專利名稱：氨基酸材料的非病毒基因載體的制備方法
技術領域：
本發明涉及一類非病毒基因治療的載體，具體是涉及一類修飾性氨基酸材料作為非病毒 基因治療的載體。
技術背景聚氨基酸材料由于可生物降解性，低毒性等特點，作為非病毒性基因載體材料而被廣泛地 研究。其中研究較多的有聚賴氨酸，聚天冬氨酸，聚鳥氨酸，聚谷氨酸等。聚氨基酸材料具 有相對明確的分子結構，這是因為它是氨基酸單體通過分子間脫水形成肽鍵而得到的。聚賴 氨酸在生理條件下帶有正電荷，可以通過靜電吸引結合DNA。聚天冬氨酸具有酰亞胺環狀結 構，可被堿性試劑開環，因此可通過開環反應接合各種功能性的基團，具有很強的改造性， 從而增加新的功能。基因藥物治療是近二十年來興起的新型治療方法，其基本策略是將外源基因通過各類載 體導入目的細胞并得到有效表達，從而達到治療疾病的目的。在基因藥物釋放體系中，載體 的研究始終是研究的熱點。目前普遍應用的病毒載體介導系統，雖然其有很高的基因轉染效 率，但高的細胞毒性、較低的靶向性、DNA攜帶能力的限制性、生產包裝及高價格等問題限 制了病毒載體的應用范圍，尤其是1999年，美國基因治療臨床實驗因使用腺病毒載體導致 "Jesse Gelsinger"死亡事件，使研究者在病毒類載體的臨床使用上更為謹慎。相反，非病 毒性轉基因載體具有免疫反應低，安全性能高，易于人工合成等特點，在基因藥物的研究中 曰益受到重視。隨著人類基因組框架圖的解析成功，更多的基因藥物從實驗室研究所階段進 入臨床實用階段。非病毒型基因載體存在著毒性、生物相容性、降解性等問題，目前有一種合成的材料聚 乙烯亞胺(PEI)，實驗發現分子量22000—25000的聚乙烯亞胺轉染效率非常高，但是存在毒 性和降解性的問題，小分子量(600， 1200， 2000)的聚乙烯亞胺毒性小，易于在生物體內代 謝，但是幾乎沒有轉染效率。Kim課題組報導了 (Kazuyoshi Sagara and Sung Wan KimJournal of Controlled Release, Volume 79， Issues 1-3， 19 February 2002， Pages 271-281)用低分子量聚乙烯亞胺修飾 聚乙二醇提高聚乙烯亞胺的轉染效率，降低聚乙烯亞胺的毒性；ChoiYH課題組報導(ChoiY H, Liu F, Choi J S, et al. Human Gene Therapy, Volume 10， Issues 16， November 1999, Pages 2657-2665)聚L 一賴氨酸可通過靜電吸引與DNA自動結合。由于其良好的DNA壓縮能力，可以有效地保護 DNA防止被核酸酶降解，已經被廣泛地應用于基因載體材料。Mousazadeh M (Mousazadeh M,Palizban A， Saiehi R， Saiehi M. Journal of Drug Targeting, Volume 15， Issues 3, 2007, Pages 226-230)報導了聚賴氨酸結合轉脂蛋白-E-衍生肽，作為針對腦細胞的基因載體材料。 發明內容本發明目的是提供一類新型的非病毒基因治療的載體。本發明以聚氨基酸材料為骨架，用 氨基丙醇等堿性試劑對聚氨基酸環進行開環，然后用特殊的連接試劑進行修飾，連接不同分 子量的聚乙烯亞胺作為新型非病毒基因治療的載體。其優點在于修飾后的聚氨基酸材料具有 可生物降解、低毒性和高的基因轉染效率。本發明提供的聚氨基酸的修飾方法，總的發明構思是由氨基酸單體經縮聚反應得到聚 氨基酸，經氨基醇試劑對聚氨基酸側基開環后，再用連接試劑進行結構修飾，通過活化氨基 醇上的活潑羥基，連接聚乙烯亞胺(PEI)，經透析冰凍干燥，獲得聚氨基酸一氨基醇與聚乙 烯亞胺的功能性復合材料。反應式如下<formula>formula see original document page 6</formula>反應式中n為氨基酸單元結構數量，其大小與聚氨基酸的分子量相關。 反應式中ml， m2為開環單元結構的個數，ml和m2的數值與聚氨基酸-氨基醇聚合物的分子 量有關，m,為PEI中伯氨基單元的數量，m2為仲氨基單元的數量，ra,和ni2的數值與PEI的分子 量有關,X為氨基醇試劑中亞甲基個數，數值乂=2-12。反應式中結構(l)為聚氨基酸，結構(2)為用氨基醇試劑開環后的聚氨基酸-氨基醇聚合 物，結構(3)為用活化試劑R活化的聚氨基酸-氨基醇聚合物，結構(4)為最終產物聚氨基 酸-氨基醇-PEI聚合物。本發明提供的聚氨基酸材料的修飾方法，包括如下步驟1) 聚氨基酸材料的合成氨基酸單體在磷酸催化下，在160-180°C、真空減壓到3mmHg條件 下，脫水反應2小時，移去真空泵，趁熱加入N，N—二甲基甲酰胺(DMF)，使固體物充分 溶解，將反應液逐滴加入到蒸餾水中，得白色片狀物沉淀，過濾，用蒸餾水洗至中性，干 燥，得到聚氨基酸材料。2) 聚氨基酸材料連接側基得到開環的聚氨基酸將制備的聚氨基酸材料，溶于N，N—二甲基 甲酰胺中，在冰浴下滴加氨基醇試劑，室溫反應3-4小時，將反應液逐滴加入到正丙醇中， 析出沉淀，用丙酮洗滌，抽濾得固體，固體置于圓底燒瓶中，用水泵抽3小時，再用油泵 抽至完全千燥，得到聚氨基酸一氨基醇聚合物。3) 對開環的聚氨基酸進行功能基團的修飾取干燥的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶于二甲基亞 砜中，將活化試劑R溶于二甲基亞砜中，在氮氣保護下，加入聚氨基酸一氨基醇聚合物溶 液中，邊加邊攪拌，加完后在室溫下反應3小時，獲得活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶 液；4) 將聚乙烯亞胺溶于二甲基亞砜中，加入三乙胺作為催化劑，避光、氮氣保護、室溫下加入 到活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液中，邊底加邊攪拌，3-4小時內加完，加完后避光、 室溫下繼續反應12小時，將反應完成的溶液經透析、冰凍、干燥、獲得聚氨基酸一氨基醇 -聚乙烯亞胺的功能性復合材料。本發明所述的聚氨基酸為聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚賴氨酸、天冬氨酸一谷氨酸共聚 物、天冬氨酸一賴氨酸共聚物、谷氨酸一賴氨酸共聚物中仟一種。分子量分布為10000-1100000。本發明所述的氨基醇試劑為氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇、氨基己醇、氨基庚醇、氨基辛醇、氨基壬醇、氨基癸醇中任一種。本發明所述的活化羥基的連接劑為N，N'-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰 基咪唑、N,N'-二琥拍酰亞胺基硫酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺氯甲酸酯中任一種。本發明所述聚乙烯亞胺分子量為432Da (直鏈型)、600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa的聚乙烯亞胺中任一種。本發明所述的連接劑用量與聚氨基酸一側基聚合物重量比為0. 5—2倍量。 本發明所述的聚氨基酸一側基聚合物用量與二甲基亞砜的重量體積比為10-20倍量。 本發明所述的連接劑用量與二甲基亞砜的重量體積比為3-10倍量。 本發明所述的催化劑為三乙胺,用量與小分子量聚乙烯亞胺重量體積比為0.01-0.05倍且 里。本發明的技術效果本發明采用的聚氨基酸材料由于可生物降解性，低毒性等特點，作為非病毒性基因載體 材料而被廣泛地研究。它具有相對明確的分子結構，這是因為它是氨基酸單體通過分子間脫水形成肽鍵而得到的。聚賴氨酸在生理條件下帶有正電荷，可以通過靜電吸引結合DNA。聚 天冬氨酸具有酰亞胺環狀結構，可被堿性試劑開環，因此可通過開環反應接合各種功能性的 基團，具有很強的改造性，從而增加新的功能。本發明采用的聚乙烯亞胺PEI，具有3種不同的氨基形式，形成了不同的緩沖體系，氨 基的存在基本作用是結合DNA，擴展的功能是在攜帶DNA進入細胞時不同的氨基組合成不同 的緩沖對，能保護DNA免遭細胞質中的溶酶體降解。本發明聚氨基酸一側基聚合物用連接劑處理后，連接聚乙烯亞胺。所用的連接劑具有特 殊的結構，能修飾側基上的羥基，活化后連接的聚乙烯亞胺保留原先的結構和功能。本發明對經縮聚反應得到的聚氨基酸進行結構修飾，該修飾方法優點在于簡單高效，回 收率高，經活化的羥基可以連接任何具有活性氫分子的化合物，因此對修飾性聚氨基酸材料 的作用擴展具有非常重要的意義。經活化側基上的活潑羥基后，連接聚乙烯亞胺，賦予聚氨 基酸新的生物學功能，使其具有低毒性，高基因轉染效率，且可生物降解。成為非病毒性基 因載體材料中的一類高分子化合物。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明進行樣細的描述，但不限于實施例所公開的內容。實施例l:以聚天冬氨酸為例。1)聚天冬氨酸一亞氨基丙醇聚合物的制備10g天冬氨酸在85%磷酸的催化下，在160-18(TC、真空減壓到3mmHg條件下，脫水反應 2h。移去真空泵，趁熱加入N,N—二甲基甲酰胺(DMF)，使固體物充分溶解，將反應液 逐滴加入到500毫升蒸餾水中，得白色片狀物沉淀，過濾，用蒸餾水洗至中性，干燥， 得到聚氨基酸6.8克。*取聚天冬氨酸3克，溶解于20毫升DMF中，冷卻，冰浴下滴加7毫升3-氨基丙醇，'室溫攪拌反應4小時，將反應液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗滌，抽 濾得固體。固體置于圓底燒瓶中，用水泵抽3h，再用油泵抽至完全干燥，得到聚天冬氨 酸一亞氨基丙醇聚合物。 2)聚天冬氨酸一亞氨基丙醇聚合物的修飾*取步驟1中得到的聚天冬氨酸一亞氨基丙醇聚合物0. 5克，溶解于6毫升DMF中。取N，N，-羰基二咪唑0. 7克，溶解于2. 5毫升二甲基亞砜(DMSO)中，在氮氣保護、避光條件下加 入至聚合物溶液中，邊加邊攪拌，反應3小時，得到活化的聚合物。*取分子量600的聚乙烯亞胺1.75克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2tnl三乙胺作為 催化劑，避光、氮氣保護下加入到活化的聚合物溶液中，邊加邊攪拌，3小時內加完，加 完后繼續避光反應12小時。*將反應完成的溶液裝入截留分子量為15000的透析袋中，透析48小時，取袋內溶液冰凍 干燥。實施例2:以谷氨酸為例，合成聚谷氨酸，合成過程與實例l相同。取聚谷氨酸3克，溶于18毫升DMF中，冷卻，冰浴下滴加5毫升3-氨基乙醇，室溫攪拌 反應4小時，將反應液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗滌，抽濾得固體。 固體置于圓底燒瓶中，用水泵抽3h,再用油泵抽至完全干燥，得到聚谷氨酸一亞氨基乙醇聚 合物。取聚谷氨酸一亞氨基乙醇聚合物0.5克，溶解于6毫升二甲基亞砜(DMSO)中。取苯并三 唑碳酸酯0.8克，溶解于4毫升DMS0中，在氮氣保護、避光條件下加入至聚合物溶液中，邊 加邊攪拌，反應3小時，得到活化的聚合物。取分子量600的聚乙烯亞胺1.7克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2ml三乙胺作為催 化劑，避光、氮氣保護下加入到活化的聚合物溶液中，邊加邊攪拌，3小時內加完，加完后 繼續避光反應12小時。將反應完成的溶液裝入截留分子量為15000的透析袋中，透析48小時，取袋內溶液冰凍干燥。 實施例3:以賴氨酸為例，合成聚賴氨酸，合成過程與實例l相同。取聚賴氨酸3克，溶于18毫升DMF中，冷卻，冰浴下滴加8毫升3-氨基戊醇，室溫攪拌 反應4小時，將反應液逐滴加入到100毫升正丙醇中，析出沉淀，用丙酮洗滌，抽濾得固體。固體置于圓底燒瓶中，用水泵抽3h，再用油泵抽至完全干燥，得到聚賴氨酸一亞氨基戊醇聚合物。取聚賴氨酸一亞氨基戊醇聚合物0.5克，溶解于6毫升二甲基亞砜(DMSO)中。取N-羥 基琥珀酰亞胺氯甲酸酯1. 0克，溶解于5毫升DMSO中，在氮氣保護、避光條件下加入至聚合 物溶液中，邊加邊攪拌，反應3小時，得到活化的聚合物。取分子量600的聚乙烯亞胺1.7克，溶解于6毫升的DMS0中，加入0. 2ml三乙胺作為催 化劑，避光、氮氣保護下加入到活化的聚合物溶液中，邊加邊攪拌，3小時內加完，加完后 繼續避光反應12小時。將反應完成的溶液裝入截留分子量為15000的透析袋中，透析48小時，取袋內溶液冰凍 干燥。
權利要求
1、一種氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是由氨基酸單體經縮聚反應得到聚氨基酸，經氨基醇試劑對聚氨基酸側基開環后，再用連接試劑進行結構修飾，通過活化氨基醇上的活潑羥基，連接聚乙烯亞胺，經透析冰凍干燥，獲得聚氨基酸-氨基醇與聚乙烯亞胺的功能性復合材料，反應式如下反應式中n為氨基酸單元結構數量，n的值與聚氨基酸的分子量相關；m1，m2為開環單元結構的個數，m1，m2的值與聚氨基酸-氨基醇聚合物分子量有關；m1為PEI中伯氨基單元的數量，m2為仲氨基單元的數量，m1和m2的數值與PEI的分子量有關；X為氨基醇試劑中亞甲基個數，數值X＝2-12；結構(1)為聚氨基酸，(2)為開環后的聚氨基酸-氨基醇聚合物，(3)為用活化試劑R活化的聚氨基酸-氨基醇聚合物，4)為最終產物聚氨基酸-氨基醇-PEI聚合物。
2、 根據權利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述反應 步驟如下1) 聚氨基酸材料的合成氨基酸單體在磷酸催化下，在160-180'C、真空減壓到3ramHg條件 下，脫水反應2小時，移去真空泵，趁熱加入N，N—二甲基甲酰胺，使固體物充分溶解， 將反應液逐滴加入到蒸餾水中，得白色片狀物沉淀，過濾，用蒸餾水洗至中性，干燥，得 到聚氨基酸材料；2) 聚氨基酸材料連接側基得到開環的聚氨基酸將制備的聚氨基酸材料，溶于N,N—二甲基 甲酰胺中，在冰浴下滴加氨基醇試劑，室溫反應3-4小時，將反應液逐滴加入到正丙醇中， 析出沉淀，用丙酮洗滌，抽濾得固體，固體置于圓底燒瓶中，用水泵抽3小時，再用油泵 抽至完全干燥，得到開環產物聚氨基酸一氨基醇聚合物；3) 對開環產物進行功能基團的修飾取干燥的聚氨基酸一側基聚合物溶于二甲基亞砜中，將 活化試劑溶于二甲基亞砜中，在氮氣保護下，加入的聚氨基酸一側基聚合物溶液中，邊加邊攪拌，加完后在室溫下反應3小時，獲得活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液；4) 將聚乙烯亞胺溶于二甲基亞砜中，加入三乙胺作為催化劑，避光、氮氣保護、室溫下加入 到活化的聚氨基酸一氨基醇聚合物溶液中，邊底加邊攪拌，3-4小時內加完，加完后避光、 室溫下繼續反應12小時，將反應完成的溶液經透析、冰凍、干燥、獲得聚氨基酸-氨基醇-聚乙烯亞胺的功能性復合材料。
3、 根據權利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述的聚氨基酸為聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚賴氨酸、天冬氨酸一谷氨酸共聚物、天冬氨酸一賴氨酸共聚物、谷氨酸一賴氨酸共聚物中任一種，分子量分布為10000-1100000 Da。
4、 根據權利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述的氨 基醇試劑為氨基乙醇、氨基丙醇、氨基丁醇、氨基戊醇、氨基己醇、氨基庚醇、氨基辛 醇、氨基壬醇、氨基癸醇中任一種。
5、 根據權利要求2所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述活化 羥基的連接劑為N，N，-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、氯甲酸酯、羰基咪唑、N,N，-二琥 珀酰亞胺基硫酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺氯甲酸酯中任一種。
6、 根據權利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述聚乙 烯亞胺分子量為直鏈型432Da、支鏈型600Da、 1200Da、 2000Da、 25kDa的任一種。
7、 根據權利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述連接 劑用量與聚氨基酸一側基聚合物重量比為0. 5-2倍量。
8、 根據權利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述聚氨 基酸一側基聚合物用量與二甲基亞砜的重量體積比為10-20倍量。
9、根據權利要求1所述的氨基酸材料的非病毒基因治療載體的制備方法，其特征是所述連接 劑用量與二甲基亞砜的重量體積比為3-10倍量。
全文摘要
一種提供的聚氨基酸的修飾方法，由氨基酸單體經縮聚反應得到聚氨基酸，經氨基醇試劑對聚氨基酸側基開環后，再用連接試劑進行結構修飾，通過活化氨基醇上的活潑羥基，連接聚乙烯亞胺(PEI)，經透析冰凍干燥，獲得聚氨基酸—氨基醇與聚乙烯亞胺的功能性復合材料，具有低毒性，高基因轉染效率，且可生物降解。成為非病毒性基因載體材料中的一類高分子化合物。
文檔編號C12N15/64GK101225399SQ200810059348
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優先權日2008年1月25日
發明者海 余, 峻 周, 湯谷平, 王青青, 丹 陳 申請人:浙江大學