專利名稱：尿道炎衣原體細胞培養維持液的制作方法
尿道炎衣原體細胞培養維持液 技術領域 本發明涉及一種尿道炎衣原體細胞培養維持液；特別是一種尿道炎 衣原體細胞培養維持液的配方及其制備方法。其主要成分是氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫 鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、氯化鈣、水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇、 青霉素、鏈霉素、慶大霉素、EDTA、0. 5%酚紅。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾 病之一。沙眼衣原體還被認為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病 因。孕婦患沙眼衣原體宮頸炎，胎兒經產道分娩時可感染沙眼衣原體結膜炎和肺炎。衣原 體細胞培養法是檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細胞培養維持液能夠培養檢測生殖 道衣原體，具有指導臨床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。常用 McCoy細胞或Hela229單層細胞培養，通過觀察細胞病變(腫大，變性，脫落)及細胞內特征 性包涵體可確定診斷。其敏感性約為80% 90%，特異性為100%。并可用于藥物敏感試 驗，還可檢測治療后病人是否存在活的衣原體，以判定療效。該方法操作繁鎖、費時，設備昂 貴，技術性強，臨床不易推廣。沙眼衣原體需要在實驗室做細胞培養進行分離，因此，多年來 細胞培養一直做為衣原體檢測的"金標準"，細胞培養對設備、技術、標本采集和運送等的要 求都非常高，從尿道、宮頸采集的柱狀細胞，不宜混有多核細胞及粘液膿性分泌物，不宜含 有過多的雜質。對采集拭子也有要求應是棉拭子而不應是木制拭子，因為木制拭了可能抑 制衣原體生長。宮頸內標本有細胞刷可采集到更從的細胞以提高培養的敏感性。標本必須 放置在特制的轉運培基中，冷凍，24小時內包埋到細胞培養盤中。培養時McCoy細胞的狀態 也會影響最終結果。當McCoy細胞過度生長、變形、破裂甚至完全失去細胞形態時，則無從 觀察細胞中的包涵體。 細胞培養無論在花費上、設備、技術方面都要求非常高，對于細胞培養來講，花費 和時間是影響衣原體細胞培養作為診斷方法使用和推廣的最大障礙。很多研究人員在細胞 培養方法的改進上進了多方面探索。
技術背景 生殖道感染發病率很高，流行范圍很廣，其病原菌50%為沙眼衣原 體；30%為尿素分解衣原體；20%由其他致病菌感染引起。所有沙眼衣原體均可在細胞培 養中生長，現多采用McCoy或HeLa229細胞株，在接種衣原體前，以X線照射細胞，或于細胞 培養中加入代謝抑制如細胞松弛素B、 DEAE葡聚糖呈放線菌酮，其目的在于細胞生長代謝 緩慢，以利于衣原體的寄生性生長。細胞培養無論在花費上、設備、技術方面都要求非常高， 對于細胞培養來講，花費和時間是影響衣原體細胞培養作為診斷方法使用和推廣的最大障 礙。目前，細胞培養仍是診斷衣原全感染最為可靠的實驗方法，習慣上把細胞培養作為"金 標準"。用細胞培養的方法來確定衣原體的感染涉及4個方面的影響因素①盡可能采集含 有較多上皮細胞的樣本；②在轉運培基中添加抗生素以防止標本中細菌的過度生長；③使 用抗代謝藥物抑制組織細胞的復制；④使用碘、Giemsa、免疫熒光染色來鑒定感染細胞中的 衣原體。本發明的目的在于提供一種尿道炎衣原體細胞培養維持液，與其它類試劑相比具 備下列特點尿道炎衣原體細胞培養維持液，營養豐富、配制簡單、選擇性強和變色靈敏，與 傳統試劑比較，檢出率高，污染小，臨床應用效果滿意.檢測方法簡單、時間短、準確性強。 可防止標本中細菌的過度生長，培養組織細胞的復制得以抑制。

發明內容
本發明的要點在于選擇合適的組分，并進行合理混配，經加溫、溶
解、混合、冷卻、分裝、高溫滅菌等工藝而成一種尿道炎衣原體細胞培養維持液。 本發明選擇的培養基配方如下(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70. 0-90. 0 ;磷酸氫
二鈉0. 5-0. 7 ;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7 ;氯化鉀3. 0_5. 0 ;硫酸鎂1. 5-3. 0葡萄糖8. 0-12. 0 ;
氯化鈣1. 0-2. 0 ;水解乳白蛋白2. 0-3. 0 ;小牛血清10. 0-12. 0ml ;1%谷氨酰胺1. 0_1. 2ml ;
2-巰基乙醇0. 5-0. 6 ;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml) 10. 0-15. 0ml ;EDTA 0. 1-0. 3 ;
0. 5%酚紅3. 0-5. 0ml ;雙蒸水加至1000ml ;調pH至7. 2-7. 4。 氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、氯化f丐、是組織細胞的 體液平衡必不可少的物質；水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、是組織細胞的營養平衡 必不可少的物質；青霉素、鏈霉素、慶大霉素是細胞培養過程中防止污染必不可少的物質； 2-巰基乙醇、EDTA是細胞培養過程中起到組織塊的消化以提高細胞的產量。小牛血清使用 前要滅活(56°C，30min)，以消除補體活性。動物血清個體差異大，故而每一批血清都要嚴格 檢測，同時進行無菌試驗。優質血清應該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。 生化檢測總蛋白含量3. 5 4. 5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml，保證試驗條件的穩定。試 驗中加入小牛血清后，培養基的pH可能還會變化，故亦可先加入小牛血清后調pH值。培養 液配好后，應先抽取少許放入培養瓶內，于37t:溫箱內置24 48hr，以檢測培養液是否有 污染。每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止營養成分(主要為谷氨酰胺) 損失，造成實驗繁瑣或者污染。
本發明產品的制備方法是 1)、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進行 加溫、溶解； 2)、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ; 3)、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后 調PH7. 2-7. 4，加酚紅； 4)、將溶解的1%谷氨酰胺、2_巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ; 5)、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌 分裝，冷藏備用。
本發明具有以下優點(l)尿道炎衣原體細胞培養維持液，營養豐富、配制簡單； (2)臨床應用效果滿意，解決了床邊接種的困難，污染?。?3)檢測方法簡單、時間短、選擇 性強、變色靈敏、檢出率高；(4)可防止標本中細菌的過度生長，培養組織細胞的復制得以 抑制。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明
按照下表所列數據(克、ml/每升蒸餾水)及其所述步驟進行配置
配方一
氯化鈉70. 0-90. 0;磷酸氫二鈉O. 5-0. 7;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7;氯化鉀3.0-5. 0;硫酸 鎂1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0;氯化鈣1.0-2.0;水解乳白蛋白2. 0-3. 0;小牛血清10. 0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1.0-1.2 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、.慶大霉素(10000U /ml) 10. 0-15. 0 ml; EDTA 0.1-0.3; 0. 5 %酚紅3. 0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調pH至 7. 2—7. 4。
配方二
氯化鈉70. 0-80. 0;磷酸氫二鈉0. 6-0. 7;磷酸二氫鉀0. 6-0. 7;氯化鉀4.0-5.0;硫酸 鎂2. 5-3. 0葡萄糖9.0-12.0;氯化鈣1.5-2. 0;水解乳A蛋A 2. 5-3. 0;小牛血清11.0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1. 1-1. 2 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U /m1)12. 0-丄5. 0 ml; EDTA 0. 2-0. 3; 0. 5 %酚紅4. 0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調pH至 7. 2 — 7. 4。
配方三
氯化鈉80. 0-90. 0;磷酸氫二鈉0. 5-0. 6;磷酸二氫鉀0. 5-0. 6;氯化鉀3. 0-4. 0;硫酸 鎂1.5-2. O葡萄糖8.0-10.0;氯化鈣1.0-1.5;水解乳白蛋白2. 0-2. 5;小牛血清IO. 0-11. 0 ml; 1%谷氨酰胺l.O-丄.1 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U /ml) 10. 0-13. 0 m丄;EDTA 0.卜0. 2; 0. 5 %酚紅3. 0-4. 0 m丄;雙蒸水加至1000 ml;調pH至 7. 2 — 7. 4。
權利要求
本發明涉及一種尿道炎衣原體細胞培養維持液，特別是一種尿道炎衣原體細胞培養維持液的配方及其制備方法，其特征在于具有如下配方(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70.0-90.0；磷酸氫二鈉0.5-0.7；磷酸二氫鉀0.5-0.7；氯化鉀3.0-5.0；硫酸鎂1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化鈣1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巰基乙醇0.5-0.6；青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚紅3.0-5.0ml；雙蒸水加至1000ml；調pH至7.2-7.4。
2. —種權利要求1所述尿道炎衣原體細胞培養維持液的制備方法，其特征在于具有如下的步驟1) 、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進行加 溫、溶解；2) 、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ;3) 、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后調 PH7. 2-7. 4，加酚紅；4) 、將溶解的1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ;5) 、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌分裝， 冷藏備用。
全文摘要
本發明涉及一種尿道炎衣原體細胞培養維持液；特別是一種尿道炎衣原體細胞培養維持液的配方及其制備方法。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾病之一。沙眼衣原體還被認為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病因。孕婦患沙眼衣原體宮頸炎，胎兒經產道分娩時可感染沙眼衣原體結膜炎和肺炎。衣原體細胞培養法是檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細胞維持液能夠培養檢測生殖道衣原體，具有指導臨床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。本發明具有以下優點(1)尿道炎衣原體細胞培養維持液營養豐富、配制簡單；(2)臨床應用效果滿意，解決了床邊接種的困難，污染?。?3)檢測方法簡單、時間短、選擇性強、變色靈敏、檢出率高；(4)可防止標本中細菌的過度生長，培養組織細胞的復制得以抑制。
文檔編號C12Q1/04GK101698872SQ20081009341
公開日2010年4月28日 申請日期2008年4月21日 優先權日2008年4月21日
發明者曲奕 申請人:曲奕