專利名稱：一種β-羥基丁酸與β-羥基戊酸的共聚酯降解菌株及其選育方法
技術領域：
本發明屬于生物材料，具體涉及一種可降解phbv( e -羥基丁酸與e -羥基戊酸的共聚酯) 的菌株以及該菌株的選育方法。
背景技術：
隨著人類環保意識的加強，促使許多國家十分重視可降解塑料的研究與開發，各種可降 解塑料不斷問世。目前已研究開發的生物降解聚合物主要是天然高分子、微生物合成高分子和人工合成高分子3大類。在眾多可降解塑料中，完全生物可降解塑料作為治理或減輕一次 性塑料廢棄物對環境造成污染的根本措施備受各國青睞。以3-羥基垸酸 (Polyhydroxyalkanoates. PHAs)為原料制造的新型塑料開發前景十分樂觀。由微生物發酵制得的脂肪族聚酯PHBv(e-羥基丁酸與e-羥基戊酸共聚物)將聚羥基戊酸(poly-P-hydroxyvalerate， PHV)弓I入聚e-羥基丁酸(poly-P -hydroxybutyrate， PHB)主 鏈，形成PHBV共聚物，由PHB和1 24 。/。PHV組成，可改善PHB的粘度小，脆度高的缺點。隨著phbv中e-羥基戊酸組分的增加，聚合物的勁度降低而韌性增加，且共聚物的熔點隨e-羥基戊酸組分的增加而降低，使其較易進行熱加工處理。phbv可在較低的溫度下加工塑形， 避免了PHB的熱降解問題。P朋V可通過微生物酶解和水解作用而發生降解，可廣泛用于生產 醫藥材料和包裝材料而不會對環境造成污染。直接以從自然界中篩選的菌種降解KfflV的速度比較慢，產生的raBv解聚酶的活性也比 較低。本發明是通過對可降解PHB的菌株進行紫外誘變，獲得具有能穩定遺傳的降解PHBV特 性的突變株。PHBV可被本發明的菌株產生的PHBV解聚酶水解而發生降解，產物為e-羥基丁 酸。菌株可應用于phbv材質的塑料制品的生物降解。發明內容本發明的目的是提供一種可降解phbv(e-羥基丁酸與e-羥基戊酸的共聚酯)的菌株及 其選育方法。本發明對可降解P朋的青霉菌株(已公開)進行紫外誘變處理，獲得具有降解PHBV能 力的變異菌株。將具有降解PHB能力的青霉菌株接種到固體斜面培養基(組分為fflBV 0. 15%， MgS04 7H20 0.05%， NH4C12 0.1%， CaCl2.2H20 0.0005%， KH2P04 0.554%， Na2HP04 12H20 1.194%，瓊脂2%， pH 6.8)上，培養至出現大量分生孢子；以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，使分生孢子分散。顯 微鏡檢査，使孢子濃度為106 107個/ml。滅菌平皿中裝入分生孢子懸液，在磁力攪拌下用紫外燈照射，處理后的懸液在無菌室紅 燈照射下適當稀釋；取上述懸液涂布于固體平板培養基上，避光培養數日，選取單菌落，點植法培養，觀察 并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選水解透明圈較大的菌株；根據初篩結果，從固體平板培養基平皿中挑取需要的單菌落接入固體斜面培養基(組分 同上)，待長滿后接入液體培養基(組分為PHBVO. 15%，MgS04 7H20 0. 05%，NH4C12 0. l%，CaCl2'2H20 0.0005%， KH2P04 0 . 5 54%， Na2HP0412H20 1. 194%， pH6.8)中，搖瓶培養，檢測發酵液中WffiV 解聚酶的活力。采用紫外誘變篩選到的青霉(尸朋J'c^7i"瓜sp) DS9702-D10-06具有很強的PHBV降解能 力。菌株在液體培養基中，28。C搖瓶培養120h，其PHBV解聚酶的酶活力可達7 8U/ml。對 DS9702-D10-06菌株的PHBV降解產物進行質譜分析，結果如圖2所示。在圖中出現的明顯的 分子量為104的質譜峰，對應的是PHB單體，即e-羥基丁酸。說明青霉(尸e加'c^ii"瓜sp) DS9702-D10-06對PHBV的產物為P -羥基丁酸。PHBV降解菌株的菌落顏色為灰綠色，氣生菌絲為松絮狀，形狀為菌絲體，營養菌絲為 無色；菌絲有橫隔膜，分生孢子梗頂端有不對稱帚狀分枝，分生孢子為橢圓形。具體分生孢 子梗的帚狀分枝和分生孢子形態見圖1。


圖1為菌株的帚狀枝及分生孢子圖2為菌株對P朋V降解的產物的質譜分析圖本發明的可降解raBV的微生物是屬于青霉屬(尸e加'cj7""瓜)的菌種，青霉(尸e加'cj7"'"瓜 sp) DS9702-D10-06，巳于2008年1月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京朝陽區大屯路)保藏，保藏號為CGMCC No. 2345。
具體實施方式
將具有降解PHB能力的青霉菌株接種到固體斜面培養基上，28。C培養6天至出現大量分 生孢子。以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，28。C振蕩15min，使分生孢 子分散。顯微鏡檢查，使孢子濃度為106 107個/1111。滅菌平皿中裝有5ml分生孢子懸液，在磁力攪拌下用紫外燈(30W，照射距離10cm)照 射，照射時間為2(T80s，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋。取上述懸液0.2ml涂布于固體平板培養基上，避光培養3天，選取單菌落，點植法培養， 觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小。初步篩選合適菌株。根據初篩結果，從固體平板培養基平皿中挑取需要的單菌落接入固體斜面培養基，待長 滿后接入液體培養基中，28'C搖瓶培養120 h，檢測發酵液中PHBV解聚酶的活力。fflBV解聚酶酶活的測定(比濁法)將PHBV粉末溶于氯仿中，所得溶液與十二烷基磺酸鈉溶液混合，混合液經超聲波處理 5min，制得PHBV乳化液，75。C加熱90min除去氯仿，得到PHBV乳化液。以PHBV懸浮液為底物用分光光度法測定PHBV解聚酶的活力，取3ml PHBV乳化液置于 4(TC的恒溫水浴中，待平衡后加入粗酶液lml，反應一定時間(2(T30min)后，于650nm波 長下測其吸光值。1個酶活單位定義為每分鐘引起光吸收率降低0. 001 (A650nm)單位所需的 酶量。
權利要求
1、一種β-羥基丁酸與β-羥基戊酸的共聚酯降解菌株的選育方法，其特征是將具有降解PHB能力的青霉菌株接種到固體斜面培養基上，該固體斜面培養基組分為PHBV 0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl2 0.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O 1.194％，瓊脂2％，pH 6.8，培養數日至出現大量分生孢子；以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，使分生孢子分散，顯微鏡檢查，使孢子濃度為106~107個/ml；分生孢子懸液裝在滅菌平皿中，在磁力攪拌下用紫外燈照射，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋；取上述懸液涂布于固體平板培養基上，避光培養數日，選取單菌落，點植法培養，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選水解透明圈較大的菌株；根據初篩結果，從固體平板培養基平皿中挑取需要的單菌落接入上述固體斜面培養基，待長滿后接入液體培養基中，該液體培養基組分為PHBV 0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl20.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O 1.194％，pH 6.8，搖瓶培養。
2、 按權利要求i所述的一種e-羥基丁酸與e-羥基戊酸的共聚酯降解菌株的選育方法，其特征是將具有降解PHB能力的青霉菌株接種到固體斜面培養基上，該固體斜面培養 基組分為PHBV 0. 15%, MgS04 7H20 0 . 05%， NH4C12 0.1%， CaCl2 2H20 0. 0005%， KH2P04 0. 554%， Na2HP0412H20 1.194%，瓊脂2%， pH 6.8， 28'C培養5~7天至出現大量分生孢子;以無菌水沖洗，將分生孢子沖洗入裝有玻璃珠的三角瓶中，28'C振蕩15min，使分生孢 子分散，顯微鏡檢査，使孢子濃度為1(Tl07個/ml;滅菌平皿中裝有5ral分生孢子懸液，在磁力攪拌下用30W紫外燈照射，照射距離10cm， 照射時間為2(T80s，處理后的懸液在無菌室紅燈照射下適當稀釋；取上述懸液0.2ml涂布于固體平板培養基上，避光培養2 3天，選取單菌落，點植法培 養，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選合適菌株；根據初篩結果，從固體平板培養基平皿中挑取需要的單菌落接入固體斜面培養基，培養 基組分同上，待長滿后接入組分為PHBV 0.15%， MgS04 7H20 0 . 05%, NH4C12 0.1%， CaCl22H20 0. 0005%， KH2P04 0. 554%， Na2HP04'12H20 1. 194%， pH 6, 8液體培養基中，28。C搖瓶培養120 h。
3、 按權利要求i所述的選育方法選育的e-羥基丁酸與e-羥基戊酸的共聚酯降解菌株，該菌株為青霉(Penicillium. sp) DS9702-D10-06，已于2008年1月16日在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址北京朝陽區大屯路，保藏號為CGMCC No. 2345。
全文摘要
本發明屬于生物材料，具體涉及一種可降解PHBV(β-羥基丁酸與β-羥基戊酸的共聚酯)的菌株以及該菌株的選育方法本發明對可降解PHB的青霉菌株進行紫外誘變處理，即接種到固體斜面培養基上培養、沖洗、振蕩、磁力攪拌下用紫外燈照射、涂布于固體平板培養基上，避光培養，選取單菌落，點植法培養，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈的大小，初步篩選、單菌落接入固體斜面培養基、搖瓶培養。篩選到的青霉(Penicillium.sp)DS9702-D10-06具有很強的PHBV降解能力。其PHBV解聚酶的酶活力可達7~8U/ml。
文檔編號C12R1/80GK101245365SQ200810050490
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月11日 優先權日2008年3月11日
發明者巖 王, 王戰勇, 趙明明, 珊 陳 申請人:東北師范大學