專利名稱：利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法
利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法技術領域 本發(fā)明涉及一種微生物的鑒定方法，具體涉及利用分子 標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
猴頭菇(f/er/"^m w/"""^)猴頭菇是著名的八大山珍之 一，與燕窩、魚翅、海參并列為四大名肴。傳統(tǒng)中醫(yī)認為猴頭菇性平、 味甘，有助消化、利五臟、潤六肺的功能和補虛損的功效，能提高人體免 疫能力，對慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍等多種消化道疾病和神經衰 弱均有較好療效。猴頭菇營養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪，富含人體必 需的多種氨基酸、多肽、多糖和脂肪族的酰胺物質及多種維生素的優(yōu)良保 健食品。我國食用菌資源豐富，品種比較多，近年來,由于菌種管理制度不健全, 致使猴頭菇菌種混亂,出現同名異物、同物異名的現象。大量的混淆不清的 菌種名稱不但使產業(yè)技術無從規(guī)范,也使我國近10年來幾乎沒有按食用菌 育種技術規(guī)范選育出的優(yōu)良品種。而大量使用的多數是十幾年前選育的未 經系統(tǒng)篩選和測試的組織分離物。這些非品種的菌種又常被冠以新名,而其 區(qū)別性、 一致性和穩(wěn)定性無從知曉。這種混淆和混亂不僅給生產環(huán)節(jié)帶來 諸多不便，也對食用菌的科學研究與學術交流造成障礙。猴頭菇的人工栽培己逐漸形成較大規(guī)模,創(chuàng)造了較好的經濟效益。優(yōu)質 的猴頭菇菌種是獲得高單產和高質量的前提與基礎，這就決定了猴頭菇菌 種在猴頭菇產業(yè)中的重要地位。因此為了保證每批次的用種都準確無誤， 減少不必要的損失，需要開發(fā)簡便、快速、準確的菌株鑒定技術。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用分子標記技術鑒定猴頭菇 猴杰菌種的快速檢測方法。本發(fā)明的利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培 養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR 產物的檢測；其特征在于1、 SCAR-PCR分子標記的檢測，使用的檢測引物是猴杰F/R，其中，猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3';2、 SCAR-PCR分子標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為10XPCR buffer 2. 5 jal， 25,ol/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jal， 10 u mol/L檢測引物各1 ^d， lng 10ng/pl模板 DNA l(xl， ddH20 16.2 jil;SCAR-PCR反應條件為94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個循環(huán);72°C 5rain;3、 SCAR-PCR產物的檢測結果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴增 出的分子量為4〗4bp的特異DNA條帶，為猴頭菇猴杰菌種的標志。本發(fā)明提供的利用分子標記技術鑒定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏度 高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比， 具有檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。具體如下1、 檢測時間短該檢測方法所需時間只需要2—3天，而常規(guī)的拮抗 試驗所需時間至少需要兩周時間，常規(guī)形態(tài)學檢測和出菇試驗則需要至少 2個月的時間。2、 準確性高、容易判斷，而且重復性好該檢測方法以基因組DNA 為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質，不易受外界因素等的影響，同時它的 1012bp或371bp的顯性標記判斷一目了然，減少人為判斷的偏差，大大提 高了準確性；常規(guī)的拮抗試驗中，拮抗表現形式至少有3種，甚至更多， 有時表現形式不明顯，還受培養(yǎng)環(huán)境的影響，拮抗表現不僅在種內的不同 品種之間會出現，同時在種間的菌株之間也會表現出來，給準確判斷造成 困難；出菇試驗更容易受到環(huán)境、時間等各方因素的影響，重復性差，加 大了檢測困難；形態(tài)學檢測在同一屬種內的不同品種之間可區(qū)別的特征少， 有些甚至沒有什么差異，同時還需要判斷者具有豐富的知識與經驗，方可 做出準確的判斷。3、 此外該方法得到的顯性標記可減少猴頭菇新品種認定的工作量，檢 測時該方法只需要1個陽性菌株和1個陰性菌株對照便可快速比較，而用 常規(guī)形態(tài)學、拮抗試驗、出菇試驗方法來認定一個新品種，需要將所有同 種內的不同品種一起搬出來比較，才能做出正確的認定，這就要很大的人 力和物力，當品種多時可能使得認定工作無法進行。本發(fā)明對猴頭莧種質資源的利用和新品種的登記工作，提供了更為有 效的菌種鑒定體系，以及加強對我國猴頭燕種質資源的保護工作都具有重 要意義。


圖1為使用引物猴杰F/R檢測猴頭菇菌種擴增的DNA圖 譜。其中M 17為泳道編號；左側的數字表示DNA片段的分子量，箭頭 所指是猴杰菌株特異性標記。
具體實施方式
為了充分公開本發(fā)明的利用分子標記技術鑒定猴頭 菇猴杰菌種的方法，以下結合實施例加以說明。實施例1: 一種利用分子標記技術鑒定猴頭燕猴杰菌種的方法 一種利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括以下歩驟 一、菌絲培養(yǎng)與收集(一) 若供測試猴頭燕菌株的保藏時間小于6個月，則菌絲培養(yǎng)按如下 方法進行1、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；2、 放置在25。C搖床上，轉速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;3、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；4、 稱取0.5 1.3g菌絲,用濾紙包好，保存于-2(TC備用。(二) 若供測試猴頭燕菌株保藏時間不小于6個月，則菌絲培養(yǎng)采用如 下方法1、 取猴頭菇菌種豆塊大小轉接到PDA斜面上，25'C培養(yǎng)7 10天；2、 用接種耙耙碎含猴頭菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液體培養(yǎng)基中；3、 放置在25。C搖床上，轉速90 130r/min培養(yǎng)7 10d;4、 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；5、 稱取0.5 1.3g菌絲，用濾紙包好，保存于-20。C備用。二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子 實體中提取。1、取保存?zhèn)溆玫暮镱^菇菌絲0.5 1.3g，或子實體0.5 1.3g，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉入7ml的離心管；2、 加2.5mL65r預熱的抽提液，同時加入50 jil巰基乙醇，上下震蕩， 使蛋白質變性沉淀；3、 65'C水浴lh，每隔10min振蕩l次；4、 加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質；5、 8000 r/min， 4。C離心10min，取上清到7ml離心管；6、 力Q 1/5體積65"預熱的CTAB/NaCl混勻，加入2. 5 ml的氯仿異戊 醇混勻；7、 10000r/min， 4。C離心10min，取上清；8、 加入2.5ml 65。C預熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65。C水浴lh至沉淀可見或可過夜；9、 12000r/min, 4。C離心10min后，小心去除上清液；10、 用O. 5ml TE溶液或無菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml飽和酚和0. 25m L氯仿異戊醇，混勻；12、 12000 r/min， 4。C離心10min，取上清，加入2倍體積預冷的無 水乙醇，混勻；13、 放置-20。C冰箱lh或過夜；14、 12000 r/min， 4。C離心10 min，棄上清；15、 自然風干沉淀，用30 ^ TE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，-20°C 保存?zhèn)溆谩ＨCAR-PCR分子標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系10XPCR buffer 2. 5 pl， 25mmol/L MgCU 1 (il ， 2.5 m mol/L dNTP 2 jal， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 [il， 10 u mol/L 專用檢測引物猴杰F/R l|il， lng 10ng/Vl模板DNA l(il， ddH20 16. 2 (il。SCAR-PCR反應條件:94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30個循環(huán)；72°C 5min。所述專用檢測引物猴杰F/R，是采用PCR技術，經過大量的篩選試驗， 獲得了猴頭菇猴杰菌種的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列為基礎，設 計猴杰菌種的特異檢測引物。所述專用檢測引物猴杰F/R具體內容為猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3'。四、PCR擴增產物檢測具體檢測方法為，取PCR擴增產物8 ^tl加上1. 5 ^ 6X溴酚藍上樣 緩沖液，混勻，在1. 0%瓊脂糖凝膠，含GoldView DNA染料進行電泳，5V/cm 恒壓電泳50min，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。或者，取PCR擴增 產物8 ^，與1.5 6X溴酚藍上樣緩沖液混勻，點樣于1%的瓊醋糖凝膠 上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm恒壓電泳0. 5 lh，電泳結束后，用 EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。PCR擴增產物檢測結果采用檢測引物猴杰F/R對猴頭菇菌株進行 SCAR—PCR擴增，只有猴杰菌株能擴增出分子量為414bp的DNA條帶。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)1、 CTAB抽提液100 mmol/L Tris-HCl， 2. 0% CTAB， 20 mmol/L EDTA， 1. 4 mol/L NaCl， pH 8. 0;2、 CTAB沉淀液50mmol/LTris-HCl， 1.0%CTAB， 10誦ol/L EDTA， pH 8. 0;3、 CTAB/NaCl: 0.7 mol/X NaCl，10% CTAB;4、 TE緩沖液10咖ol/L Tris HC1 ， 1咖ol/L EDTA;5、 0.5XTBE: 44.5廳1/L Tris， 50 ,1/L ■:,、 1腿ol/L EDTA;6、 上樣緩沖液0.1%溴酚藍,40%蔗糖；7、 EB: 10mg/ml溴化乙錠；8、 PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下SW-CJ-1FB型單人水平垂直兩用凈化 工作臺蘇州凈化設備有限公司； 手提式滅菌鍋上海三申； HYG-A全溫搖瓶柜太倉市實驗室；冷凍離心機Sigma 3K30;PCR擴增儀Eppendorf AG22331 Hamburg;掌型離心機江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機； 凝膠成像系統(tǒng)TANON-2008。2525Untitledl. ST25 SEQUENCE LISTING<110〉禍建農林人學< 120〉利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法<130〉<160〉 2<170〉 Patentln version 3.1〈400〉 1cgc幼cc膽a. a.caaaaacga caatg<40()〉 2cgttccaccc ct.acgtttag cctca<210〉 <2]1〉 〈212> <213〉225DNA猴頭竊范2 CA頭s麗猴
權利要求
1、一種利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR產物的檢測；其特征在于(1)SCAR-PCR分子標記的檢測，使用的檢測引物是猴杰F/R，其中，猴杰F是5′-CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG-3′’，猴杰R是5′-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA-3′；(2)SCAR-PCR分子標記的檢測建立，SCAR-PCR擴增體系為10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCL2 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ulTaq DNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L檢測引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH2O 16.2μl；SCAR-PCR反應條件為94℃ 1min；94℃ 45second，62℃ 45second，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min；(3)SCAR-PCR產物的檢測結果在電泳檢測的DNA圖譜中顯示，擴增出的分子量為414bp的特異DNA條帶，為猴頭菇猴杰菌種的標志。
全文摘要
一種利用分子標記技術鑒定猴頭菇猴杰菌種的方法，包括菌絲培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、SCAR-PCR分子標記的檢測建立和SCAR-PCR產物的檢測。本發(fā)明提供的利用分子標記技術鑒定猴頭菇菌種的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好等優(yōu)點。為猴頭菇種質資源的利用和新品種的登記工作，提供了快速有效的菌種鑒定體系，對科研和生產具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK101402994SQ20081007213
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權日2008年11月18日
發(fā)明者劉新銳, 堅 朱, 江玉姬, 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦 申請人:福建農林大學