專利名稱：一種高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的醛縮酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醛縮酶作為催化碳碳原子立體成鍵的酶，可以廣泛的應(yīng)用在有機(jī)化學(xué)合成中，它可以方便的以小分子為起點(diǎn)向大的復(fù)雜分子方向進(jìn)行不對稱催化合成，這個(gè)過程在碳水化合物為底物的反應(yīng)中意義尤為突出。應(yīng)用酶的高區(qū)域選擇性，能夠容易避開對碳水化合物中的活潑的羥基的保護(hù)，更為突出的是在催化碳碳鍵合成的同時(shí)醛縮酶可以引入新的手性中心。正是這種能夠高效引入手性碳原子的能力，使得醛縮酶在藥物分子合成領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，與化學(xué)工藝相比，具有明顯優(yōu)勢，如避免了有毒有害物質(zhì)的使用，合成可在常溫常壓條件下進(jìn)行。從替代傳統(tǒng)化學(xué)合成工藝催化劑的角度，該酶催化的反應(yīng)具有很強(qiáng)的綠色屬性，對傳統(tǒng)化學(xué)工藝的綠色化學(xué)改造有著重要意義，因而該酶具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。該新的醛縮酶與常規(guī)醛縮酶相比具有高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的特性。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種來源于PyrcAaculum calidifontis的醛縮酶基因(DERA)，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示atgctgcatctggtggactttgctctgctgaaaccgtatctgtctatcgaagaggtggtt60
aaaggtgccgaaaaagcggaacgtctgggcgttgcagcgtactgcgttaacccggcttac120
gcggcctacgttaaaccactgctgaaacgtgtaaaactgtgtgtagttgtagatttcccg180
tttggcgcgctgccgacttgggcgcgtgcaggtctggtttctaaactggcggaagtggcg240
gaagaactggacgtggtagctccgatcggcctggttaaatctaaagcatggcgcgaagtg300
cgtcgcgatctgatcagcgtggttggcgcggctggtggtcgcgtggtgaaggtgatcgtt360
gaagaaccgtatctgactgatgaagaacgctacaccctgtacgacatcgttgctgaagcg420
ggtgcacacttcattaagtccagcaccggtttcgctgaagaagcatatgcagcaaaactg480
ggcaacccggttgcgtctaccccagagcgtgctgctgcgattgcccgttatgtaaaagag540
cgtggttacaaactgggtgtgaaaatggctggtggcatccgtaccaaggaacaggcccgt600
gccatcgtggaggcaattggcttcggcgaagacccggcgcgcgtacgtctgggcacctcc660
accccggaggctctggcactcgag684 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO. 1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上
3改變其編碼的氨基酸的功能。 一種高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的醛縮酶，由所述醛縮酶基因編碼。具體的，所述醛縮酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示MetLeuHisLeuValAspPheAlaLeuLeuLysProTyrLeuSerlie
151015
GluGluValValLysGlyAlaGluLysAlaGluArgLeuGlyValAla
202530
AlaTyrCysValAsnProAlaTyrAlaAlaTyrValLysProLeuLeu
354045
LysArgValLysLeuCysValValValAspPheProPheGlyAlaLeu
505560
ProThrTrpAlaArgAlaGlyLeuValSerLysLeuAlaGluValAla
65707580
GluGluLeuAspValValAlaProlieGlyLeuValLysSerLysAla
859095
TrpArgGluValArgArgAspLeulieSerValValGlyAlaAlaGly
100105110
GlyArgValValLysVallieValGluGluProTyrLeuThrAspGlu
115120125
GluArgTyrThrLeuTyrAsplieValAlaGluAlaGlyAlaHisPhe
130135140
lieLysSerSerThrGlyPheAlaGluGluAlaTyrAlaAlaLysLeu
145150155160
GlyAsnProValAlaSerThrProGluArgAlaAlaAlalieAlaArg
165170175
TyrValLysGluArgGlyTyrLysLeuGlyValLysMetAlaGlyGly
180185190
lieArgThrLysGluGlnAlaArgAlalieValGluAlalieGlyPhe
195200205
GlyGluAspProAlaArgValArgLeuGlyThrSerThrProGluAla
210215220
LeuAlaLeuGlu
225
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，上述結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)具有很好的高表達(dá)->嗜熱、高酶活力的特性
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQID NO. 2所示氨基酸序列的多狀
或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。本發(fā)明還涉及一種含有所述醛縮酶基因的重組載體，以及所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應(yīng)用。具體的，所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛縮酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(通常以IPTG為誘導(dǎo)劑)，培養(yǎng)液分離得到含有重組醛縮酶的菌體細(xì)胞。本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，在已知該核苷酸序列和氨基酸序列的情況下，該核苷酸序列和氨基酸序列的獲得，以及相關(guān)載體、宿主細(xì)胞的獲得，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。本發(fā)明的高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的醛縮酶可按如下方法獲得1、DERA基因全長的cDNA合成與克隆根據(jù)DERA基因的核苷酸序列，進(jìn)行全基因合成，獲得SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的醛縮酶基因。2、含目的基因的表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟1得到的醛縮酶基因克隆至中間載體。3、將步驟2得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌(Escherichiacoli)BL 21，在適合表達(dá)醛縮酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。4、從步驟3的培養(yǎng)物中分離出醛縮酶。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應(yīng)用，該醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環(huán)保，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為Pyrobaculum calidifontis的酸縮酶表達(dá)結(jié)果(M :marker ；2 全菌體蛋白；3 =DERA)。圖2為DERA裂解2_脫氧-D-核糖_5_磷酸酯反應(yīng)中NADH在340nm處吸光值變化曲線。圖3為不同溫度下DERA的相對活力。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 :DERA基因全長的cDNA合成與克隆根據(jù)NCBI中的來自Pyrobaculum calidifontis的DERA基因的核苷酸序列，交上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成，成功獲得SEQ ID NO. 1所示核苷酸的序列。根據(jù)PyrcAaculum calidifontis的DERA基因編碼序列(SEQ ID N0. 1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便表達(dá)載體。以基因合成的產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將PyrcAaculum calidifontis的DERA克隆至中間載體pET303/CT (購自hvitrogen公司)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入 E. Coil BL21 中，得到工程菌 E. Coil BL21/pET 303 CT/DERA。
實(shí)施例2 =DERA蛋白的表達(dá)將實(shí)施例1 中獲得的 E. Coil BL21/pET 303 CT/DERA 在含 IOOmLlOO μ g/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)。將IOml過夜培養(yǎng)后的菌液倒入IL 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到菌液0D_達(dá)到0. 6 0. 8時(shí)加入IPTG終濃度為0. 5mM, 誘導(dǎo)1 后，離心收集菌體，菌體用25ml磷酸緩沖液pH7. 4使其重懸浮，超聲破碎細(xì)胞。離心取上清，含DERA的上清用0. 22 μ m醋酸纖維素濾膜過濾后鎳柱親和層析進(jìn)行純化獲得DERA 021純酶。綜合BCA法測定DERA酶濃度數(shù)據(jù)，LB培養(yǎng)基中DERA酶的表達(dá)量達(dá)到約220mg/L(圖1)，單位培養(yǎng)液酶的表達(dá)量較高。實(shí)施例3 =DERA的高酶比活力本發(fā)明以2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯為底物，室溫條件下，DERA催化裂解一分子底物解得到一分子三磷酸甘油醛，其在NADH及丙糖磷酸異構(gòu)酶存在的情況下，被甘油三磷酸脫氫酶催化，每一分子三磷酸甘油醛被催化消耗一分子NADH。通過測量NADH在340nm波長的UV吸收來檢測動力學(xué)曲線以分析測定DERA的天然底物分解活性。一分子NADH的消耗對應(yīng)一分子2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯的分解。具體操作如下用IOOmM咪唑鹽酸緩沖液(pH8. 0)溶解DERA配成酶液，加入至底物的混合溶液(0. ImM NADH，0. 4mM 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯，llU/mL丙糖磷酸異構(gòu)酶，4U/mL甘油三磷酸脫氫酶)，測定340nm處吸光值，每秒測定一次。根據(jù)曲線前100秒的數(shù)據(jù)計(jì)算出NADH吸光值變化的速率為-0. OSOmin-1 (圖2)。一次反應(yīng)所用酶量為5 μ L，酶濃度經(jīng)BCA法測定為20ng/y L，根據(jù)以上數(shù)據(jù)最終得出DERA的比酶活力為24. 12U/mg，具有較高的酶比活力。實(shí)施例4 =DERA的嗜熱性以實(shí)施例3 中反應(yīng)體系為準(zhǔn)，分別在 20°C，30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C，100°C下測定DERA的酶分解活力。以測得的DERA分解活力最高值為100%，得到各個(gè)溫度下DERA相對分解活力。如圖2所示，結(jié)果表明來自Pyrobaculum calififontis的DERA酶在70°C時(shí)分解活力最高，具有嗜熱性。
權(quán)利要求
1.一種來源于PyrcAaculum calidifontis的醛縮酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的醛縮酶，由權(quán)利要求1所述醛縮酶基因編碼。
3.如權(quán)利要求2所述的醛縮酶，其特征在于所述醛縮酶氨基酸序列如SEQID NO. 2所
4.一種含有權(quán)利要求1所述醛縮酶基因的重組載體。
5.一種用權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6.如權(quán)利要求1所述的醛縮酶基因在制備重組醛縮酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述醛縮酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組醛縮酶的菌體細(xì)胞。
全文摘要
一種高表達(dá)、嗜熱、高酶活力的醛縮酶及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了涉及一種醛縮酶，以及編碼該醛縮酶的基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。所述來源于Pyrobaculum calidifontisi的醛縮酶基因(DERA)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述醛縮酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述醛縮酶可用于2，4，6-三脫氧己糖化合物的合成，綠色環(huán)保，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/60GK102559723SQ20121006404
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者杜鵬飛, 王秋巖, 謝恬 申請人:杭州師范大學(xué)