特有啟動子T7啟動子的特異選擇性，T7啟動子完全專一受控于 T7 RNA聚合酶(Tabor and Richardson, 1985)，而高活性的T7 RNA聚合
酶合成mRNA的速度比一般RNA聚合酶快5倍，幾乎所有的細胞資源都用于 表達目的蛋白。基于T7RNA聚合酶的專一選擇性和優越轉錄能力，Stidier 等人(Studier,Moffatt, 1986)首先在大腸桿菌BL21 (DE3)中建立起一 套受LacUV5啟動子調控的T7表達系統。該系統在世界范圍內得到非常廣 泛的應用，成為大腸桿菌中高效表達重組蛋白的首選。Elaine等人(Elaine Brunschwig， Aldis Darzins， 1992)在銅綠假單胞菌中利用7ac〃K5/7a79 構建的T7表達系統也得到普遍應用。此外Barnard等人(Barnard et a丄， 2004 )在羅爾斯通氏菌也構建了 T7表達系統。

發明內容
本發明的目的在于提供一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，得 到的基因工程菌具有較高的表達量和催化活力，并且具有較好的低碳醇耐 受性以及耐高溫性。
一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，具體如下
(1) 采用同源重組方法去除洋蔥假單胞菌G63基因組中原有的脂肪酶 基因及其伴侶基因，同時導入T7 RNA聚合酶基因，獲得能夠表達T7 RNA 聚合酶的洋蔥假單胞菌重組菌；
(2) 將目的基因克隆到含有T7啟動子和Lacl阻遏蛋白的表達質粒中；
(3) 將質粒導入洋蔥假單胞菌重組菌，得到洋蔥假單胞菌基因工程菌。 所述步驟(2)中的目的基因為洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴侶基因或者
a淀粉酶基因或者纖維素酶基因。
本發明構建的同源重組菌染色體上原有的脂肪酶及其伴侶基因被T7 RNA聚合酶基因替換，因此同源重組菌沒有任何脂肪酶背景，可以方便應用 于脂肪酶高通量篩選。而表達載體上位于T7啟動子后的脂肪酶基因也受到 Ucl阻遏蛋白的負調控。因此認為，本發明的洋蔥假單胞菌脂肪酶工程菌 是受雙重調控的良好表達系統。
培養該基因工程菌，在菌種密度達到一定程度時，加入相應的誘導物
使脂肪酶基因開始表達并獲得洋蔥假單胞菌脂肪酶。優選分批發酵方法培 養該工程菌，發酵結果顯示工程菌的酶活比原始菌提高4倍以上。
由此可見，本發明構建的工程菌具有較高的表達量和催化活力，并且 具有較好的低碳醇耐受性以及耐高溫性，可以用來大量生產脂肪酶，具有 工業實用性。


圖1為重組菌的生長曲線示意圖。
圖2為基因工程菌的質粒穩定性曲線示意圖。
具體實施例方式
本發明中的目的基因可以是洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴侶基因，或者 a淀粉酶基因或者纖維素酶基因，只要目的基因受T7啟動子調節，都可在
本發明構建的洋蔥假單胞菌重組菌中進行高效表達。下面結合實施例對本 發明作詳細說明。
實例l:脂肪酶基因工程菌的構建。 1、同源重組工程菌的構建 1)相關基因的克隆
采用PCR方法擴增T7RNA聚合酶基因、脂肪酶基因上游區段(同源 重組區段基因1)和脂肪酶基因下游區段(同源重組區段基因2)、 Tmp 抗性基因、脂肪酶及其伴侶基因。 T7 RNA聚合酶基因的引物
上游引物5， CTT CTGCAG ATGAACACGATTAACATCGCT 下游引物5 ， CTTCTGCAG TTACGCGAACGCGAAGTCCGA 同源重組區段基因1的引物
上游引物5， CTTGCGGCCGC AGCATCGCTACGCGCTGAAC
下游引物5， CTTCTGCAG GCATGTTCTCCTGATTATTG
同源重組區段基因2的引物
上游引物5， CTTCTGCAG AGATGTTGCTCGATGGTG
下游引物5， CTTCTCGAG GTGATCTACGTCGGCAGTCT TMP抗性基因的引物
上游引物5， CTTAGATCTCACGAACCCAGTTGACATAAG 下游引物5， CTTAGATCTTTAGGCCACACGTTCAAG
每100uL PCR反應體系為10uL緩沖液，2.5腿ol/L Mg2+ ，上游、 下游引物均為20pmo1， dNTP 0. 2誦ol/L， DNA聚合酶5 U，模板DNA約20 ng (試需要添加5X的DMS0)。
以洋蔥假單胞菌(P.c印acia) G63基因組DNA為模板擴增同源重組區 段基因1和2、脂肪酶及其伴侶基因。同源重組區段基因擴增條件95。C預 變性4分鐘，94。Cl分鐘，53'C45秒，72°C 30秒，30個循環，最后72°C 延伸10分鐘。
以大腸桿菌BL21 (DE3)基因組DNA為模版，擴增T7 RNA聚合酶基因。 擴增條件94。C預變性4分鐘，94。Cl分鐘，54。Cl分鐘，72°C3分鐘，30 個循環，最后72'C延伸10分鐘。
以質粒pBBRlTp為模版，擴增T即抗性基因。擴增條件94力C預變性4 分鐘，94。C30秒，54。C30秒，72。C45秒，30個循環，最后72。C延伸10分 鐘。
2)自殺質粒PJQUDT7Tp的構建
PCR擴增的片段經凝膠純化后與PMD18T載體連接，分別得到如下載體 區段l的上游引物加入NotI酶切位點，下游引物加入PstI酶切位點，PCR 擴增后克隆入PMD18simpleT，得到載體PMD叩。
區段2的上游引物加入Pstl酶切位點，下游加入Xhol酶切位點，PCR 擴增后克隆入PMD18si即leT，得到載體PMDdown。
T7RNA聚合酶基因的上游和下游擴增引物都加入Pstl酶切位點，PCR 擴增后克隆入PMD18si即leT，得到載體PMDT7。
Tmp抗性基因上游和下游擴增引物都加入BglII酶切位點，PCR擴增后 克隆入PMD18si即leT載體，得到載體PMDtp。
將載體PMDup用Notl、 Pstl同時酶切后回收500bp的小片段，同樣PMDdown用Pstl酶、Xho1酶同時酶切回收500bp片段，把得到的兩個500bp 片段用T4 DNA連接酶連接過夜。
取連接產物做模版，同源重組區段基因1上游引物作為上游引物，同 源重組區段基因2下游引物作為下游引物PCR。然后把lOOObp的產物克隆 到PMD18simpleT載體上，得到載體PMDUD。 PMDUD通過Notl酶、Xhol酶同 時酶切后連入自殺質粒PJQ200sk，得到載體PJQUD。用Pstl酶切PMDT7回 收2.7Kb的片段，并將該片段克隆到PJQUD相應的酶切位點中，通過測序 挑選出T7RNA聚合酶基因正向插入的克隆子命名為PJQUDT7。將PMDTp載體 用BglII酶切后，回收純化700bp的片段克隆到PJQUDT7的BglII位點上， 得到PJQUDT7Tp。通過上面的步驟我們把同源重組區段基因1、 T7RNA聚合 酶基因、同源重組區段基因2依次放入PJQ200sk自殺質粒的多克隆位點中 并將質粒的抗性改為Tmp。
3)利用同源重組構建含T7RNA聚合酶基因的洋蔥假單胞菌菌株。 將PJQUDT7Tp導入洋蔥假單胞菌，在抗生素Tmp的作用下只有抗性基 因整合到基因組上的菌株才能存活。然后用10%蔗糖進行第二次篩選，最 終得到兩次交換的T7脂A替換整合型洋蔥假單胞菌。
2、 表達載體的構建
以P. c印acia G63 genome DNA為模板，通過PCR擴增獲得脂肪酶及其 伴侶基因基因。 引物為
上游引物5， AAA GGATCCAGCCAAATCGATGCGTTCCAG
下游引物5， CTTAAGCTTACGCGGCGACACCCGGGTCA
上游引物加入Xbal酶切位點，下游引物加入HindIII酶切位點，PCR 擴增產物用Xbal、 HindIII同時酶切后克隆到表達載體PBBR22b中，得到 PBBR22LipAB。
3、 表達載體轉化洋蔥假單胞菌。
采用電穿孔法，將PBBR22Lipab表達質粒導入含T7RNA聚合酶基因的
洋蔥假單胞菌菌株中，得到脂肪酶表達工程菌。 詳細步驟如下
(1)制備洋蔥假單胞菌感受態細胞-
① 取7ml過夜培養的洋蔥假單胞菌菌液接種于50ml LB—培養基，30 °C培養至0D600二0.8后離心收集菌體。
② 用lmMMgcl2+lraMHEPES溶液清洗菌體2次。
③ 把菌體重懸在0. 8毫升冰冷的lraMMgcl2+lmMHEPES溶液，放置于冰上。
(2)電穿孔細胞
< I >取5 u 1質粒PBBR22Lipab (lug)加到100 u 1洋蔥假單 胞菌感受態細胞中用移液器輕輕地攪拌，并將混合物轉移至0.2 mm的電轉 化杯中。
(II) 把電轉杯上的水分擦掉后放入插槽，然后將插槽轉入電轉化儀。
(III) 選擇模式原核生物，設置參數電壓2400 v ，時間5ns后進行 電擊。電擊后立即添加lml電轉液溫浴2小時。
(IV) 取IOOp 1細胞涂布于氯霉素抗性的平板上28。C培養至有菌落長出。
(V) 用PCR的方法檢測脂肪酶基因是否導入洋蔥假單胞菌中，由此 得到的菌種稱為P.cG63 (T7)。
4、 質粒穩定性檢測
圖1為重組菌的生長曲線，在30。C下重組菌在LB培養基中生物的代時 (G)為30. 3分鐘；從延滯期到穩定期的時間約為9小時。圖2為基因工程 菌的質粒穩定性曲線，重組工程菌經過5次連續轉接培養(每次轉接間隔9 h) 后，質粒保持率為82.6%。可見，該工程菌能夠耐受連續轉接放大培養， 適于規模化生產。
5、 工程菌的搖瓶發酵與酶活測定
將活化后的工程菌接種到種子培養基中制備種子液，然后轉接到發酵 培養基中搖瓶發酵，測定工程菌的發酵酶活力。
以水解橄欖油每分鐘產生1 umol游離脂肪酸所需的酶定義為一個活
力單位(U)。測定采用堿式滴定法測定發酵酶活力。結果顯示，12小時后工
程菌發酵液中即可明顯檢測出酶活，48小時后酶活增加迅速，60小時后脂 肪酶酶活達到最大達到96. 35與原始菌21. 3相比提高4. 5倍。 實例2:重組菌適合于受T7啟動子調節的a -淀粉酶基因的表達
1、 a-淀粉酶基因的獲取
引物
上游引物5， AAAGGATCC ACC ATC CTT CAT GCC TGGA 下游引物5， CTTAAGCTT TTA ATG AGG AAG AGA ACC CGCT 以枯草芽孢桿菌XL-15 genome DNA為模板，經PCR擴增獲得a-淀粉 酶基因。上游引物加入XbaI酶切位點，下游引物加入Hindin酶切位點， PCR擴增產物用Xbal、 HindIII同時酶切后克隆到表達載體pBBR22b中，得 到pBBR22 AMY。
2、 a-淀粉酶表達載體轉化洋蔥假單胞菌。
將pBBR22 AMY表達質粒導入構建的含T7RNA聚合酶基因的洋蔥假單胞 菌菌株中，得到a-淀粉酶表達工程菌。詳細步驟與實例1步驟類似。
經發酵液a -淀粉酶酶活測定，10小時后工程菌發酵液中即可明顯檢測 出酶活，50小時后脂肪酶酶活達到最大達到66. 5與原始菌30. 3相比提高 2倍多。
權利要求
1、一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，具體如下(1)采用同源重組方法去除洋蔥假單胞菌G63基因組中原有的脂肪酶基因及其伴侶基因，同時導入T7 RNA聚合酶基因，獲得能夠表達T7 RNA聚合酶的洋蔥假單胞菌重組菌；(2)將目的基因克隆到含有T7啟動子和LacI阻遏蛋白的表達質粒中；(3)將表達質粒導入洋蔥假單胞菌重組菌，得到洋蔥假單胞菌基因工程菌。
2、如權利要求1所述的一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法， 其特征在于，所述步驟(2)中的目的基因為洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴l 基因或者a淀粉酶基因或者纖維素酶基因。
全文摘要
本發明提供一種洋蔥假單胞菌基因工程菌的構建方法，將T7 RNA聚合酶基因替換洋蔥假單胞菌G63基因組中脂肪酶及其伴侶基因，使T7 RNA聚合酶基因整合到洋蔥假單胞菌基因組中并位于脂肪酶啟動子的調控之下。然后將洋蔥假單胞菌脂肪酶及其伴侶基因克隆到含有T7啟動子和LacI阻遏蛋白的表達質粒中，最后把質粒導入洋蔥假單胞菌重組菌中得到洋蔥假單胞菌脂肪脂肪酶超級工程菌。本發明對洋蔥假單胞菌G63進行基因改造，獲得了的超級工程菌基具有較高的表達量和催化活力，并且具有較好的低碳醇耐受性以及耐高溫性。
文檔編號C12N15/56GK101358195SQ20081004812
公開日2009年2月4日 申請日期2008年6月23日 優先權日2008年6月23日
發明者云 劉, 莉 徐, 楊江科, 彬 賈, 閆云君 申請人:華中科技大學