專利名稱：一種節桿菌及其產生黃嘌呤氧化酶的應用和制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，更具體涉及一種節桿菌^^ra6a"wsp. XL2006及其產生黃嘌呤氧化酶 的應用和制備方法。
背景技術：
黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, XOD， EC 1.2. 3. 22)是嘌呤核苷代謝途徑的限速酶。其催化次黃 嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸，與缺血性再灌注損傷、痛風、高尿酸血癥、風濕性關節炎、心肌梗塞、肝炎 等疾病密切相關。通過査閱資料和文獻檢索所知，黃嘌呤氧化酶可開發成一種醫學檢驗用酶，應用于檢測 血清無機磷、血清超氧化物歧化酶活力、細胞損傷后胞外次黃嘌呤和黃嘌呤水平以及次黃嘌呤核苷(肌苷)、 鳥嘌呤、鳥苷、鳥嘌呤酶和核苷磷酸化酶的活性等。現在所用的黃嘌呤氧化酶來源單一，主要是從牛奶黃 油中分離提取。原料奶受不同產地、不同種類奶牛的影響，使其中黃嘌呤氧化酶的含量和質量不穩定，導 致生產成本高，限制了其應用領域的擴展。而產生黃嘌呤氧化酶的微生物種類不多。

發明內容
本發明的目的是提供一種節桿菌及其產生黃嘌呤氧化酶的應用和制備方法，該菌株節桿菌Jrt/wotocteA"
sp.XL2006為分離純化出的新菌種，具有一定產黃嘌呤氧化酶水平的安全、非致病性細菌；該菌種所產黃 嘌呤氧化酶具有產品活性高，質量穩定，生產周期短的特點，用于檢測病人血清中次黃嘌呤和黃嘌呤的水 平，具有操作簡便、快捷、精確和穩定的特點。
本發明的節桿菌JWAra6acte"p.XL2006，其特征在于所述菌株16S rRNA的序列如下所示
gg8tg咖gCtggcggcgtgcttaacacatgc犯gtcg肌cgatgatgccC8Cttgtggg60
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本發明的節桿菌^"說ratocter sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶的制備方法包括以下步驟
(1) 將菌種^Aro&crte/" sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養基中進行振蕩搖瓶培養， 搖床轉速為200rpm，溫度為30'C,培養時間為20h，制備成一級種子液；
(2) 將一級種子液，按發酵液體積的5~10%接種量轉接入產酶發酵培養基中，在32'C培養42h達到產酶高 峰；
(3) 于500(K8000卬m離心收集(2)發酵液中的^wAratocte/"sp. XL2006細胞，采用超聲波法和溶菌酶法 破碎細胞壁，800(K10000rpm離心去除細胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；
(4) 根據不同需要和使用對象不同將(3)得到的粗酶液進一步分離純化，制備成不同活性、純度和劑型 的酶制劑。
本發明的優點是本發明從自然土壤中分離純化出一株節桿菌^"說roto"er sp. XL2006，用該菌株作 為黃嘌呤氧化酶的生產菌，具有產品活性高，質量穩定，生產周期短的特點。以該菌種能以次黃嘌呤或黃 嘌呤為唯一碳氮源和能源，發酵生產黃嘌呤氧化酶具有營養要求簡單，容易培養和發酵時間短的特點;所 產黃嘌呤氧化酶具有很高的活性，可以作為臨床檢驗用酶，用于檢測病人血清中次黃嘌呤和黃嘌呤的水平， 具有操作簡便、快捷、精確和穩定的特點。


圖1是本發明節桿菌Jr決wZ)acte/"sp. XL2006制備的黃嘌呤氧化酶的native-PAGE電泳圖譜。
具體實施例方式
本發明的節桿菌^"論ra^cto"sp.XL2006的分離純化為采集富含有核苷類物質的土壤樣品，以黃嘌呤 和少量酵母粉作為微生物生長的碳源、氮源及能源，通過分批搖瓶培養及恒化富集培養后，分別涂布于選 擇培養基瓊脂平板上進行單菌落分離；然后挑取單菌落進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤 氧化酶特性的一株細菌；該細菌通過形態觀察、生理生化分析和16S rRNA序列鑒定為節桿菌屬的一個新種； 節桿菌^^rato"e"p.XL2006的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少量樣品接種于100mL選擇培養基中于3(TC在180 rpm進行恒溫振蕩搖瓶培養，每隔12h采用HPLC監測黃嘌呤的降解 情況；待黃嘌呤消耗盡后，分別取200uL培養上清液涂布于選擇培養基平板上進行分批篩選；同時各取2mL 培養上清液，混合接種于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續培養7d后取菌液進 行平板涂布分離；然后挑取單菌落進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤氧化酶特性的一株細 菌；所采用的選擇培養基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g, CaQ: 3.0mg， MgS(V 7H2O0.2mg， FeS04 7H2O0.5mg，酵母粉100mg,黃嘌呤1.52g，加水定容至1L, pH7.5。
該節桿菌A決ra6ac^sp.XL2006為革蘭氏陽性、好氧球菌；接觸酶陽性；菌體不運動，細胞呈現成對、 四個或不規則簇狀排列；菌落為淺黃色；最適生長溫度為3(TC;屬于化能異養菌，通常生長在簡單培養基 加生物素，進行氧化代謝；代謝葡萄糖或其他糖產生少量酸或不產酸。
節桿菌Jrt/wotocteA" sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶的制備方法包括以下步驟
(1) 將菌種^^ra6acter sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養基中進行振蕩搖瓶培養， 搖床轉速為200ipm,溫度為30'C，培養時間為20h，制備成一級種子液；
(2) 將一級種子液，按發酵液體積的5~10%接種量轉接入產酶發酵培養基中，在32'C培養42hii到產酶高 峰；
(3) 于500(K8000rpm離心收集(2)發酵液中的^^ra6ac欣sp. XL2006細胞，采用超聲波法和溶菌酶法 破碎細胞壁，8000M0000rpm離心去除細胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；
(4) 根據不同需要和使用對象不同將(3)得到的粗酶液進一步分離純化，制備成不同活性、純度和劑型 的酶制劑。
所述步驟(4)進一步提取純化黃嘌呤氧化酶的方法為采用40%^0%飽和度的硫酸銨進行分級鹽析 沉淀離心收集的粗酶液，再利用10%(w/v)PEG6000/15%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃取、Butyl-S印harose 4B 疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過濾和冷凍干燥的提純步 驟，制備檢測用試劑酶。
所述Butyl-Sepharose4B疏水層析為使用<|)1.6 cm x 25 cm層析柱，平衡緩沖液為0.5mol/L硫酸銨的 pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液；上樣后，用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L 和0mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min;
所述DEAE Sepharose CL-6BFF離子交換層析為疏水層析分離收集的活性組分，經PEG6000濃縮、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液透析后，Tris-HCl緩沖液pH7.8， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液；加至 已用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE- Sepharose fast flow層析柱，(|)1.6 cm x 20 cm;上 樣后，繼續用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含Omol/L、 0.2 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/LNaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分；
所述S印haciyl S-200 HR凝膠過濾收集的活性組分經冷凍干燥濃縮后，進行Sephacryl S-200分子篩層析；用pH7.8、 20mmoI/LTris-HCl緩沖液平衡層析柱(M.6cmx 100cm，上樣量10mL，然后用相同的緩 沖液洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分。
所述斜面培養基、液體種子培養基和產酶發酵培養基分別為
斜面培養基牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g， NaC15.0g，瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L， pH7.5， 121°C 高壓蒸汽滅菌20min;
液體種子培養基酵母膏2.0g，葡萄糖5g， Na2HPO46.0g， KH2P04 1.6g， CaCl23.0mg， MgS04'7H20 0.2mg, FeS04'7H20 0.5mg，加蒸餾水定容至1L， pH8.0， 121'C高壓蒸汽滅菌15min;
產酶發酵培養基乳糖葡萄糖為3 : 1的混合物12 g， (NH4>2SO44.0g，酵母粉2.13 g，黃嘌呤2.57 g， FeS04.7H20 0.5mg， Mg S04'7H20 0.2mg， CaCl2 5.33 mg， KH2P04 0.94， Na2HP04 5.92g,加蒸餾水定 容至1L， pH8.5， 12rC高壓蒸汽滅菌15min。
制備獲得的黃嘌呤氧化酶制劑作為醫學檢驗用酶，或用作缺血性再灌注損傷、痛風、高尿酸血癥、風 濕性關節炎、心肌梗塞、肝炎等疾病患者血清中次黃嘌呤和黃嘌呤水平的檢測。
下面通過具體實施例說明本發明，但是本發明不僅限于此
實施例
采集富含有核苷類物質的土壤樣品，以黃嘌呤和少量酵母粉作為微生物生長的碳源、氮源及能源，通 過分批搖瓶培養及恒化富集培養后，分別涂布于選擇培養基瓊脂平板上進行單菌落分離。然后挑取單菌落 進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤氧化酶特性的一株細菌。該細菌通過形態觀察、生理生 化分析和16S rRNA序列鑒定為節桿菌屬的一個新種。(選擇培養基為酵母膏2.0g，葡萄糖5g， NaCl 5.0g， 瓊脂15g ， H202 1L， pH8.0)
節桿菌A/;wo6ac^sp.XL2006的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少 量樣品接種于lOOmL選擇培養基中于30'C在180 rpm進行恒溫振蕩搖瓶培養，每隔12h采用HPLC監測 黃嘌呤的降解情況；待黃嘌呤消耗盡后，分別取200uL培養上清液涂布于選擇培養基平板上進行分批篩選； 同時各取2mL培養上清液，混合接種于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續培 養7d后取菌液進行平板涂布分離；然后挑取單菌落進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤氧 化酶特性的一株細菌；所采用的選擇培養基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g， CaQ2 3.0mg， MgS(V 7H20 0.2mg, FeS04* 7H2O0.5mg，酵母粉100mg，黃嘌呤1.52g，加水定容至1L， pH7.5。
^^rotoctersp.XL2006菌體培養特征該菌種為革蘭氏陽性、好氧球菌；接觸酶陽性；菌體不運動， 細胞呈現成對、四個或不規則簇狀排列；菌落為淺黃色；最適生長溫度為30'C。屬于化能異養菌，通常生 長在簡單培養基加生物素，進行氧化代謝。代謝葡萄糖或其他糖產生少量酸或不產酸。
將菌種用選擇培養基活化后，接種至裝有100mL液體種子培養基的500raL三角瓶中培養，搖床轉速為200rpm,溫度為30'C,培養20h作為種子液。然后按發酵液體積的8%接種量轉接入裝有100 mL產酶發 酵培養基的250mL三角瓶中振蕩培養，搖床轉速為250rpm，在32'C培養42h達到產酶高峰，結束發酵。 將培養液用冷凍高速離心機(10000rpm， 15min)離心收集菌體細胞，隨后重新懸浮于100mmoW/1 Tris-HCL (pH7.8)緩沖液中，采用Y92-II型超聲粉碎儀(400W， 15min)和2mg/mL的溶菌酶于37匸恒溫振蕩60min進 行細胞破壁，離心后去除細胞碎片，收集上清液即為粗酶液。進一步采用40%~60%飽和度的硫酸銨分級鹽析、10% (w/v)PEG6000與15%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃 取獲得粗酶夜。然后進行精提，步驟如下第一步，將粗酶液的硫酸銨濃度調節至0.5mol/L,即為疏水層 析上樣液。用含0.5mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Butyl-Sepharose CL-4B疏水柱 層析柱(<|)1.6 cm x 25 cm);上樣后，繼續用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L和Omol/L 硫酸銨的pH7.8、 20mmol/LTris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min。洗脫完畢，收集及合并活性組 分。第二步，疏水層析分離收集的活性組分，經PEG6000濃縮、20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.8)透析后， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液。加至己用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE-Sepharosefastflow層析柱(命1.6cmx20cm)。上樣后，繼續用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0mol7L、 0.2mol/L、 0.3mol/L、 0.5mol/L NaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速1.0mL/min。收 集活性組分。第三步，收集的活性組分經冷凍干燥濃縮后，進行Sephaciyl S-200分子篩層析。用pH7.8、 20mmol/LTris-HCl緩沖液平衡層析柱((l)1.6cmx 100cm)，上樣量10mL，然后用相同的緩沖液洗脫，流速 1.0mL/min。收集活性組分。采用如上的Butyl-Sepharose 4B疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephaciyl S-200 HR凝膠過濾以及冷凍干燥的制備步驟，獲得電泳純級別的黃嘌呤氧化酶粉劑。采用間歇補料發酵，XOD酶產量達到409.6U*L-1。經過分離純化，黃嘌呤氧化酶的比酶活達到 24.27U.mg-l,回收率為11.55%。經過非變性凝膠電泳，獲得單一條帶，達到電泳純級別。核苷酸序列〈110〉集美大學<120> —株節桿菌及其產生黃嘌呤氧化酶的應用和制備方法<160〉 1<210〉 1<211> 1120<212> RNA<213〉節桿菌〈220><223>〈400〉 1ggatgsacgctggcggcgtgCtt33C3C3tgcaagtcgsacgatgstgcccacttgtggg60tggattagtggcg33cgggtgsgt33C3cgtgsgtsscctgcccttgactctggg3tssg120cctgggsssctgggtctsstsccgg3t3tg3ctgsccgtcgcatggtggttggtggsssg180cttttgtggttttggstggsctcgcggcctstC3gcttgttggtggggtsstggcctscc240aaggcgacgacgggtsgccggcctgsgsgggtgsccggcc3csctggg3ctgsgscscgg300cccsgsctcctscgggsggc3gcsgtgggg513t3ttgC3Csatgggcgcs3gcctgatgc360agcgacgccgcgtgsgggstgscggccttcgggttgt333cctctttcag420gcgtaagtgacggtacctgcccggctssctscgtgccagcsgccgcggts4803tscgtsgggcgcssgcgttatccggsattsttgggcgt33agsgctcgtsggcggtttg540tcgcgtctgccgtg333gtccggggctcaactccggstctgcggtgggtscgggcsgsct600agagtgatgt3ggggsgsctggssttcctggtgtsgcggtgst3tc3cg3660gg33c3ccg3tggcggtcgascgstgstgcccaicttgtgggtggsttagtggcg333gcs720tgggg3gcgsstsccctggt3gtccstgccgtaaacgttgggcsctaggt780gtgggggscsttccscgttttccgcgccgtagctaacgcattssgtgccccgcctgggg3840gtscggccgcttgacgggggcccgcacasgcggcgg3gcs900tgcgg3tt33ttcg3tgc33cttaccasggcttcgscstggsccggsccg960gtggtttctccttttggggccggttcscsggtggtgcstggttgtcgtc31020gctcgtgtcgtgsgstgttgggtt33gtcccgcaacgsgcgcssccctcgttccstgttg1080ccsgcgcgtsstggcggggsctgcstgggagsctgccggg1120
權利要求
1.一種節桿菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于所述菌株16S rRNA的序列如下所示ggatgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgatgcc cacttgtggg 60tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccttgact ctgggataag 120cctgggaaac tgggtctaat accggatatg actgaccgtc gcatggtggt tggtggaaag 180cttttgtggt tttggatgga ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc 240aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg 300cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc 360agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag tagggaagaa 420gcgtaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg 540tcgcgtctgc cgtgaaagtc cggggctcaa ctccggatct gcggtgggta cgggcagact 600agagtgatgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcacga 660ggaacaccga tggcggtcga acgatgatgc ccacttgtgg gtggattagt ggcgaaagca 720tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttcgacatg gaccggaccg 960ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg 1080ccagcgcgta atggcgggga ctgcatggga gactgccggg 1120。
2. 根據權利要求l所述的節桿菌Jrt/jTO6actersp.XL2006，其特征在于所述的節桿菌A說ra6acter sp. XL2006的分離純化為采集富含有核苷類物質的土壤樣品，以黃嘌呤和少量酵母粉作為微生物生長的 碳源、氮源及能源，通過分批搖瓶培養及恒化富集培養后，分別涂布于選擇培養基瓊脂平板上進行單 菌落分離；然后挑取單菌落進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤氧化酶特性的一株細菌; 該細菌通過形態觀察、生理生化分析和16S rRNA序列鑒定為節桿菌屬的一個新種。
3. 根據權利要求2所述的節桿菌Jw/jra6acter sp. XL2006，其特征在于所述節桿菌JrtAra6acter sp. XL2006 的分離純化的具體步驟為采集多地不同植被的土樣20份，分別取少量樣品接種于100mL選擇培養基中 于3(TC在180 rpm進行恒溫振蕩搖瓶培養，每隔12h采用HPLC監測黃嘌呤的降解情況；待黃嘌呤消耗盡后， 分別取200uL培養上清液涂布于選擇培養基平板上進行分批篩選；同時各取2mL培養上清液，混合接種 于恒化器中；所述恒化器的容積為500mL，裝液量為100m;連續培養7d后取菌液進行平板涂布分離；然 后挑取單菌落進行液體發酵測定酶活力復篩獲得具有高產黃嘌呤氧化酶特性的一株細菌；所采用的選擇培養基為Na2HPO46.0g， KH2PO43.0g， CaCl2 3.0mg， MgS04'7H20 0.2mg， FeS04-7H20 0.5mg， 酵母粉100mg，黃嘌呤1.52g，加水定容至IL， pH7.5。
4. 根據權利要求l所述的節桿菌A/Aro6ac妙sp.XL2006，其特征在于所^r/Aro6acter XL2006菌體培養 特征該菌種為革蘭氏陽性、好氧球菌；接觸酶陽性；菌體不運動，細胞呈現成對、'四個或不規則簇 狀排列；菌落為淺黃色；最適生長溫度為3(TC:屬于化能異養菌，通常生長在簡單培養基加生物素， 進行氧化代謝代謝葡萄糖或其他糖產生少量酸或不產酸。
5. —種如權利要l、 2、 3或4所述的節桿菌A/AroZ^tersp.XL2006的應用，其特征在于-所述的節桿菌 J7^ro6acte/" sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶。
6. —種如權利要求5所述的節桿菌Jrt/wo/wcter sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌吟氧化酶的方法，其特征在 于所述制備方法包括以下步驟(1) 將菌種^rt/jro6flcter sp. XL2006從斜面接種至裝液量為20。/。的液體種子培養基中進行振蕩搖瓶培 養，搖床轉速為200rpm，溫度為30'C,培養時間為20h，制備成一級種子液；(2) 將一級種子液，按發酵液體積的5~10%接種量轉接入產酶發酵培養基中，在32r培養42hii到產 酶高峰；(3) 于5000"8000rpm離心收集(2)發酵液中的Jrt/wo6acter sp. XL2006細胞，采用超聲波法和溶菌 酶法破碎細胞壁，800(^10000rpm離心去除細胞碎片，收集到的上清夜即為粗酶液；(4) 根據不同需要和使用對象不同將(3)得到的粗酶液進一步分離純化，制備成不同活性、純度和 劑型的酶制劑。
7. 根據權利要求6所述的節桿菌JrtAro6acto" sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶的方法，其特征在 于所述步驟(4)進一步提取純化黃嘌呤氧化酶的方法為采用40°/0~60%飽和度的硫酸銨進行分級 鹽析沉淀離心收集的粗酶液，再利用10 % (w/v)PEG6000/l 5%(w/v) (NH4)2S04雙水相萃取、 Butyl-Sepharose 4B疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過 濾和冷凍干燥的提純步驟，制備檢測用試劑酶。
8. 根據權利要求7所述的節桿菌^"說ra&cfe/" sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶的制備方法，其特 征在于(1) 所述Butyl-Sepharose 4B疏水層析為使用令1.6 cm x 25 cm層析柱，平衡緩沖液為O.5mol/L硫酸銨 的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液；上樣后，用平衡緩沖液沖洗層析柱然后改用含0.2mol/L、 0.1mol/L和0mol/L硫酸銨的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液分階段洗脫，流速0.6mL/min;(2) 所述DEAE Sepharose CL-6B F F離子交換層析為疏水層析分離收集的活性組分，經PEG6000濃縮、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液透析后，Tris-HCl緩沖液pH7.8， 8000rpm冷凍離心15min，收集上清液； 加至已用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的DEAE- Sepharose fast flow層析柱，小1.6 cm x 20cm;上樣后，繼續用平衡緩沖液沖洗層析柱；然后改用含0mol/L、 0.2mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/LNaCl的pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，流速l.OmL/min;收集活性組分； (3)所述SephacrylS-200HR凝膠過濾收集的活性組分經冷凍干燥濃縮后，進行Sephacryl S-200分子篩層析；用pH7.8、 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡層析柱(M.6 cm x 100 cm，上樣量lOmL,然后用相同的緩沖液洗脫，流速1.0mL/min;收集活性組分。 9.根據權利要求6所述的節桿菌^A^ra6ac/er sp. XL2006應用于發酵生產黃嘌呤氧化酶的制備方法，其特 征在于所述斜面培養基、液體種子培養基和產酶發酵培養基分別為(1) 斜面培養基牛肉膏3.0g,蛋白胨lO.Og, NaC15.0g,瓊脂15g，加蒸餾水定容至1L, pH7.5， 121°C 高壓蒸汽滅菌20min;(2) 液體種子培養基酵母膏2.0g，葡萄糖5g， Na2HP04 6.0g， KH2P04 1.6g， CaCl2 3.0mg， MgS04'7H20 0.2mg, FeS04'7H20 0.5mg，加蒸餾水定容至1L， pH8.0, 121i:高壓蒸汽滅菌15min;(3) 產酶發酵培養基乳糖葡萄糖為3 : 1的混合物12 g， (NH4>2SO44.0g，酵母粉2.13 g，黃嘌呤 2.57 g, FeS04.7H20 0.5mg， Mg S047H20 0.2mg, CaCl2 5.33 mg, KH2PO40.94， Na2HP04 5.92g, 加蒸餾水定容至1L, pH8.5, 121'C高壓蒸汽滅菌15min。
全文摘要
本發明提供一種節桿菌及其產生黃嘌呤氧化酶的應用和制備方法，該節桿菌Arthrobacter XL2006來源于自然界，其16S rRNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，以該節桿菌發酵產黃嘌呤氧化酶，提取純化該酶，制備檢驗試劑盒。本發明的節桿菌Arthrobacter XL2006具有產生黃嘌呤氧化酶特性，能以次黃嘌呤或黃嘌呤為唯一碳氮源和能源，發酵生產黃嘌呤氧化酶具有營養要求簡單，容易培養和發酵時間短的特點；所產黃嘌呤氧化酶具有很高的活性，利用本發明提供的菌株發酵提取黃嘌呤氧化酶，制備的檢驗試劑盒，可用于臨床上檢測病人血清中的次黃嘌呤和黃嘌呤的水平。
文檔編號C12N1/20GK101402922SQ20081007208
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月10日 優先權日2008年11月10日
發明者關瑞章, 李忠琴, 楊海麟, 武 王 申請人:集美大學