專利名稱：：葡糖淀粉酶變體的制作方法葡糖淀粉酶變體本發明申請是基于申請日為1999年7月9日，申請號為99808653.3(國際申請號為PCT/DK99/00392),發明名稱為"葡糖淀粉酶變體"的專利申請的分案申請。發明領域本發明涉及親代AMG的葡糖淀粉酶變體(突變體)，尤其是其具有改良的熱穩定性和/或增加的比活性，以適于如淀粉轉化，如由淀粉產生葡萄糖。更具體地，本發明涉及葡糖淀粉酶變體及這類變體酶的用途。發明背景葡糖淀粉酶(1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3.)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原性末端釋放的酶。葡糖淀粉酶由多種絲狀真菌和酵母產生，其中來自曲霉屬的那些葡糖淀粉酶是商業上最重要的。葡糖淀粉酶在商業上用于將已由a-淀粉酶部分水解的玉米淀粉轉化為葡萄糖。然后葡萄糖通過葡糖異構酶進一步轉化為由幾乎等量的葡萄糖和果糖組成的混合物。這種混合物，或另外還富含果糖的混合物是全球商業化的常用的高果糖玉米糖漿。這種糖漿是世界上通過酶法生產的最大噸位的產品。淀粉到果糖的轉化過程涉及的三種酶是所生產的最重要的工業用酶。葡糖淀粉酶在高果糖玉米糖漿的生產中的商業應用方面存在的主要問題之一是葡糖淀粉酶的相對低的熱穩定性。葡糖淀粉酶不如a-淀粉酶或葡糖異構酶熱穩定，其具有最大活性和穩定性的pH低于a-淀粉酶或葡糖異構酶。因此，它必須在具有較低溫度和pH的隔離容器內使用。來自黑曲霉的葡糖淀粉酶具有由一段長而高度0-糖基化的接頭所分隔催化結構域(氨基酸1-440)和淀粉結合結構域(氨基酸509-616)(Svensson等，1983，CarlsbergRes.Commun.48,529-544,1983和1986,Eur.J.Biochem.154，497-502)。來自泡盛曲霉X100變種的葡糖淀粉酶的催化結構域(氨基酸1-471)采用一種(oc/(i)6折疊，其中六個保守的a—cc環區段連接著外柱和內柱(outerandinnerbarrels)(Aleshin等，1992,J.Biol.Chem.267，19291-19298)。葡糖淀粉酶的晶體結構與l-脫氧野尻霉素(l-deoxynojirimycin)(Harris等，1993，Biochemistry,32，1618-1626)及假四糖抑制物阿卡波糖(acarbose)和D-葡萄糖-二氬阿卡波糖(D-gluco-dihydroacarbose)(Aleshin等，1996,生物化學，35,8319-8328)的復合還分別與作為廣義酸和堿起作用的谷氨酸179和400相容。已用蛋白質工程研究了這些殘基在催化中的關鍵作用(Sierl(s等，19卯,ProteinEngng.3，193-198;Frandsen等，(1994),Biochemistry,33,13808-13816)。在葡糖淀粉酶-復合體結構中突出的是在四個糖基殘基結合亞位點-l、+1、+2和+3處葡糖淀粉酶-糖類相互作用(Aleshin等，1996,Biochemistry,35，8319-8328)，利用定點突變體結合動力學分析深入研究了對于結合和催化均很重要的殘基(Sierks等，1989，ProteinEngng.2，621-625;Sierks等，1990,ProteinEngng.3,193-198;Berland等，1995，Biochemistry,34,10153-10161;Frandsen等，1995，Biochemistry,34，10162-10169)。已描述了黑曲霉葡糖淀粉酶中增強熱穩定性的不同的取代i)取代a螺旋甘氨酸G137A和G139A(Chen等，1996，ProteinEngng.9，499-505);ii)消除易斷裂的Asp-X肽鍵，D257E和D293E/Q(Chen等，1995，ProteinEngng.8,575-582);阻止N182中的脫酰胺作用(Chen等，1994,Biochem.J.301，275-281);iv)添加二硫鍵的工程改造，A246C(Fierobe等，1996,Biochemistry,35,8698-8704);和v)在A435和S436位導入Pro殘基(Li等，1997,ProteinEngng.10，1199-1204)。此夕卜ClarkFord于1997年10月17曰提交了一篇論文酶工程，14,北京/中國，1997年10月，12-17,摘要編號摘要集第0-61頁。該摘要提到了在(未公開的)泡盛曲霉G4^erg/〃waw"mon')葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C、及S30P位置的突變以改進熱穩定性。其它有關葡糖淀粉酶的信息可在互4關網主頁http://www.public.iastate.edu/pedro/glase/glase.html上找到。PedroM.Coutinho的"葡糖淀粉酶WWW主頁"(97年10月8日最近更新)公開了有關葡糖淀粉酶的資料，其中包括可由曲霉屬菌抹得到的葡糖淀粉酶。在黑曲霉葡糖淀粉酶中進行的化學修飾和定點修飾已經列出。發明簡述本發明的目的是提供改良的葡糖淀粉酶變體，其具有改進的熱穩定性和/或適用于如淀粉轉化過程的糖化步驟中的增加的比活性。術語"一種具有改進的熱穩定性的葡糖淀粉酶變體"在本發明的上下文中指一種葡糖淀粉酶變體，其具有比相應親代葡糖淀粉酶更高的T1/2(半壽期)。丁1/2的測定(方法I和方法II)在下面"材^f"和方法"部分中描述。術語"一種具有增加的比活性的葡糖淀粉酶變體"在本發明的上下文中指一種葡糖淀粉酶變體，其針對所述糖中a-l，4鍵的比活性增加。所述比活性測定為k^或AGU/mg(如下面"材料和方法，，部分所述進行測量)。增加的比活性指當分別與相應親代葡糖淀粉酶的k^或AGU/mg值比較時，kcat或AGU/mg值更高。本發明的發明人提供了親代葡糖淀粉酶的許多改良的變體，其與相應的親代酶相比具有改進的熱穩定性和/或增加的比活性。熱穩定性的改進是通過在親代葡糖淀粉酶中取代選擇的位點而獲得的。這將在下面詳細描述。命名在本說明書和權利要求書中，使用了氨基酸殘基的傳統的單字母和三字母密碼。為便于參考，本發明的葡糖淀粉酶變體用以下命名法描述原始氨基酸位置取代的氨基酸根據該命名法，例如第30位的丙氨酸取代為天冬酰胺可表示為Ala30Asn或A30N在同一位置缺失丙氨酸表示為Ala3(^或A30*插入另一種氨基酸殘基，如賴氨酸，表示為Ala30AlaLys或A3OAK一連串氨基酸殘基如氨基酸殘基30-33的缺失表示為(30-33)*或A(A30-N33)。當一種特定葡糖淀粉酶與其它葡糖淀粉酶相比包含一處"缺失"并在該位置進行了插入，這類情況下，將第36位插入一個天冬氨酸可表示為*36Asp或承36D多個突變用加號分隔，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S表示分別在第30和34位將丙氨酸和谷氨酸取代為天冬酰胺和絲氨酸。多個突變還可按如下分隔，意思與加號一樣，即Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S當在指定位置插入一或多種可替換的氨基酸殘基時，表示為A30N,E或A30N/E,或A30N或A30E此外，當在本文中，一個適于修飾的位點得到鑒定而未提出任何具體的修飾時，應理解為可用任何氨基酸殘基取代該位點存在的氨基酸殘基。因此，如當提到第30位丙氨酸的修飾，但未具體說明時，應理解為該丙氨酸可缺失或取代成任何其它氨基酸，即R,N，D，A,C,Q,E,G，H,I,L,K,M，F，P,S,T,W,Y,V中的任何一個。附圖簡述圖1顯示含有黑曲霉Gl葡糖淀粉酶基因的質粒pCAMG91。發明詳述本發明的工作旨在改善特定葡糖淀粉酶的熱穩定性和/或增加其比活性，所述特定葡糖淀粉酶可得自真菌生物體，尤其曲霉屬的菌抹，而且它們自身是根據它們在淀粉轉化或醇發酵中合適的特性而被選擇的。鑒定被突變以獲得改良的熱穩定性和/或增加的比活性的位置和/或區域分子動力學(MD)模擬指蛋白質結構中氨基酸的活動性(mobility)(見McCammon，JA和Harvey,SC.,1987,"Dynamicsofproteinsandnucleicacids",CambridgeUniversityPress.)。通常將這類蛋白質動力學與結晶的B因子進行比4交(見Stout，GH和Jensen,LH,1989，"X-raystructuredetermination",Wiley)。通過在可滴定的殘基的不同質子化狀態下實施MD模擬，可對與pH相關的殘基活動性進行模擬。選擇具有高度活動性或靈活性(此處為各向同性波動)的區域進行隨機誘變。在此應理解，蛋白質特定區域中發現的高度活動性可通過取代這些殘基中的殘基而在耐熱方面得到改善。所述取代直接針對殘基，可改變殘基的動力學行為，如使其具有更大側鏈和/或成為這樣的殘基，所述殘基能與鄰近環境中的殘基形成改進的接觸。來自黑曲霉的AMG可用于MD才莫擬。如何實施MD才莫擬已在下文"材料和方法"部分描述。通過分子動力學(MD)模擬發現的適于在希望獲得改良的熱穩定性和/或增加的比活性時進行突變的區域如下:區域1-18，區域:19-35，區域:73-80,區域200-212，區域:234-246，區域334-341，區域353-374，區域:407-411，區域:445-470，發現的有興趣用于增加比活性和/或改善熱穩定性的區域是鄰近活性位點的區域。位于底物結合位點的G螺旋之間的區域，而且其可包含所述a螺旋的N末端側和C末端側的位置，對于該酶的活性^f艮重要。這些區域組成jo下區i或區域40-62，區域93-127，區域170-184,區域234-246，區域287-319，區域388-414。才艮審屬(7/z/zo/m》、^果節菌屬(7^/ara附少cey)^口7^/(3ram少c&ye"犯廠sow//(在WO99/28448中公開)、和草根霉屬(777/e/m;/a)對麥芽糖糊精包括麥芽糖和麥芽糖庚糖(maltohepatose)具有高比活性。因此，在(轉移)增加比活性方面特別有利的區域是區i或200-212，區域287-300，區域305-319。本發明人已發現，確實有可能通過修飾親代葡糖淀粉酶氨基酸序列中的一或多個氨基酸殘基，來改善親代葡糖淀粉酶的熱穩定性和/或增加其比活性。本發明是基于這一發現。相應地，本發明第一方面涉及一種親代葡糖淀粉酶的改良變體，其在下述區域和位點中包含一或多個突變。親代葡糖淀粉酶本發明所考慮的親代葡糖淀粉酶包括真菌葡糖淀粉酶，尤其是獲自曲霉屬菌抹的葡糖淀粉酶，如黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶以及它們的變體或突變體、同源葡糖淀粉酶、和結構和/或功能類似于SEQIDNO:2的其它葡糖淀粉酶。具體包含的是黑曲霉葡糖淀粉酶G1和G2,其公開于Boel等，1984，"GlucoamylasesGlandG2fromA/ergz7/w5"/geraresynthesizedfromtwodifferentbutcloselyrelatedmRNA",EMBOJ,3(5),第1097-1102頁。G2葡糖淀粉酶公開于SEQIDNO:2。Gl葡糖淀粉酶公開于SEQIDNO:13。另一包含的AMG骨架為ra/aram_yc^ewe"om7,尤其是公開于WO99/28448(NovoNordisk)的7^/aramjKcesewe/^om7DSM。商業上可得到的親代葡糖淀粉酶商業上可得到的親代葡糖淀粉酶包括NovoNordisk的AMG，還包括來自Genencor，Inc.USA、Gist-Brocades,Delft,荷蘭這兩家/^司的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶變體本發明第一方面涉及一種親代葡糖淀粉酶的變體，其在NO:2所示的氨基酸序列中的以下位點或區域和/或顯示與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少60%的同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位點或區域內包含一個或多個突變區域1-18,區域19-35，區域40-62,區域73-80,區域93-127，區域170-184，區域200-212，區域234-246，區域:287-319,區域:334-341,區域:353-374，區域388-414,區域445-470，但不包含以下取代N20C,A27C,S30P,Y48W,Y50F,W52F,R54K/L,D55G/V,G57A,K108R，D112Y，Y116A/W,S119C/W/E/G/Y/P，W120H/L/F/Y,G121T/A,R122Y，P123G,Q124H，R125K,W170F,N171S,Q172N，T173G，G174C，Y175F，D176廳，L177H/D，W178R/D，E179Q/D，E180D/Q，V181D/A/T，N182A/D/Q/Y/S，G183K，S184H，W212F，R241K,A246C，D293E/Q，A302V，R305K，Y306F，D309N/E，Y312W,W317F,E389D/Q，H391W,A392D,A393P，N395Q,G396S,E400Q/C，Q401E,G407D，E408P,L410F,S411A/G/C/H/D，S460P。在一個實施方案中，突變的區域為區域1-18。特別優選的位點包括以下之一或更多:1,2，3，4，5,6,7,8，9，10,11,12,13,14,15，16,17,18。具體的突變包括以下之一或更多A1V，T2P/Q/R/H/M/E/K,L3N,N9A,A11E/P，I18V。優選的突變組合包括以下之一或更多A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,T2E+T379A+S386K+A393R，T2Q+A11P+S394R,T2R+L66V+S394P+Y402FT2M+N9A+T390R+D406N+L410R，T2R+S386R+A393R,A11P+T2Q+S394R，A11E+E408R,II8V+T51S+S56A+V59T+L60A。在一個實施方案中，突變的區域為區域19-35。優選的亞區包括以下之一或更多21-26,31-35。特別優選的位點包括以下之一或更多19，21，22，23,24,25，26，28,29,31，32，33，34，35。具體的突變包括以下之一或更多L19N,N20T，G23A,A24S/T，D25S/T/R，G26A,A27S/T，W28R/Y，S30T/N,G31A,A32V，D33R/K/H，S34N。在一個實施方案中，突變的區域為區域40_62。優選的亞區包括以下之一或更多40-47,58-62。特別優選的位點包括以下之一或更多40，41，42，43,44，45,46，47,49,51,53,56,58，59,60,61，62。具體的突變包括以下之一或更多S40C/A/G，T43R，T51S/D，T53D,S56A/C，V59T/A，L60A。優選的突變組合包括以下之一或更多T51S+S56A+V59T+L60A+I18VV59A+A393R+T4卯A+PLASD(N末端延伸)。一個實施方案中，突變的區域為區域73-80。特別優選的位點包括以下之一或更多73，74,75，76,77,78,79,80。具體的突變包括以下之一或更多S73P/D/T/N/Q/E，L74I/D,L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V,優選為I/N/D,S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,優選T/A,T77V/T，I78V,E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V,優選為Q/R/K,N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優選為H/D/E/R/K/T/S/Y。在一個實施方案中，突變的區域為區域93-127。在另一個實施方案中，亞區為區域93-124。優選的亞區包括以下之一或更多93-107，109-111:113-115。特別優選的位點包括以下之一或更多:93，94,95,96,97,98,99，100，101,102,103,104，105，106，109，110，111，113，114，115，117,118,126,127。具體的突變包括以下之一或更多N93T，P94V,S95N,D97S,L98S/P,S100T/D,A102S/*,P107M/L/A/G/S/T/V/I,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/A,Y11SF,S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V,優選為A,R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/IVK/F/M/P/S/T/W/V,G127A.優選的突變組合包括以下之一或更多S119P+G447S,S119P+Y402F,S119P+A393R,S119P+I189T+223F+F227Y+Y402FS119P+T416H+Y402F+Y312G.在一個實施方案中，突變的區域為區域170-184。具體的突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/:L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,Y175N/Q/D/E,KL77IE180N/MV181I/TN182R/C/E/G/H/I/:L/K/M/P/T/W/Y/V.G183AS184D/N/E/Q/:L/工/T/R/K.在一個實施方案中突變的區域為區域200-212。優選的亞區包括200-211。特別優選的位點包括以下之一或更多200,201,202,203,204,205,206,207，208,209,210,211。具體的突變包括以下之一或更多:A201D,，F202LA203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D，S209T,S211P,W212N/A/T。在一個實施方案中突變的區域為區域234-246。優選的亞區包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優選的位點包括以下之一或更多234,235,236，237，238，239，240，242,243，244，245。具體的突變包括以下之一或更多L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V.A235SF237Y/H/N/D.D238T/S.S239A/R/N/D/C/G/H/工/;L/F/P/S/T/Y/V.S240GS242S/P/T/A/Y/H/N/D.G243S/P/T/A/Y/H/N/D.K244R,A246T.優選的突變組合包括以下之一或更多A246T+T721。在一個實施方案中突變的區域為區域287-319。優選的亞區包括以下之一或更多287-292，294-301，313-316。特別優選的位點包括以下之一或更多287,288,289,290,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319具體的突變包括以下之一或更多S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/WK/M/T/V,1288Ij/N/Q,Y289F,T290A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,Ij291I/D/N,N292D,D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,G294A/R/N/D/C/Q/E/H/I/1VK/M/P/S/T/V,L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V,S296A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/:L/K/M/T/V,D297A/R/N/C/Q/E/G/H/工/:L/K/M/P/S/T/V,S298A/R/U/D/C/Q/E/G/H/I/:L/K/F/M/T/V,E299a/r/n/d/c/q/g/h/;c/:l/k/m/s/t/v.v301t/工，'A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/:L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V八優選為S，V303T/工，G304A,R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/:L/K/M/P/S/T/W/V.E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/P/S/T/V,優選為Q,d309l,t310v/s,Y311N,Y312Q/N,N313T/S/GN315Q/E/R,F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/Y/V，優選為Y。優選的突變組合包括以下之一或更多Y312Q+S119P+T416H+Y402F,Y312O+S119P+Y402F+T416H+S411V,Y312Q+T416HN313G+F318Y.在一個實施方案中突變的區域為區域334-341。特別優選的位點包括以下之一或更多:334，335，336,337,338，339,340,341。具體的突變包括以下之一或更多D336A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/S/T7W/Y/V.K337A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/M/F/P/S/T/W/Y/V.Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.G339S/P/T/A.S340I/T/N/V/A/D/G.JL341F/L/I/V.優選突變組合包括以下之一或更多S340G+D357S+T360V+S386P。在一個實施方案中突變的區域為區域353-374。特別優選的位點包括以下之一或更多353,354,355,356,357,358，359,360,361,362，363，364,365，366，367，368,369，370，371，372,373，374。具體的突變包括以下之一或更多A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/Li/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/Li/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/lVP/H/R/工/T/N/S/V/A/D/G.優選的突變組合包括以下之一或更多S35SP+S366T,D357S+T360V+S371H.D357S+T360V+S386P+S340G.在一個實施方案中突變的區域為區域388-414。優選的亞區包括以下之一或更多397-399,402-406,412-414。特別優選的位點包括以下之一或更多388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414具體的突變包括以下之一或更多T390R,A393R,S394P/R,M398L,S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,優選為T/Q/C，Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/L/K/F/M/P/S/T/V,優選為F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,A409R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,優選為P，Ii410R/1,S411R/N/Q/E/工/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,優選為V,A412C,R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/!L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V優選的突變組合包括以下之一或更多V393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸))S394R+T2Q+A11P,Y402F+S411V,Y402F+S411V+S119PY402F+S411V+S119P+A393R,Y402F+Y312Q十S119P+T416H,E408R+S386N,E408R+A425T+S465P+T494A,L410R+A393R,Y402F+Y312Q+S119P+T416H+S411V+A393R.在一個實施方案中突變的區域為區域445-470。優選的亞區包括以下之一或更多445_459,461-470。特別優選的位點包括以下之一或更多445,446,447,448,449,450,451,452,453,454,455,456,457,458,459,461,4S2,463,464,465,466,467,467,468,469,470.具體的突變包4奮以下之一或更多G447S,G456C/P，S465P。特定的變體包括具有一或多個以下取代的變體A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/EI18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W2犯/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53DS56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D9"7S,L98P/S,S100T/DA102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116FS119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246TY312Q,N313T/S/G,A3S3D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S36ST,S3S8P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/IVK/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,'E408C/R,Ij410I/R,S411VA412C,D414A,G447S,S465P.改良的熱穩定性本發明第二方面涉及親代葡糖淀粉酶的變體，其具有改進的熱穩定性，尤其在40-80°C，優選60-80°C，且優選在pH4-5時，所述變體在NO:2所示的氨基酸序列中的以下位點或區域和/或顯示與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少60%的同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位點或區域中包含一個或更多突變區域1-18，區域19-35,區域73-80,區域93-127，區域170-184,區域200-212，區域234-246'區域287-319，區域334-341，區域353-374，區域388-414，區域445-470，但不包含以下取代N20C,A27C,S30P,A246C。如底物結合可改善穩定性區域93-127，用于根據本發明的熱穩定作用還包含區域170-184,區域305-319。在一個實施方案中，突變的區域為區域1-18。特別優選的位點包括以下之一或更多:1,2,3，4，5,6,7,8,9,10,11，12,13,14,15,16,17,18。特異性突變包括以下之一或更多AlV，T2P/Q/R/H/M/E，N9A,Al1E/P。優選的突變組合包括以下之一或更多A1V+L66R+Y402F+N427S+S486G，T2K+S30P+N427M+S44G+V470M,T2E+T379A+S386K+A393R,T2R+S386R+A393R,A11P+T2Q+S394R,T2Q+A11P+S394R,T2R+L66V+S394P+Y402F,丁2M+N9A+T390R+D406N+L41OR,丁2R+S386R+A393R，A11E+E德R。在一個實施方案中，突變的區域為區域19-35。優選的亞區包括以下之一或更多21-26,31-35。特別優選的位點包括以下之一或更多19,21,22,23，24，25，26，28，29，31，32,33，34,35。具體的突變包括以下之一或更多L19N，N20T，G23A,A24S/T，D25S/T/R，G26A，A27S/T，W28R/Y，S30T/N，G31A,A32V,D33R/K/H,S34N。一個實施方案中，突變的區域為區域73-80。特別優選的位點包括以下之一或更多73,74，75，76,77,78,79,80。具體的突變包括以下之一或更多S73P/D/窗/Q/E，L74I/D,L75A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/P/S/T/V，優選為I/N/D,S76A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優選T/A,T77V/T，I78V,E79A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/Y/V,優選為Q/R/K,N80A/R/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，優選為H/D/E/R/K/T/S/Y。在一個實施方案中，突變的區域為區域93-127。在另一個實施方案中，200810098549.3說明書第16/92頁亞區為區域93-124。優選的亞區包括以下之一或更多93-107，109-111:113-115。特別優選的位點包括以下之一或更多93，94，95，96，97,98,99,100，101:102,103，104,105,106，109,110，111,113，114,115，117，118,126,127。優選的突變包括以下之一或更多P107M/L/A/G/S/T/V/I,S119A/R/N/D/Q/H/I/L/K/F/M/T/V，優選為A，R122A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/V,優選的突變組合包括以下之一或更多S119P+G447S。S119P+A393R。在一個實施方案中，突變的區域為區域170-184。具體的突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/IVK/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,Y175N/Q/D/E,D176LE180N/MV181工/TN182R/C/E/G/H/工/WK/M/P/T/W/Y/V.G183AS184D/N/E/Q/!L/I/T/R/K.在一個實施方案中突變的區域為區域200-212。優選的亞區包括200-211。特別優選的位點包括以下之一或更多200,201,202,203，204，205，206,207,208,209,210,211。具體的突變包括以下之一或更多A203L,S211P。在一個實施方案中突變的區域為區域234-246。優選的亞區包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優選的位點包括以下之一或更多234,235,236,237,238，239,240,242,243，244,245。具體的突變包括以下之一或更多L234A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/K/M/F/P/S/T/W/Y/V,A235S,F237Y/H/N/D,D238T/S,S239A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V,S240G,S242S/P/T/A/Y/H/N/D,G243S/P/T/A/Y/H/N/D,K244R,A246T,優選的突變組合包括以下之一或更多A246T+T721。在一個實施方案中突變的區域為區域287-319。優選的亞區包括以下之一或更多287-292,294-301,313-316。在一個附加的實施方案中，所述亞區包括305-319。特別優選的位點包括以下之一或更多287,288,289,290,291,292,234,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319具體的突變包括以下之一或更多Y312Q,F318A/R/N/D/C/Q/E/G/H/T/L/K/M/P/S/T/W/Y/V,優選為Y。優選的突變組合包才舌以下之一或更多N313G+F318Y，Y302Q+S119P+T416H+Y402F。在一個實施方案中突變的區域為區域334-341。特別優選的位點包括以下之一或更多334，335，336,337,338，339,340,341。特異性突變包括以下之一或更多Q338A/R/N/D/C/G/H/I/L/F/P/S/T/Y/V.G339S/P/T/A.S340I/T/N/V/A/D/G.L341F/:L/I/V.優選突變組合包括以下之一或更多S340G+D357S+T360V+S386P。在一個實施方案中突變的區域為區域353-374。特別優選的位點包括以下之一或更多:353，354，355，356，357,358，359，360，361,362，363,364,365，366，367,368,369，370，371,372，373，374。具體的突變包括以下之一或更多A353D/S,S356P/N/D,D357S,T360V,G361S/P/T/A,T3S2R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/Ii/P/H/R/1/T/N/S/V/A/D/G.優選的突變組合包括以下之一或更多S356P+S366T,D357S+T360V+S371H,D357S+T360V+S386P+S340G。在一個實施方案中突變的區域為區域388-414。優選的亞區包括以下之一或更多397-399,402-406,412-414。在一個附加的實施方案中，所述亞區為407-411。特別優選的位點包括以下之一或更多388,389,390,394,397,398,399,402,403,404,405,406,409,412,413,414.具體的突變包括以下之一或更多T390R，A393R,A394P/R，S399A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/T/W/Y/V,優選為T/Q/C,Y402A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/V，優選為F,D403S,S405T，D406N，E408C/R，Q409A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/WA7V，優選為P，L410I/R,S411V，A412C，R413A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V，D414A。優選的突變組合包括以下之一或更多A393R+T2R+S386R，A393R+T490A+V59A+PLASD(N末端延伸)S394R+T2Q+A11P,Y402F+T2R+Ij66V+S394P,Y402F+S411V+S119PY402F+S411V,Y402F+312Q+S119P+T416H,S411V+A393R,E408R+S386N,E408R+A425T+S465P+T494A,L410R+A393R,S411V+S119P+402F+A393R，S411V+S119P+402F+A393R+T416H。在一個實施方案中突變的區域為區域445-470。優選的亞區包括以下之一或更多445-459，461-470。特別優選的位點包括以下之一或更多445,446，447，448,449,450,451,452，453,454，455，456，457，458,459，461，462,463,464,465,466，467,467,468，469，470。具體的突變包括以下之一或更多G447S,G456C/P，S465P。優選的突變組合包括以下之一或更多G447S+S119P,S465P+E408R+A425T+T494A。增加的比活性本發明第三方面涉及一種親代葡糖淀粉酶的變體，其具有增加的比活性，其在NO:2所示的氨基酸序列中的以下位點或區域和/或顯示與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少60%的同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位點或區域中包含一個或多個突變區域1-18，區i或40-62，區i或93-127,區域170-184，區i或200-212,區域234-246，區i或287-319,區域388-414，但不包含以下耳又代S411G。在一個實施方案中，突變的區域為區域1-18。特別優選的位點包括以下之一或更多:1,2，3,4,5，6,7,8,9,10,11,12,13，14,15,16,17，18。具體的突變為L3N,I18V。優選的突變組合包括以下之一或更多II8V+T51S+S56A+V59T+L60A。在一個實施方案中，突變的區域為區域40-62。優選的亞區包括以下之一或更多40-47,58-62。特別優選的位點包括以下之一或更多40，41,42,43,44,45，46,47,49,51，53，56，58，59，60，61，62。具體的突變包4舌以下之一或更多S40C,T43R,T51S/D,T53D,S56A/C，V59T,L60A。優選的突變組合包括以下之一或更多T51S+S56A+V59T+L60A+118V。在一個實施方案中，突變的區域為區域93-127。在一個附加實施方案中亞區為區域93-124。優選的亞區包括以下之一或更多93-107,109-111,113-115。特別優選的位點包括以下之一或更多:93,94，95，96，97,98,99,100,101，102,103,104,105,106,109，110,111,113，114，115，117,118，126,127。優選的突變包括以下之一或更多N93T，P94V,S95N,D97S,L98S/P,S100T/D,A102S/*，N110T，V111P，D112N，E113M/A,T114S，A115Q/G,Y116F,S119A，G127A。優選的突變組合包括以下之一或更多S119P+Y402F，S119P+Y402F+I189T+Y223F+F227Y。在一個實施方案中，突變的區域為區域170-184。具體的突變包括以下之一或更多N171R/K/Q/E/W/F/Y,Q172A/R/N/D/C/E/G/H/I/L/K/F/M/P/S/T/W/Y/V,T173K/R/S/N/Q,G174A,S,Y175N/Q/D/E,D176LL177IE180N/MV181I/TN182R/C/E/G/H/工/:L/K/M/P/T/W/Y/V,優選為E，G183AS184D/N/E/Q/W工/T/R/K.在一個實施方案中突變的區域為區域200-212。優選的亞區包括200-211。特別優選的位點包括以下之一或更多200,201,202,203，204，205，206，207，208，209,210，211。具體的突變包括以下之一或更多:A201D,F202L,A203L,T204K，A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,W212N/A/T。在一個實施方案中突變的區域為區域234-246。優選的亞區包括以下之一或更多234-240,242-245。特別優選的位點包括以下之一或更多234，235,236,237，238,239，240，242，243，244,245。在一個實施方案中突變的區域為區域287-319。優選的亞區包括以下之一或更多287-292,294-301,313-316。特別優選的位點包括以下之一或更多287,288,289,230,291,292,294,295,296,297,298,299,300,301,302,303,307,308,310,311,313,314,315,316,318,319.具體的突變包括以下之一或更多S287A/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/L/K/M/T/V,工288WN/Q,Y289F,T2嫩/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/V,L291i:/D/N,N292D,D293A/R/N/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/S/T/V,G2錫/班/D/C/Q/E/H/l/!L/K/M/P/S/T/V,L295A/R/N/D/C/Q/E/G/H/K/M/S/T/V'S29SA/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/L/K/M/T/V,D297A/R/N/C/Q/E/G/H/工/L/K/M/P/S/T/V,S298A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/F/M/T/V,E299A/R/N/D/C/Q/G/H/I/L/K/M/S/T/V.V301T/工，A302R/N/D/C/Q/E/G/H/I/WK/F/M/P/S/T/W/Y/V/,優選為S,V303T/I,G304A,R305A/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/F/M/P/S/T/W/Y/V,Y306A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/P/S/T/W/V.E308A/R/N/D/C/Q/G/H/I/IVK/M/P/S/T/V,優選為Q，D3091;,T310V/S,Y311N,Y312Q/N,優選為Q,N313T/S/G,優選為S，N315Q/E/R。在一個實施方案中突變的區域為區域388-414。優選的亞區包括以下之一或更多397-399，402-406，412-414。特別優選的位點包括以下之一或更多388,389,3卯，394,397,398，399，402,403,404，405,406，409,412,413，414。具體的突變包括以下之一或更多M398L,S399C/Q/T，Y402F,D403S，S405T,E408C/R,S411V,A412C,D414A。優選的突變組合包括以下之一或更多Y402F+S119P，Y402F+S119P+1189T+Y223F+F227Y。在本發明一個優選實施方案中，待突變的區域為區域287-300，區域305-319，和/或顯示與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少60%的同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位點或區域。同源性(同一性)測定兩個蛋白質序列之間的同一性程度作為上文所述的親代葡糖淀粉酶的同源性，其顯示第一個序列與第二個序列的差異。利用本領域已知的計算機程序，例如GCG程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage,第8版，1994年8月，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)可適當地測定同源性(Needleman，S.B和Wunsch,C.D.,1970，JournalofMolecularBiology,48,p443畫453)。為了進行多肽序列對比，使用了具有下列設置的Gap:Gap產生罰分為3.0，Gap延伸罰分為0.1,由本發明的類似DNA序列編碼的成熟多肽部分與SEQIDNO:2所示氨基酸序列的成熟部分顯示的同一性程度優選至少為60%,如70%,至少80%，至少90%,更優選至少為95%,更優選至少為97%,最優選至少為99%。優選親代葡糖淀粉酶含有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或其等位基因變體；或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。SEQIDNO:2的片段是由此氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。例如，AMGG2(SEQIDNO:2)是具有葡糖淀粉酶活性的黑曲霉Gl葡糖淀粉酶的片段(Boel等，1984，EMBOJ，3(5)，p.1097-1102)。等位基因變體表示占據相同染色體基因座的任何兩個或多個可替代的基因形式。等位基因變異是通過突變天然產生的，并可導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(所編碼的多肽沒有改變)，或者可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。通過插入或缺失一個或多個氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基，同源的親代葡糖淀粉酶的氨基酸序列可與SEQIDNO:2的氨基酸序列有所不同。優選氨基酸的改變從性質來說是微小的，即不會顯著影響蛋白質折疊和/或活性的保守的氨基酸取代；小的缺失，一般為l至約30個氨基酸缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的曱硫氨酸殘基；多至約20至25個殘基的小連接肽；或便于通過改變凈電荷或另外的功能進行純化的小的延伸，如多-組氨酸通道，抗原性表位或結合結構域。在另一個實施方案中，分離的親代葡糖淀粉酶由核酸序列編碼，該核酸序列在很低嚴緊性條件下，優選在低嚴緊性條件下，更優選在中度嚴緊性條件下，更優選在中-高度嚴緊性條件下，甚至更優選在高度嚴緊性條件下，最優選在很高嚴緊性的條件下與核酸探針雜交，所述探針能在相同的條件下與以下序列雜交(i)SEQIDNO:l的核酸序列，(ii)SEQIDNO:l的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i),(ii)或(iii)的互補鏈(J.Sambrook,E.RFritsch和T.Maniatus,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,冷泉港，紐約)。SEQIDNO:l的亞序列可為至少100個核苷酸，或者優選至少為200個核苷酸。此外，該亞序列可編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。親代多肽也可以是具有葡糖淀粉酶活性的多肽的等位變體或片段。可使用SEQIDNO:l的核酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段設計核酸探針，從而根據本領域已知的方法從不同的屬或種的菌抹中鑒定和克隆編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。特別是，可根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中的相應基因。這種探針可以比完整序列短很多，但其長度應該至少為15，優選至少為25，更優選至少為35個核苷酸。也可使用較長的探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常標記探針以檢測相應的基因(例如用32P，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白(avidin))。本發明包括這種探針。因此，可從由其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交，且編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術可分離得自其它生物體的基因組或其它DNA。將文庫中的DNA或經分離的DNA轉移至并固定于硝酸纖維素或其它適當的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。對本發明而言，雜交指的是在嚴緊度很低至很高的條件下，核酸序列與核酸探針雜交，所述探針對應于SEQIDNO:l所示的核酸序列，其互補鏈或其亞序列。使用X-射線膠片檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對于長度至少為100個核苷酸的長探針而言，使用2xSSC，0.2%SDS將載體材料最終洗滌3次，每次15分鐘，洗滌溫度優選至少為45。C(很低的嚴緊度)，更優選至少為5(TC(低嚴緊度)，更優選至少為55。C(中度嚴緊度)，更優選至少為6(TC(中-高度嚴緊度)，甚至更優選至少為65。C(高嚴緊度)，最優選至少為70。C(^艮高的嚴緊度)。對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針而言，嚴緊性條件的定義是根據標準的Southern印跡方法，在比4吏用Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:13卯)的算式計算出的Tj氐5。C至l(TC的溫度下，在0.9MNaCl,0.09MTris-HCl,pH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1xDenhardt，s溶液，lmM焦磷酸鈉，lmM磷酸二氫鈉，O.lmMATP和0.2mg酵母RNA/ml中進行預雜交，雜交和雜交后的洗滌。對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針而言，在比計算出的Im低5。C至l(TC的溫度下，用6xSSC+0.1。/。SDS將載體材料洗滌1次，15分鐘，再用6xSSC洗滌2次，每次15分鐘。本發明還涉及通過下列方法產生的分離的核酸序列(a)在很低，低，中度，中-高度，高度或很高的嚴緊條件下使DNA與SEQIDNO:l的序列，或其互補鏈，或其亞序列雜交；和(b)分離核酸序列。亞序列優選為至少100個核苷酸的序列，例如編碼具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段的序列。本發明包含的親代葡糖淀粉酶具有的活性為SEQIDNO:2所示成熟多肽的葡糖淀粉酶活性的至少20°/。，優選為至少40%,更優選至少為60%，甚至更優選至少為80%,甚至更優選至少為90%,最優選至少為100%。在優選的實施方案中，本發明的變體使用麥芽糖糊精作為底物，優選在約60-80。C的溫度范圍內，優選為63-75°C，優選在pH4-5，特別是4.2-4.7時具有改良的熱穩定性和/或增加的比活性。在另一個優選的實施方案中，本發明的變體被用于例如乙醇發酵。在優選的實施方案中，親代葡糖淀粉酶是黑曲霉Gl葡糖淀粉酶(BoeI等，1984,EMBOJ，3(5),pl097-1102)。親代葡糖淀粉酶可以是截短的葡糖淀粉酶，例如AMGG2葡糖淀粉酶。克隆編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列可使用本領域已知的多種方法，從能夠產生所述葡糖淀粉酶的任何細胞或微生物中分離編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列。首先，應使用得自能夠產生待研究的葡糖淀粉酶的生物體的染色體DNA或信使RNA來構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果葡糖淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成標記的寡核苷酸探針，以用于從所述生物體制備的基因組文庫中鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。或者，可將含有與另一個已知葡糖淀粉酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針用作探針，使用很低至很高嚴緊度的雜交和洗滌條件來鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆。另一種鑒定編碼葡糖淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達載體，如質粒，用所得基因組DNA文庫轉化葡糖淀粉酶-陰性細菌，然后將轉化的細菌鋪于含有葡糖淀粉酶底物(即麥芽糖)的瓊脂上，從而鑒定出表達葡糖淀粉酶的克隆。或者，可通過已建立的標準方法經合成而制備編碼酶的DNA序列，所述方法包4舌例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981),TetrahedronLetters,22，p.1859-1869所述的亞磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，1984,EMBOJ,3,p.801-805所述的方法。在亞磷酰胺法中，寡核苦酸在如DNA自動合成儀中合成，純化，退火，連接并克隆至適當載體中。最后，DNA序列可以是混合的基因組和合成來源的，混合的合成和cDNA來源的或混合的基因組和cDNA來源的，它們是根據標準技術，通過連接合成來源，基因組來源或cDNA來源的片段(適當時，對應于完整DNA序列的多個部分的片段)而制備的。也可使用特異性引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)制備DNA序列，例如US4,683,202或R.K.Saiki等，1988，Science,239:1988，p487-491。定點誘變一旦分離出編碼葡糖淀粉酶的DNA序列，鑒定出理想的突變位點，可使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有所需突變位點側翼的核苷酸序列。在特定的方法中，在攜有葡糖淀粉酶基因的載體中產生DNA(即葡糖淀粉酶編碼序列)的單鏈缺口。然后使攜有所需突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)補平殘留的缺口，使用T4連接酶連接構建體。此方法的具體例子描述于Morinaga等，1984，Biotechnology,2，p.646-639。US4，760，025公開了通過對表達盒進行微小的改變來導入編碼多個突變的寡核苷酸。另外，通過Morinaga的方法可導入大量不同長度的寡核苷酸，因此可在一次導入更多種的突變。另一種將突變導入編碼葡糖淀粉酶的DNA序列的方法描述于Nelson和Long,1989，AnalyticalBiochemistry,180,pl47畫151。該方法包括3步產生PCR物而導入的所需突變。通過用限制性內切核酸酶裂解，從PCR-產生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并重新插入表達質粒中。另外，Sierks等，1989，ProteinEng.,2,621-625;Sierks等，1990，ProteinEng.,巻3,193-198也描述了曲霉屬葡糖淀粉酶中的定點誘變。隨機誘變適當的隨機誘變可以是翻譯成所述氨基酸序列的基因的至少三個部分中的局部或區域-特異性隨機誘變，也可以是整個基因中的隨機誘變。可使用本領域已知的任何方法方便地對編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變。有關上述內容，本發明的另一方面涉及產生親代葡糖淀粉酶變體的方法，其中相對于親代而言，變體表現出增加的熱穩定性，所述方法包括(a)對編碼親代葡糖淀粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)中所得的突變DNA序列，和(c)篩選表達葡糖淀粉酶變體的宿主細胞，相對于親代葡糖淀粉酶而言，所述變體具有改變的特性(即熱穩定性)。如本文工作實施例所述，優選使用^^加(doped)引物進^f亍本發明之上述方法的步驟(a)(參見下文)。例如，可通過使用適當的物理或化學誘變劑，通過使用適當的寡核普酸，用這些誘變劑的任何組合進行隨機誘變。誘變劑可為例如誘導轉換(transition)，l貞才灸(transversion),j到4立(inversion),置舌L(scrambling)，在夬失(deletion)和/或4i入(insertion)的i秀變劑。適用于本發明的物理或化學誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，O-甲基雍胺，亞硝酸，乙基甲烷磺酸酯(EMS),亞硫酸氫鈉，曱酸和核香酸類似物。當使用這些誘變劑時，一般通過下述方法進行誘變，即在適于發生誘變的條件下，在存在選定誘變劑時保溫待誘變的編碼親代酶的DNA序列，并選4奪具有所需特性的突變DNA。當通過使用寡核苷酸進行誘變時，在待改變的位置處合成寡核苷酸的過程中，可在寡核苷酸中添加(dope)或摻加(spike)3個非親代核苷酸。可進行添加或摻加以避免出現不必要的氨基酸密碼子。可通過任何已知技術，必要時使用例如PCR,LCR或任何DNA聚合酶和連接酶，將經添加或摻加的寡核芬酸摻入編碼葡糖淀粉酶的DNA中。優選使用"恒定的隨機添加"進行添加，其中各個位置處的野生型和突變的百分比是預先確定好的。另外，添加可定向于優選的以導入某些核苷酸，籍此優選導入一個或多個特定的氨基酸殘基。可進行添加以在每個位置處導入90%野生型和10%突變。選擇添加方案的其它考慮基于基因以及蛋白質結構的限制。通過使用DOPE程序可制訂摻加方案，所述程序可特別地確保不會導入終止密碼子。當使用PCR-產生的誘變時，在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經化學處理或未經處理的編碼親代葡糖淀粉酶的基因進行PCR(DesWer,1992;Leung等，技術，Vol.1,1989,pll-15)。可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，p.179-191)、釀酒酵母或任何其它微生物的增變菌抹(mutatorstrain)進行編碼葡糖淀粉酶的DNA的隨機誘變，誘變方法包括例如將含有親代糖基化酶的質粒轉化至增變菌抹，培養具有質粒的增變菌抹，從增變菌株中分離突變質粒。隨后，將突變質粒轉化至表達生物體。待誘變的DNA序列可方便地存在于基因組或cDNA文庫中，所述文庫由表達親代葡糖淀粉酶的生物體制備。或者，DNA序列可存在于適當載體，如質粒或噬菌體上，再將所述載體與誘變劑保溫，或將所述載體暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細胞中，或者整合于所述細胞的基因組中，或者存在于細胞所攜有的載體上。最后，待誘變的DNA可以是分離的形式。應理解待進行隨機誘變的DNA序列優選為cDNA或基因組DNA序列。在某些情況下，在進行表達步驟b)或篩選步驟c)之前，可方便地擴增突變的DNA序列。可根據本領域已知的方法進行這種擴增，本發明優選的方法是使用寡核苷酸引物進行PCR-產生的擴增，所述引物是根據親代酶的DNA或氨基酸序列制備的。與誘變劑保溫或暴露于其中之后，通過在允許表達發生的條件下培養攜有所述DNA序列的適當宿主細胞來表達突變的DNA。用于此目的的宿主細胞可為用任選存在于載體上的突變的DNA序列轉化的宿主細胞，或者為在誘變處理過程中攜有編碼親代酶的DNA序列的宿主細胞。適當宿主細胞的例子如下革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。突變的DNA序列可進一步含有編碼允許突變的DNA序列表達的功能的DNA序列。定位隨積3秀變隨機誘變可有利地定位于所述親代葡糖淀粉酶的一部分。當鑒定出酶的某些區域對酶的特定特性十分重要時，和當經修飾后有望產生具有改良特性的變體時，進行定位隨機誘變是有利的。當已闡明親代酶的三級結構時，一般即可鑒定出該區域，并與酶的功能關聯。通過使用上文所述的PCR-產生的誘變技術或本領域已知的任何其它適當技術，可方便地進行局部的或區域特異性的隨機誘變。或者，可通過例如插入適當的載體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后，可使用上述誘變方法中的任一種對所述部分進行誘變。另一種提供本發明變體的方法包括基因改組，其描述于例如WO95/22625(AffymaxTechnologiesN.V.)或WO96/00343(來自NovoNordiskA/S)。葡糖淀粉酶變體的表達根據本發明，使用表達載體可將通過上述方法或本領域已知的任何其它方法產生的編碼變體的編碼DNA序列以酶的形式表達，所述載體一^1包括編碼下述的控制序列啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號，和任選的阻抑蛋白基因或多種激活物基因。表達載體攜有編碼本發明葡糖淀粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是便于經受重組DNA方法的任何載體，載體的選擇經常取決于欲導入該載體的宿主細胞。載體可為這樣的載體，當將所述載體導入宿主細胞時，該載體能整合至宿主細胞基因組并與整合了該載體的染色體一起復制。適當表達載體的例子包括pMT838。啟動子在載體中，DNA序列應與適當啟動子序列可操作相連。啟動子可以是在選定宿主細胞中顯示轉錄活性的任何DNA序列，所述啟動子可得自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用于指導編碼本發明葡糖淀粉酶變體的DNA序列的轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的適當啟動子的例子是大腸桿菌/ac操縱子的啟動子，天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因tfagA啟動子，地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子，解淀粉芽孢桿菌oc-淀粉酶(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉錄，有用啟動子的例子是得自編碼下列的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，來自釀酒酵母的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alber等，1982,J.Mol.Appl.Genet,1,p419-434)，曼赫才艮毛霉(7^/zo附wcww/e/^')天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性ot-淀粉酶，黑曲霉酸穩定性a-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，曼赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構酶或構巢曲霉乙酰胺酶。表達載體本發明的表達載體也可含有適當的轉錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發明的a-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚腺香酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列適于得自與啟動子相同的來源。載體還可含有能使載體在所述宿主細胞中復制的DNA序列。這種序列的例子是質粒pUC19,pACYC177,pUB110,pE194,pAMBl和pIJ702的復制起點。載體也可含有選擇標記，例如其產物可補償宿主細胞中的缺陷的基因，如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環素抗性。此外，載體可含有曲霉屬選擇標記，如amdS,argB,niaD和sC,產生潮霉素抗性的標記，或按W091/17243所述通過共轉化完成選4奪。分別連接本發明的編碼葡糖淀粉酶變體的DNA構建體，啟動子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復制所必需信息的適當載體，所用方法是本領域技術人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，冷泉港，1989)。宿主細胞本發明的細胞含有上文所述的本發明的DNA構建體或表達載體，在重組生產本發明的葡糖淀粉酶變體時，所述細胞可有利地用作宿主細胞。可方便地通過將DNA構建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，而用編碼變體的本發明的DNA構建體轉化細胞。一般認為整合是有利的，因為此時DNA序列更可能在細胞中穩定維持。可根據常規方法，如同源或異源重組將DNA構建體整合至宿主染色體。或者，可用上文所述的與不同類型的宿主細胞相關的表達載體轉化細胞。本發明的細胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選是孩i生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。適當細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，杣爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，或青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。通過例如以本身已知的方式進行原生質體轉化或使用感受態細胞即可實現對細菌的轉化。可從糖酵母或裂殖酵母，如釀酒酵母的菌種中有利地選擇酵母生物體。宿主細胞也可以是絲狀真菌，例如屬于曲霉屬的種的菌林，最優選為米曲霉或黑曲霉，或鐮孢屬的菌抹，例如以下菌種的菌抹尖鐮孢，禾谷鐮孢(其完全階l爻稱、為GW66ere〃azeae,以前^皮一爾為Sp/wer/azeae，與G%6ere〃a和G7ZZe/^〃"f,sp.cere"/i^同義)或石克色鐮孑包(其完全階孚殳稱為G766ere〃a/Mn'can's，與Fwsan'wmfr/c/zc^/zec/oz'<ias,4干孑包^)犬鐮孑包,才婁骨木鐮孑包(Fz^ar/wmsamZmc/Mm),J文3鬼色鐮孑包和3文5鬼色鐮孑包gramineamm變種同義)，才嬰才兆鐮孑包(Ftwan'wmcerea/z'力(與Fwsan'wwcroA:Awe〃wse同義)或Fmsot/mw在本發明的優選實施方案中，宿主細胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶陰性菌抹。例如，蛋白酶缺陷菌林米曲霉JaL125缺失了被稱為"alp"的堿性蛋白酶基因。該菌抹描述于WO97/35956(NovoNordisk)。可通過下述方法轉化絲狀真菌細胞，所述方法包括形成原生質體并進行原生質體轉化，接著以本身已知的方法再生細胞壁。曲霉屬用作宿主微生物描述于EP238023(NovoNordiskA/S),其內容并入本文作為參考。產生葡糖淀粉酶變體的方法在另一方面，本發明涉及產生本發明的葡糖淀粉酶變體的方法，所述方法包括在有助于產生變體的條件下培養宿主細胞，并從細胞和/或培養基中回收變體。用于培養細胞的培養基是適用于培養所述宿主細胞和表達本發明的葡糖淀粉酶變體的任何常規培養基。適當的培養基可以商購或根據出版的配方(例如按美國典型培養物保藏中心目錄所述的方法)制備。淀粉酶變體，所述方法包括從培養基中通過離心或過濾來分離細胞，利用諸如硫酸銨的鹽沉淀培養基中的蛋白質組分，接著使用層析方法，如離子交換層析，親和層析等。淀粉轉化本發明提供了使用本發明的葡糖淀粉酶變體由淀粉生產葡萄糖等的方法。該方法一般包括以下步驟，即在a-淀粉酶的存在下部分水解前體淀粉，然后在葡糖淀粉酶的存在下，通過裂解a-(1—4)和a-(1—6)葡糖香鍵，從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非-還原性末端進一步水解釋放D-葡萄糖。利用a-淀粉酶部分水解前體淀粉可通過水解內部的oc-(1—4)鍵而初步裂解淀粉分子。在商業應用中，使用a-淀粉酶初步水解在約105。C的溫度下進行。處理了4艮高濃度的淀粉，通常為30%至40%固體。在此高溫下初步水解通常進行5分鐘。然后將部分水解的淀粉轉移至第二個罐中，在85。C至98。C的溫度下保溫約1至2小時以得到10至15葡萄糖當量(D.E.)。通常在降低的溫度，即30。C至62。C,在獨立的罐中，在葡糖淀粉酶的存在下，進行從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非-還原性末端進一步水解釋放D-葡萄糖的步驟。優選將底物液體的溫度降至55。C至60。C，溶液的pH從約5.5至6.5降至約3至5丄優選溶液的pH為4至4.5。在溶液中加入葡糖淀粉酶，將反應進行24至72小時，優選36至48小時。使用本發明的熱穩定性葡糖淀粉酶變體，可在比傳統的分批糖化法高的溫度下進行糖化。根據本發明，可在60至80。C，優選在63至75。C的溫度下進行糖化。該溫度適用于傳統的分批法(上文所述)和連續糖化法。實際上，必須在超過60。C的溫度下進行連續糖化法，所用溫度應能維持合理的高流量穿過膜，或者能使微生物污染最小化，所述糖化法包括一個或多個膜分離步驟，即過濾步驟。因此，本發明的熱穩定性變體提供了以較合理的成本和/或使用較低酶蛋白質劑量，在工業糖化法可接受的時間內進行大規模連續糖化法的可能性。根據本發明，糖化時間甚至可以縮短。在60。C至8(TC的溫度，本發明的葡糖淀粉酶變體(如AMG變體)的活性基本上高于傳統使用的30至60。C的溫度下的活性。因此，通過升高葡糖淀粉酶的工作溫度，可在較短的時間內進行糖化過程。另外，通過改善熱穩定性，TI/2("材料和方法"一節所定義的半壽期)也得以改善。由于本發明的葡糖淀粉酶變體的熱穩定性得以改善，只需加入很少量的葡糖淀粉酶以替代在糖化過程中失活的葡糖淀粉酶。在本發明的糖化過程中，更多的葡糖淀粉酶能維持活性。此外，當在高于63。C的溫度下進行糖化過程時，微生物污染的風險也有所降低。用葡糖淀粉酶，酸性淀粉酶和支鏈淀粉酶進行的典型糖化試驗中的葡萄糖產率為95.5至96.5%。其余的糖類一般由1%麥芽糖，1.5-2%異麥芽糖和1-1.5%高級寡糖組成。由于在高濃度的葡萄糖和高的干-固體水平存在下，葡糖淀粉酶具有形成回復突變產物的趨勢，因此也產生了二糖。對液化之后溶液中存在的糖類和糖化過程中形成的糖類的比活性提高的葡糖淀粉酶可能是有利的，因為隨后可使用降低的酶蛋白質劑量或縮短的處理時間。通常，相對于短鏈糖類而言，葡糖淀粉酶偏好由長鏈糖類組成的底物，因此，針對例如麥芽糖庚糖(maltoheptaose)的比活性比針對麥芽糖的比活性高約6倍。因此，針對短鏈糖類，如麥芽糖的比活性提高(不降低針對寡糖的活性)也允許使用較低酶劑量和/或較短處理時間。此外，用具有增加的a-l,4-水解活性(如果a-l,6活性未改變或甚至降4氐)的葡糖淀粉酶變體可得到較高的葡萄糖產量，由于使用了量有所降低的酶蛋白質，減少了a-l,6回復突變產物的形成(較少的異麥芽糖)。可使用"材料和方法"一節中所述的方法，在37。C或60。C下測定比活性。其中使用了本發明的葡糖淀粉酶變體的糖化方法的例子包括JP3-224493;JP1-191693;JP62-272987;EP452,238和WO99/27124中所述的方法(所有參考文獻皆并入本文作為參考)。另一方面，本發明涉及將液化淀粉溶液糖化的方法，所述方法包括步驟(i)糖化步驟，在該步驟中，發生了一個或多個酶促糖化過程，隨后的步驟是(ii)一個或多個高溫膜分離步驟，其中使用本發明的熱穩定性葡糖淀粉酶變體進行酶促糖化。在本發明的方法中，可組合使用本發明的葡糖淀粉酶變體和僅水解具有至少4個葡糖殘基的分子中的a-(1—6)葡糖苷鍵的酶。優選組合使用本發明的葡糖淀粉酶變體和支鏈淀粉酶或異淀粉酶。異淀粉酶和支鏈淀粉酶的脫支用途，酶的分子特性和具有葡糖淀粉酶活性的酶的潛在用途列于G.M.A.vanBeynum等，StarchConversionTechnology,MarcelDekker，紐約，1985，101-142。另一方面，本發明涉及本發明的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉變過程中的用途。另外，本發明的葡糖淀粉酶變體可用于包括連續糖化步驟的淀粉連續轉變過程。本發明的葡糖淀粉酶變體也可以固定化的形式使用。這是合適的，經常用于產生特制的糖漿，如麥芽糖糖漿，并進一步用于與果糖糖漿的生產有關的寡#唐的殘'液;克(raffmatestream)。本發明的葡糖淀粉酶也可用于生產燃料或飲料用乙醇的方法，或者用于生產有機化合物的發酵方法，所述有機化合物如檸檬酸，抗壞血酸，賴氨酸，谷氨酸。材料和方法材料酶AMGGl:黑曲霉葡糖淀粉酶Gl,公開于Boel等，1984,EMBOJ,3(5),1097-1102和SEQIDNO:13,可得自NovoNordisk。AMGG2:截短的黑曲霉葡糖淀粉酶Gl，示于SEQIDNO:2,可得自NovoNordisk。溶液緩沖液0.05M醋酸鈉(6.8g溶于1lmilli-Q-水中)，pH4.5終止纟容'液0.4MNaOHGOD-perid,124036，BoehringerMannheim底物麥芽糖29mM(lg麥芽糖溶于100ml50mM醋酸鈉，pH4.5)(Sigma)麥芽糖庚糖10mM,115mg/10ml(Sigma)宿主細胞米曲霉JaL125:米曲霉IFO4177得自InstituteforFermentation,Osaka;17-25JusoHammachi2-ChomeYodogawa-ku,Osaka,日本，其具有被稱為"alp"的堿性蛋白酶基因(描述于MurakamiK等，1991,Agric.Biol.Chem.,55,p2807-2811)缺失，所述缺失是通過使用米曲霉pyrG基因為標記，經一步基因耳又^j法(4苗述于G.May,"AppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi"，1992,p.1-25,J,R.Kinghom和G.Turner編；BlackieAcademicandProfessional)完成的。菌抹JaL125進一步描述于WO97/35956(NovoNordisk)。微生物菌林釀酒酵母YNG318:MATocleu2-A2ura3-52his4-539pep4-Al[cir+]質粒pCAMG91:見圖1，該質粒含有黑曲霉Gl葡糖淀粉酶(AMGGl),pCAMG91的構建描述于Boel等，1984,EMBOJ，3(7)，p.1581-1585。pMT838:該質粒編碼截短的黑曲霉葡糖淀粉酶G2(SEQIDNO:2)。pJSO026:(釀酒酵母表達質粒)(J.S.Okkels，1996,"AURA3-promoterdeletioninapYESvectorincreasestheexpressionlevelofafungallipaseinSaccharomycescerevisiae"，RecombinantDNABiotechnologyIII:TheIntegrationofBiologyandEngineeringScience,Vol.782oftheAnnalsoftheNewYorkAcademyofScience)。更具體地，通過用得自釀酒酵母的組成型表達的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Albert和Karwasaki,1982,J.Mol.Appl.Genet,1,419-434)替代pYES2.0的誘導型GALl-啟動子，并缺失URA3啟動子的一部分，由pYES2.0得到表達質粒pJSQ37。方法釀酒酵母YNG318的轉化混合DNA片段和開環載體，并通過標準方法轉化至酵母釀酒酵母YNG318中。測定以Keat(sec.")表示的比活性在選定的溫度下，如37。C或60。C，將750)al底物(l。/o麥芽糖，50mM醋酸鈉，pH4.3)保溫5分鐘。加入50pl用醋酸鈉稀釋的酶。在0，3，6，9和12分鐘之后取出100^1等分試樣，并轉移至100jil0.4M氫氧化鈉中以終止反應。也包括空白對照。將20jil轉移至微滴板中，加入200)lUGOD-Perid溶液，室溫下保溫30分鐘之后，在650nm下測定光吸收值。葡萄糖被用作標準，比活性凈皮計算為K^(sec")。測定AGU活性并表示為AGU/mg一個Novo淀粉葡糖苷酶單位(AGU)4史定義為于37。C和pH4.3,每分鐘水解lpM麥芽糖的酶量。分析方法(AEL-SM-0131)的詳細描述可根據要求由NovoNordisk提供。4吏用BoehringerMannheim的GlucoseGOD-Peridi式劑盒，124036,通過(AEL-SM-0131)的改良方法將活性測定為AGU/ml。標準AMG-標準，批號7-1195,195AGU/ml。于37°C,將375)il底物(l。/。麥芽糖，50mM醋酸鈉，pH4.3)保溫5分鐘。加入25pi用醋酸鈉稀釋的酶。10分鐘之后通過加入100]dl0.25M氫氧化鈉以終止反應。將20pl轉移至96孔微滴板中，加入200piGOD-Perid溶液，室溫下保溫30分鐘之后，在650nm下測定光吸收值，根據AMG-標準將活性計算為AGU/ml。然后用活性(AGU/ml)除以蛋白質濃度(mg/ml)，計算出比活性(AGU/mg)。米曲霉的轉化(一般方法)用米曲霉的孢子接種100mlYPD(Sherman等，1981,MethodinYeastGenetics,冷泉港實驗室)，振蕩培養約24小時。通過流經miracloth過濾以收獲菌絲體，并用200ml0.6MMgS04洗滌。將菌絲體懸浮于15ml1.2MMgS04，10mMNaH2PO4，pH5.8中。在水上冷卻懸浮液，加入1ml含有120mgNovozymTM234的緩沖液。5分鐘之后，加入lml12mg/mlBSA(Sigma型號H25)，于37。C持續緩慢攪拌保溫1.5至2.5小時，直至在顯微鏡下檢查出樣品中可見大量原生質體。通過miracloth過濾懸浮液，將濾液轉移至無菌的試管中，鋪一層5ml0.6M山梨糖醇，100mMTris-HCl,pH7.0。1000g離心15分鐘，從MgS04墊層的上部收集原生質體，在原生質體懸浮液中加入2體積的STC(1.2M山梨糖醇，10mMTris-HCl,pH7.5，10mMCaCl2)，以1000g將混合物離心5分鐘。將原生質體沉淀物重懸于3mlSTC中，并重新沉淀。重復該步驟，最終，將原生質體重懸于0.2-1mlSTC中。將lOOjil原生質體懸浮液與溶于lO)ilSTC中的5-25jagp3SR2(攜有構巢曲霉amdS基因的質粒，其描述于Hynes等，Mol.AndCd.Bioi.,Voi.3,No.8,1"0-1439,Aug.1983)混合。將混合物置于室溫放25分鐘，加入0.2ml60%PEG4000(BDH29576),10mMCaClz和10mMTris-HCl,pH7.5,小心混合(兩次)，最終加入0.85ml相同的溶液并小心混合。將混合物置于室溫放25分鐘，以2500g離心15分鐘，將沉淀物重新懸浮于2ml1.2M山梨糖醇中。再進行一次沉降之后，將原生質體鋪于基本平板(Cove，1966,Biochem.Biophys.Acta113,51-56)，所述平板含有1.0M蔗糖，pH7.0,以10mM乙酰胺為氮源，并含20mMCsCl以抑制背景生長。于37。C保溫4至7天之后，挑選孢子，懸浮于無菌水中，鋪平板以得到單菌落。重復該方法，儲存第二次重分離之后的單菌落孢子，將其作為確定的轉化子。補料分批發酵在含有麥芽糖糊精作為碳源，尿素作為氮源，和酵母提取物的培養基中進行補料分批發酵。通過將所述米曲霉宿主細胞的搖瓶培養物接種于含有3.5%碳源和0.5%氮源的培養基中來進行補料分批發酵。在pH5.0和34。C下培養24小時之后，開始持續補加碳源和氮源。碳源被當成限速因子，它可以確保存在過量的氧。補料分批培養持續4天，然后通過離心，超濾，清洗過濾和除菌過濾回收酶。純化過濾培養液(culturebroth)，加入硫酸銨(AMS)至濃度為1.7MAMS，將pH調節為pH5。離心除去沉淀的物質，將含有葡糖淀粉酶活性的溶液上樣于預先用1.7MAMS，20mM醋酸鈉，pH5平4軒過的ToyoPearlButyl柱。使用1.7至0MAMS的線性梯度，用超過10倍柱體積的lOmM醋酸鈉，pH4.5洗脫結合的蛋白質。收集含葡糖淀粉酶的級分，對著20mM醋酸鈉，pH4.5進行透析。然后將溶液上樣于預先用10mMPiperazin，Sigma，pH5.5平tf過的QSepharose柱。用平衡緩沖液洗下未結合的物質。用超過IO倍柱體積的10mMPiperazin,pH5.5中的0-0.3M氯化鈉線性梯度洗脫結合的蛋白質。收集含葡糖淀粉酶的級分，通過SDS-PAGE確定純度。T^(半壽期)方法I使用下列方法將變體的熱穩定性測定為T1/2:于68X:或7(TC，將950^150mM醋酸鈉緩沖液(pH4.3)(NaOAc)保溫5分鐘。加入50/al溶于緩沖液中的酶(4AGU/ml)。在0,5，10，20,30和40分鐘之后耳又出2x40|il樣品，并在水上冷卻。將保溫之前(O分鐘)測定的活性(AGU/ml)用作對照(100。/。)。穩定性的降低(以百分比表示)被計算為保溫時間的函數。在不同的時間測定％殘留的葡糖淀粉酶活性。了1/2是直至％相對活性降低為50%所花的時間。T^(半壽期)(方法II)通過在所述溫度(如70。C)下，在30%葡萄糖，50mM醋酸鈉，pH4.5中保溫所述酶(ca0.2AGU/ml)來測定T^。在給定的時間間隔取出樣品，置于冰上冷卻，并通過pNPG法(如下文所述)測定殘留的酶活性。在不同的時間測定％殘留的葡糖淀粉酶活性。T/2是直至％相對活性降低為50%所花的時間。殘留的酶活性(pNPG法)pNPG試劑將0.2gpNPG(對-硝基苯基葡糖吡喃糖苷)溶解于0.1M醋酸鹽緩沖液(pH4.3)，并將體積調節至100ml。硼酸鹽溶液將3.8gNa2B4O7'10H2O溶解于Milli-Q水中，并將體積調節為lOOml。在25^U樣品中加入50jil底物，于5(TC保溫2小時。通過加入150nl硼酸鹽溶液以終止反應。測定405nm處的光密度，計算殘留的活性。構建pAMGY按下述構建pAMGY載體用AMG基因取代pJS0026中的脂肪酶基因，AMG基因是使用含有AMG基因的模板質粒pLAC103，用正向引物FG2:5，-CATCCCCAGGATCCTTACTCAGCAATG-3,和反向引物RG2:5'-CTCAAACGACTCACCAGCCTCTAGAGT-3，經PCR擴增得到的。于37。C,用Xbal和Smal將pJS〇026質粒消化2小時，使用Klenow片段將PGR擴增子成為平端，然后用XbaI消化。連接載體片段和PCR擴增子，通過電轉化轉化至大腸桿菌。所得載體被稱為pAMGY。構建pLaC103黑曲霉AMGIIcDNA克隆(Boel等，1984,文獻同上)被用作來源以構建pLaC103，從而在釀酒酵母中表達GII型AMG。按下述幾個步驟進行構建。用Xbal裂解pT7-212(EP37856/US專利5162498)，用KlenowDNA聚合酶和dNTP使其成為平端。用EcoRI裂解之后，從瓊脂糖凝膠電泳中純化所得的載體片段，并與pBoel53的2.05kbEcoRI-EcoRV片段連接，籍此在所得質粒pG2x中重新產生位于AMG編碼片l殳的EcoRV末端的Xbal位點。為了除去AMG編碼序列上游的DNA,并在編碼AMG的DNA中安插適當的限制性內切核酸酶識別位點，需制備下列構建體分離p53的930bpEcoRI-Pstl片段，用Alul裂解，將所得771bpAlu-Pstl片段連接至具有平端EcoRI位點的pBR322(見上文)，并用Pstl裂解。在所得質粒pBR-AMG，中，在離AMG編碼序列起始密碼子僅34bp的位置處重新產生了EcoRI位點。從pBR-AMG，中分離775bpEcoRI-PstI片段，并在包括pT7-212的Xbal-EcoRI載體片段的連接反應中與pG2x的1151bpPstl-Xbal片段連接。在堿性磷酸酶的存在下，用BamHI裂解所得質粒pT7GI1，滅活磷酸酶之后用SpM進行部分消化。由此反應得到2489bpSpM-BamHI片段，其含有與AMGII編碼序列相連的釀酒酵母TPI啟動子。上述片段和pT7GI1的1052bpBamHI片段與經石威性石壽酸酶處理的，由得質粒是pLaC103。"''；篩選熱穩定性AMG變體在下文所述的熱穩定性濾膜試驗中篩選文庫。濾膜試驗分析熱穩定性于30°C,將酵母文庫鋪于含100|ig/ml氨芐青霉素的SCFura-瓊脂平板上的醋酸纖維素(OE67，Schleicher&Schuell,Dassd,德國)-和硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba85，Schleicher&Schuell，Dassel,德國)的夾層中放置至少72小時。將菌落影印鋪板于用曱醇激活1分鐘的PVDF濾膜(Immobilon-P,Millipore，Bedford),或者Protran濾膜(未激活)，隨后用0.1MNaAc洗滌，置于室溫下保溫2小時。用自來水洗滌PVDF/Protran濾膜上的菌落，在保溫之前用針頭特異性標記各個濾膜夾層和PVDF/Protmn濾膜，從而能在篩選之后將陽性變體定位于濾膜上。將具有結合變體的PVDF濾膜轉移至含O.lMNaAc,pH4.5的容器中，于47。C保溫(如果是Protran濾膜，則在6入^。C保溫)15分鐘。室溫下儲存SCura-瓊脂平板上的醋酸纖維素和硝酸纖維素濾膜的夾層直至使用。保溫之后，在含有5%麥芽糖，1%瓊脂糖，50mMNaAc,pH4.5的平板上檢測殘留的活性。按與濾膜夾層相同的方式標記具PVDF濾膜的檢測平板，50。C保溫2小時。取出PVDF濾月莫之后，用GlucoseGODperid(BoehringerMannheimGmbH，德國)染色檢測平板。在白色背景上，檢測平板上具有殘留活性的變體被檢測為暗綠色的點。改良變體位于儲存平板上。在與第一次篩選相同的條件下將改良變體再篩選2次。使用摻加方案進行隨機誘變的一般方法通過下列步驟進行隨機誘變1.在親代酶中選擇需修飾的區域，2.確定選定區域中的突變位點和無需突變的位點，3.確定應進行何種類型的突變，例如與所構建的變體的所需穩定性和/或性能相關的突變，4.選擇結構合理的突變，5.考慮到步驟4,調整步驟3所選擇的殘基，6.利用適當的摻加算法分析核芬酸分布，7.必要時，將需要的殘基調整為實際的遺傳密碼，例如考慮到遺傳密碼的局限性，例如為了避免導入終止密碼子；本領域技術人員會意識到在實踐中不能使用一些密碼子的組合，而需改動這些組合，8.制備引物，9.使用引物進行隨機誘變，10.通過篩選所需的改良特性來選擇所得的葡糖淀粉酶變體。摻加算法規則用于步驟6的適當的摻加算法是本領域眾所周知的。一個這種算法描述于Tomandl,D等,1997,JournalofComputer-AidedMolecularDesign,11:29-38。另一個算法是DOPE(Jensen,LJ,Andersen,KV，Svendsen,A和Kretzsch匿,T,1998,NucleicAcidResearch,26:697-702)。使用分子模擬推斷出溫度活性重要區的方法對目的酶(本文是AMG)的X-射線結構和/或模型-制作結構進行分子動力學模擬。使用CHARMM(得自分子模擬(MSI))程序或其它適當程序，如DISCOVER(得自MSI)進行分子動力學模擬。所述動力學模擬在真空，或包括結晶水，或與包埋于適當水體如球體或盒中的目的酶一起進行。模擬進行300皮秒(ps),或更長時間，如300至1200ps。推斷出結構中CA碳的各向同性波動，并且進行結構之間的比較。有關如何獲得各向同性波動的詳細描述見于CHARMM手冊(得自MSI)(并入本文作為參考)。可使用可帶電氨基酸上的標準電荷進行分子動力學模擬。例如，Asp和Glu帶負電，Lys和Arg帶正電。此狀況類似于約7.0的中性pH。為了分析較低的pH,可以滴定分子以便得到正常可滴定殘基在pH2-10的pKa變化；所述殘基為Lys,Arg，Asp,G〗u,Tyr和His。Ser，Thr和Cys也是可滴定的，但是不在考慮之列。此處，因pH所致的電荷改變^皮描述為在高pH時Arg,Lys都帶負電，Asp,Glu都不帶電。這模仿了4至5的pH，此時一般會發生Asp和Glu的滴定。通過使用MSI程序包中的HOMOLOGY模型可獲得目的酶的模型構建。泡盛曲霉變體X100的晶體結構可見于例如Brookhaven數據庫中的3GLY和1D0G。實施例實施例1構建AMGG2變體定點誘變為了構建AMGG2(SEQIDNO:2)的變體，按供應商的說明使用了市售的Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒。通過在含有AMGGl形式的質粒pCAMG91(見圖l)中缺失介于G2第1362位核苷酸和G2第1530位核苷酸之間的DNA,制備pMT838，將編碼所述AMGG2酶的基因置于上述pMT838上。按說明書用以下引物7258:5，pgaatgacttggttgacgcgtcaccagtcac3，(SEQIDNO:3)將pMT838中氨千青霉素基因的Scal位點轉換為Mlul位點(從而改變在氨芐青霉素抗性基因中發現的Scal位點，并用于切割Mlul位點)。然后將含有所述AMG基因的pMT838載體用作DNA聚合酶、寡聚核苷酸7258(SEQIDNO:3)和21401(SEQIDNO:4)的模板。引物編號21401(SEQIDNO:4)作為選擇引物使用。21401:5，pggggateatgataggactagccatattaatgaagggcatataccacgccttggacctgcgttatagec3，(改變了在AMG基因中發現的Seal位點但未改變氨基酸序列)通過添加含所需突變的相應寡聚核苷酸將所需突變(如半胱氨酸殘基的引入)引入所述AMG基因中。引物107581用于引入T12P107581:5，pgcaacgaagcgcccgtggetcgtac3，(SEQIDNO:5)通過對整個基因測序來檢驗突變。使用上文"材料與方法"部分所述的方法，將所述質粒轉入米曲霉。并如上文"材料與方法"部分所述發酵和純化變體。實施例2通過局部隨機摻加誘變來構建比親代酶熱穩定性增強的黑曲霉AMG變體在黑曲霉AMG的預選區實施隨機誘變以增強熱穩定性。殘基區域L19-G35區域A353-V374用DOPE軟件(見材料與方法)測定上述區域中每一所示的改變的插入(spiked)密碼子以使終止密碼子的量減至最少(見表1)。計算密碼子的三個位置中核苷酸的真實分布，從而得出所示的氨基酸改變的群體。在指定位置對摻加區域進行特異性摻加，從而能有較多機會獲得所需殘基，但仍允許有其它可能性。第一列為待突變的氨基酸，第二列為野生型的百分率，第三列為新的氨基酸。表1在L19-G35中的摻加90%nn2095%tn21恒定不變的222恒定不變的g2395%aa2490%s,td2593%s,tg2s95%aa"90%s,tw2s<s0%r,yv29恒定不變的s3093%t,ng3195%aa32vd3380%r,ks3490》g35恒定不變的所得摻加寡核苷酸鏈示于表2，為有義鏈包含引物序列、野生型核苷酸序列、親代氨基酸序列及每一摻加位置的核苷酸分布。表2:位置192021222324252627氨基酸序列:IjIGADGA引物12TA3TAACATCG4G5CG67CG4T8CT野生型核Wf列ctgaa丁aacggggcggacggtgct位置辨):282930313233343S酸序列(續):WVSGADSG引物91010GTG1112CG4CG13G1415161718TGGC野生型核銅姊列tgggtgtcgggcgcggactctggc每一摻加位置的核普酸分布:1:A10,C902:A6,T943:A95,C54:G95,CS5:G91,A3,T3,C36:G95,A3,C27:G3,A95,C28:G92,A4,T49:A3,T9710:G95,TS11:G3,A9712:G95,A2,C313:T5,C9514:G88,A8,C415:G7,A9316':G4,C9617:G4,A9618:G95,A2,C3正向引物(SEQIDNO:6):F腦II、5-CGAAGCGACCGTGGCTCGTACTGCCATC12TA3TAACATCG4G5CG67CG4T8CT91010GTG1112CG4CG13G1415161718TGGCATTGTCGTTGCTAGTCCCAGCACGGATAAC-3'反向引物(SEQIDNO:7):RAMG1:5，-GATGGCAGTACGAGCCACGGTCGCTTCG-3，表3在A353-V374區中的4參加A353<80%Q,N,YL35490%Q,EY35590%N,QS35S90%T,D,NG35780%P,A,S,TA35893%SA35990%S,T,NT36090%R,KG3S185%A,S,TT36290%SY363恒定不變^S36493%DS36593%N,Q,KS3"93%P,DS367恒定不變的S3S893%D,N,TT36993%Q,EY370恒定不變的S37193%NS37293%N,T1373恒定不變^V374，N,Y,H所得摻加寡核苷酸鏈示于表4，為有義鏈包含引物序列、野生型核苷酸序列、親代氨基酸序列及每一摻加位置的核苷酸分布。表4:位置353354355356357358359360氨基酸序歹'J:ALYSDAAT引物12345A6AC78C910T11CT1213T1415A野生型核^g^'列GCACTGTACAGCGATGCTGCTACT361362GT1617C18CCGGCACC位置(續):363364365#A酸序列(續):YSS引妝TAC1920TA2122野生型核^/f列:TACTCTTCG3"367368369370SSSTY2324CAGT1425C2627GT2BT丁CCAGTTCGACTTAT位置(續)371372373374to酸序列(續)SSIV引4勿A16T2930TATT313233野生型核^S^f"列AGTAGCAT丁G丁A每一摻加位置的核苷酸分布。1:G91,A3,T3,C32:A13,C873:A40,T604:G3,A3,CS45:A6,T946:G4,A4,T927:G2,A36,C28:GS3,A3.5,C3.59:G87,A8,C510:A84,C1S11:G93,T712:G92,A5,T313:A3,C9714:G3,A9715:G2,A2,T4,C9216:G93,A717:G93,C718:A90,T1019:G4,A9620:G95,A521:G96,A422:G3,CS723:G2,A1,T95,C224:A3,C9725:G95,A3,C22S:G2,A9S,C227:A5,C9528:A95,T529:G2,A9830:G94,A4,C231:G94,A3,T1,C232:A4,T9633:A20,C80引物FAMGIV(SEQIDNO:8)5'-GTGTCGCTGGACTTCTTCAAG12345A6AC78C910T11CT1213T1415A1"7C18CCTAC"20TA21222324CAGT1425C2627GT28TA16丁2330CATT313233GATGCCGTGAAGACTTTCGCCGA-3"引物RAMGVI(SEQIDNO:9)5-cttgaagaagtccagcgacac-3'隨機誘變使用表2和3中顯而易見的插入的寡核苷酸(其通用術語稱為FAMG)、L19-G35的反向引物RAMG,以及特異性SEQIDNO:2引物，包含N末端的引物(FG2:5，-CATCCCCAGGATCCTTACTCAGCAATC-3,(SEQIDNO:IO)和包含C末端的引物(RG2:5，-CTCAAACGACTCACCAGCCTCTAGAGT(SEQIDNO:11),以通過重疊延伸法(Horton等，Gene,77(1989),第61-68頁)產生帶有21個堿基對的一段重疊的PCR-文庫-片段。質粒pAMGY是聚合酶鏈式反應的模板。經同源重組在大腸桿菌/酵母穿梭質粒pAMGY中克隆PCR片段(見材料和方法)。篩選如上面"材料和方法"部分所述，在熱穩定性濾膜試驗中用Protran濾膜，并在67-69。C溫育，以篩選文庫。實施例3通過有DNA寡聚核苷酸插入的PCR改組來構建比親代酶熱穩定性增強的黑曲霉AMG變體用聚合酶鏈式反應(PCR)方法制備攜帶AMG基因及側翼區的DNA片段。用DNA酶消化約lO)igDNA，并在2%瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠上純化50-150bp的片段。將約l叱純化片段與5-15倍摩爾過量的攜帶所需突變的寡聚核芬酸混合。寡聚核香酸是如下類型的(分別用于構建Hklib1,Hklib2,Hklib3等)Hklibl:Hkl-T2X:5'-A丁GTGATTTCCAAGCGCGCGVNNTTGGATTCATGGTTGAGCAAHkl-N9X:5.'-CCTTGGATTCATGGTTGAGCVNNGAAGCGACCGTGGCTCGTACHkl-AllX:5'-ATTCATGGTTGAGCAACGAAVNNACCGTGGCTCGTACTGCCAT5'-TCCTCAAGACCCTCGTCGATVNNTTCCGAAATGGAGATACCAGHkl-S386X:5'-CTTTCGCCGATGGCTTCGTCVNNATTGTGGAAACTCACGCCGC5'-ATGGCTTCGTCTCTATTGTGVNNACTCACGCCGCAAGCAACGGHkl-T390Xi5,-GC丁TCGTCTCTATTGTGGAAVNNCACGCCGCAAGCAACGGCTCHkl-A393X.'5'-CTATTGTGGAAACTCACGCCVNNAGCAACGGCTCCATGTCCGAHkl-S394X:5'-TTGTGGAAACTCACGCCGCAVNNAACGGCTCCATGTCCGAGCAHkl-N395X:5'-TGGAAACTCACGCCGCAAGCVNNGGCTCCATGTCCGAGCAATAHkl-G396X:5'-AAACTCACGCCGCAAGCAACVNNTCCATGTCCGAGCAATACGAHkl-K404X:5'-CCATGTCCGAGCAATACGACVNNTCTGATGGCGAGCAGCTTTCHkl-D406X:5'-CCGAGCAATACGACAAGTCTVNNGGCGAGCAGCTTTCCGCTCGHkl-E408X:5'-AATACGACAAGTCTGATGGCVNNCAGCTTTCCGCTCGCGACCTHkl-L410X:5'-ACAAGTCTGATGGCGAGCAGVNNTCCGCTCGCGACCTGACCTHkl-!L423X:5'-CCTGGTCT丁ATGCTGCTCTGVNNACCGCCAACAACCGTCGTAAHkl-N426X:5'-ATGCTGCTCTGCTGACCGCCVNNAACCGTCGTAACTCCGTCGTGHkl-N427X:5'-CTGCTCTGCTGACCGCCAACVNNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCTHkl-Y402X:5*-ACGGCTCCATGTCCGAGCAANNCGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCTHklib2sHk2-!L234X-SENSEs5,-CTGGACCGGCAGCTTCATTNNKGCCAACTTCGATAGCAGCCHk2-A235S^ANTISENSE:5'-GAACGGCTGCTATCGAAGTTAGACAGAATGAAGCTGCCGGTCHk2-F237X-SENSE5-CAGCTTCATTCTGGCCAACNATGATAGCAGCCGTTCCGGCAHk2-D238T-ANTISENSE:5'-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGTGAAGTTGGCCAGAATGAAGCHk2-D238S-ANTISENSE:.5'-CCTTGCCGGAACGGCTGCTAGAGAAGTTGGCCAGAATGAAGCH3c2-S23SX-SENSE5'-TCATTCTGGCCAACTTCGATNNCAGCCGTTCCGGCAAGGACGHk2-S240G-ANT工SENSE:5'-TTGCGrCCTTGCCGGAACGACCGCTATCGAAGTTGGCCAGAAHk2-S242X-ANTISENSE':'5'-GGGTGTTTGCGTCCTTGCCAKNACGGCTGCTATCGAAGTTGH3c2-G243X-ANT工SENSE5'-GGAGGGTGTTTGCGTCCTTAKKGGAACGGCTGCTATCGAAGHlc2-K:244R-SENSE:5'-CGATAGCAGCCGTTCCGGCAGAGACGCAAACACCCTCCTGGHk2-T310V-ANT工SENSE-'5*-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAACGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-T310S-ANT工SENSE:5'-ACGGGTTGCCGTTGTAGTAAGAGTCCTCAGGGTACCGACCCHk2-Y3UN-SENSE:5'-TCGG丁ACCCTGAGGACACGAATTACAACGGCAACCCGTGGTHk2-Y312Q-ANTISENSE:5,-GGAACCACGGGTTGCCGTTTTGGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-Y312N-ANTISENSE:5'-GGAACCACGGGTTGCCGTTATTGTACGTGTCCTCAGGGTACHk2-N313T-SENSE:5'-CCCTGAGGACACGTACTACACTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHlc2-N313S-SENSE:5'-CCCTGAGGACACGTACTACTCTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N313G-SENSE:5'-CCCTGAGGACACGTACTACGGTGGCAACCCGTGGTTCCTGTHk2-N315Q-ANT工SENSE:5*-AGGTGCACAGGAACCACGGTTGGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315E-ANTISENSE:5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTTCGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-N315R-ANTISENSE5'-AGGTGCACAGGAACCACGGTCTGCCGTTGTAGTACGTGTCCHk2-F318Y-ANTISENSE:5,-CGGCAGCCAAGGTGCACAGATACCACGGGTTGCCGTTGTAGHk2-Q409P-SENSE:5'-CGACAAGTCTGATGGCGAGCCACTTTCCGCTCGCGACCTGAHklib3:Hk3-D336X-SENSE:5'-CGATGCTCTATACCAGTGGNNKAAGCAGGGGTCGTTGGAGGHk3-K337X-SENSE:5'-TGCTCTATACCAGTGGGACNNKCAGGGGTCGTTGGAGGTCAHk3-Q338X-ANT工SENSE:5'-CTGTGACCTCCAACGACCCGNNCTTGTCCCACTGGTATAGAHk3-G339X-SENSE:5*-ATACCAGTGGGACAAGCAGUCUTCGTTGGAGGTCACAGATGHk3-S340X*-ANTISENSE:5'-ACACATCTGTGACCTCCAAANTCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-S340X''-ANT工SENSE:5*-ACACATCTGTGACCTCCAAANCCCCCTGCTTGTCCCACTGGHk3-L341X-SENSEs5*-GTGGGACAAGCAGGGGTCGNUUGAGGTCACAGATGTGTCGCHk3-K352Q-SENSE:5'-TGTGTCGCTGGACTTCTTCCAAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-K352R-SENSE:5'-TGTGTCGCTGGACTTCTTCAGAGCACTGTACAGCGATGCTGHk3-A353D-ANTISENSE:5'-TAGCAGCATCGCTGTACAGATCCTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-A353S-ANTISENSE:5'-TAGCAGCATCGCTGTACAGAGACTTGAAGAAGTCCAGCGACHk3-S356P-SENSE:5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACCCAGATGCTGCTACTGGCACCTHk3-S356N-SENSE:5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACAAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-S356D-SENSE:5'-ACTTCTTCAAGGCACTGTACGAUGATGCTGCTACTGGCACCTAHk3-D357S-ANT工SENSE:5'-GAGTAGGTGCCAGTAGCAGCAGAGCTGTACAGTGCCTTGAAGAHk3-A359S-SENSE:5'-GGCACTGTACAGCGATGCTTCTACTGGCACCTACTCTTCGTHk3-T36OV-ANT工SENSE:5'-TGGACGAAGAGTAGGTGCCAACAGCAGCATCGCTGTACAGTHk3-G361X-SEN.SE:5'-TGTACAGCGATGCTGCTACTNCT^CCTACTCTTCGTCCAGTTCHk3-T362R-ANTISENSE:5'-GTCGAACTGGACGAAGAGTATCTGCCAGTAGCAGCATCGCTGHk3-S364X-SENSE:5'-TGCTGCTACTGGCACCTACNNKTCGTCCAGTTCGACTTATAGH3c3-S365X-SENSE:5,-TGCTACTGGCACCTACTCTNNKTCCAGTTCGACTTATAGTAGHlc3-S366T-ANT工SENSE:5'-ATGCTACTATAAGTCGAACTAGTCGAAGAGTAGGTGCCAGTAHk3-S368X-ANT工SENSE:5'-TCTACAATGCTACTATAAGTAGNACTGGACGAAGAGTAGGTGHk3-T369X-SENSE:5,-CTACTCTTCGTCCAGTTCGNNKTATAGTAGCATTGTAGATGCCHk3-S37IX-ANT工SENSE:5,-TTCACGGCATCTACAATGCTATNATAAGTCGAACTGGACGAAGHk3-S372X-SENSE:5'-CGTCCAGTTCGACTTATAGTNNTATTGTAGATGCCGTGAAGAC向DNA酶處理的DNA與寡聚核苷酸的混合物中添加核苦酸、PCR緩沖液和Taq/Pwo聚合酶。實施PCR裝配反應，條件為首先94°C2分鐘，然后94。C30秒、45。C30秒、72°C60秒共進行35-40個循環；最后72°C5分鐘。以lpl裝配反應物為模板，并加入與AMG基因側翼區退火的引物，進行PCR擴增反應。參數為首先94。C2分鐘，然后以94。C30秒、55'C30秒、72°C90秒進行35-40個循環；最后72°C10分鐘。由1a/。瓊脂糖凝膠純化所得PCR產物，將其與線性化的載體混合并轉化至感受態的酵母細胞中，如上所述。實施例4比活性如上實施例1所述構建的AMGG2變體。以Keat表示的比活性在純化樣品上，以pH4.3,37。C的條件，用麥芽糖和麥芽糖庚糖為底物，如在"材料和方法"部分所述進行測定。以AGU/mg表示的比活性也在pH4.3,37°C，用麥芽糖為底物，如在"材^["和方法"部分所述進行測定。Kcat(sec-1)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實施例5在7(TC時的熱穩定性用實施例1所述方法構建AMGG2S119P變體。按上文"材料和方法"部分所述，使用方法I將熱穩定性測定為T1/2,在50mMNaOAc,pH4.5,70°C,0.2AGU/ml中保溫30分鐘之后將熱穩定性測定為％殘留活性。試驗結果列于下表，并將試驗結果與野生型黑曲霉AMGG2相比。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實施例668'C時的熱穩定性使用實施例3所述的方法構建AMGG2變體，只是下表中的第1和2號變體是通過按WO95/22625(來自AffymaxTechnologiesN.V.)所述的改組而制備的。如上文"材料和方法"部分所述，于68。C使用方法I將熱穩定性測定為T1/2,并與相同條件下的野生型黑曲霉AMGG2比較。過濾上清液之后對培養液進行變體的評價。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實施例7在68'C的熱穩定性用實施例3所述方法并隨后改組陽性變體，從而構建AMGG2變體。如"材料和方法"部分所述使用方法I在68'C將熱穩定性測定為T1/2,并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMGG2相比較。將上清過濾后對培養液進行變體的評估。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>i為N末端延伸實施例8在68'C的熱穩定性用實施例3所述方法構建AMGG2變體。如"材^f"和方法，，部分所述使用方法I在68。C將熱穩定性測定為T1/2,并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMGG2相比較。將上清過濾后對培養液進行變體的評估。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例9在70'C的熱穩定性用實施例1所述方法構建AMGG2變體，并評價為半純化(將培養液過濾，再于G-25柱上脫鹽)樣品。用方法I在50mMNaOAc,pH4.5,70°C,如以上"材料和方法"部分所述將熱穩定性測定為％殘留活性。檢驗結果列于下表，并與黑曲霉AMGG2比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例10在7(TC時存在30%葡萄糖的情況下的熱穩定性用實施例3的方法構建AMGG2變體。用方法II在7(TC如"材料和方法"部分所述將熱穩定性測定為T1/2，并與同樣條件下的野生型黑曲霉AMGG2比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例11AMG變體S119P+Y402F+S411V和PLASD(N-末端)+V59A十A393R+T490A各自的糖化性能AMG變體S119P+Y402F+S411V和PLASD(N-末端)+V59A+A393R十T490A均具有改良的熱穩定性，在7(TC時如下述測定了它們各自的糖化性妙參照酶為野生型黑曲霉AMGG2。糖化在如下條件進行底物10DE麥芽糖糊精，約30%DS(w/w)溫度70°C起始pH4.3(在70°C)酶的用量0.24AGU/gDS糖化通過如下方法制備糖化的底物將(從普通玉米制備的)麥芽糖糊精溶于沸騰的Milli-Q水中，并將干物質調節為約30%(w/w)。pH調至4.3。將相當于15g干物質的底物的等分試樣轉移至50ml蘭帽玻璃燒瓶中，并置于水浴中攪拌。加入酶，必要時重新調整pH。重復實驗。定期取樣，在HPLC上分析測定4唐的組成。序列表(1)序列資料(1)申請人:(A)姓名NOVONORDISKA/S(B)街道NovoAlle(C)城市DK-2880Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵編DK-2880(G)電話+4544448888(H)電傳+4544493256(ii)發明標題葡糖淀粉酶變體(iii)序列l丈81(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNO:1的資料(i)序列特征(A)長度1605個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc="cDNA"(vi)來源(B)菌抹黑曲霉(ix)特征(A)名稱/關鍵詞信號肽(B)位置1..72(ix)特征(A)名稱/關鍵詞成熟肽(B)位置73..1602(ix)特征(A)名稱/關#:詞CDS(B)位置1..1602(xi)序列描述SEQIDNO:ATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCCMetSerPheArgSerLeuLeuAla-24-201CTGAGCLeuSer_15TTGGCAAATGTGATTTCCAAGLeuAlaAsnVallieSerLysCGCArgAACGAAGCGACCGTGGCTAsnGluAlaThrValAla10GACGGTGCTTGGGTGTCGAspGlyAlaTrpValSer2530CCCAGCACGGATAACCCGProSerThrAspAsnPro45CGTArg15GGCGlyGACAspACTThrGCGAlaGCGAlaGCCAlaGACAspTACTyrTTCPheACCThrATClieTCTSerTACTyr50GGCGlyTTGLeuCTGLeuCTCGTCLeuValTGCACACysThr-10GGCGly35ACCThrGATAspAATAsn20ATTlieTCASerAACAsnGTCValTGGTrpATClieGTTValTGGTrpACTCGCThrArgTTGLeuGGGGlyGCTAlaGACAsp55GGGGlyAGCSerGCGAlaAGTSer40TCTSerGGTGlyAGTSerCAGGluCTCGTCLeuValCTCCTCLeuLieu75GGTATCGlylieCTCAAGLeuLys60ACCCTCGTCThrlieuValTCCACCATTGAGAACSerThrlieGluAsn80GATCTCTTCCGAAATGGAGATACCAspLeuPheArgAsnGlyAspThr6570TACATCTCCGCCCAGGCAATTGTCTyrlieSerAlaGinAlalieVal85AGTAACCCCTCTGGTGATCTGTCCAGCGGCGCTGGTCTCSerAsnProSerGlyAspLeuSerSerGlyAlaGlyLeu9095100GGTGAACCCAAGTTCAATGTCGATGAGACTGCCTACACTGGTTCTTGGGlyGluProLysPheAsnValAspGluThrAlaTyrThrGlySerTrp1051101151204896144192240288336384432GGACGGCCGCAGCGAGATGGTCCGGCTCTGAGAGCAA亡TGCTATGATCGlyArgProGinArgAspGlyProAlaLeuArgAlaThrAlaMetlie125130135480GGCTTCGGGCAGTGGCTGCTTGACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGlyPheGlyGinTrpLeuLeuAspAsnGlyTyrThrSerThrAlaThr140145ISO528GACATTGTTTGGCCCCTCGTTAGGAACGACCTGTCGTATGTGGCTCAAAsplieValTrpProLeuValArgAsnAspLeuSerTyrValAlaGin15516016S576TACTGGAACCAGACAGGATATGATCTCTGGGAAGAAGTCAATGGCTCGTyrTrpAsnGinThrGlyTyrAspLeuTrpGluGluValAsnGlySer170175180624TCTTTCTTTACGATTGCTGTGCAACACCGCGCCCTTGTCGAAGGTAGTSerPhePheThrlieAlaValGinHisArgAlaLeuValGluGlySer185190195200672GCCTTCGCGACGGCCGTCGGCTCGTCCTGCTCCTGGTGTGATTCTCAGAlaPheAlaThrAlaValGlySerSerCysSerTrpCysAspSerGin205210215720GCACCCGAAATTCTCTGCTACCTGCAGTCCTTCTGGACCGGCAGCTTCAlaProGlulielieuCysTyxLeuGinSerPheTrpThrGlySerPhe220225230768ATTCTGGCCAACTTCGATAGCAGCCGTTCCGGCAAGGACGCAAACACClieLeuAlaAsnPheAspSerSerArgSerGlyLysAspAlaAsnThr23S240245816CTCCTGGGAAGCATCCACACCTTTGATCCTGAGGCCGCATGCGACGACLeuLeuGlySerlieHisThrPheAspProGluAlaAlaCysAspAsp250255260864TCCACCTTCCAGCCCTGCTCCCCGCGCGCGCTCGCCAACCACAAGGAGSerThrPheGinProCysSerProArgAlaLeuAlaAsnHisLysGlu265270275280912GTTGTAGACTCTTTCCGCTCAATCTATACCCTCAACGATValValAspSerPheArgSerlieTyrThrLeuAsnAsp285290GACAGCGAGGCTGTTGCGGTGGGTCGGTACCCTGAGGACAspSerGluAlaValAlaValGlyArgTyrProGluAsp300305AACGGCAACCCGTGGTTCCTGTGCACCTTGGCTGCCGCAAsnGlyAsnProTrpPheLeuCysThrLeuAlaAlaAla315320325TACGATGCTCTATACCAGTGGGACAAGCAGGGGTCGTTGTyrAspAlaLeuTyrGinTrpAspLysGinGlySerLeu330335340GGTCTCAGTGlyI>euSer295ACGTACThrTyx310GAGGluGAGGluCAGGinGTCValTACTyrTTGLeuACAThrACTThr360GATGTGTCGCTGGACTTCTTCAAGGCACTGTACAGCGATGCTGCTAspValSerLeuAspPhePheLysAlaLeuTyrSerAspAlaAla345350355GGCACCTACTCTTCGTCCAGTTCGACTTATAGTAGCATTGTAGATGCCGlyThrTyrSerSerSerSerSerThrTyrSer'SerlieValAspAla365370375GTGAAGACTTTCGCCGATGGCTTCGTCTCTATTGTGGAAACTCACGCCValLysThrPheAlaAspGlyPheValSerlieValGluThrHisAla380385390GCAAGCAACGGCTCCATGTCCGAGCAATACGACAAGTCTGATGGCGAGAlaSerAsnGlySerMetSerGluGinTyrAspLysSerAspGlyGlu395400405CAGCTTTCCGCTCGCGACCTGACCTGGTCTTATGCTGCTCTGCTGACCGinLeuSerAlaArgAspLeuThrTrpSerTyrAlaAlaLeuLeuThr41041542096010081056110411521200124812961344GCCAACAACCGTCGTAACTCCGTCGTGCCTGCTTCTTi3GGGCGAGACC1392AlaAsnAsnArgArgAsnSerValValProAlaSerTrpGlyGluThr425430435"0TCTGCCAGCAGCGTGCCCGGCACCTGTGCGGCCACATCTGCCATTGGT1440SerAlaSerSerValProGlyThrCysAlaAlaThrSerAlalieGly445450455ACCTACAGCAGTGTGACTGTCACCTCGTGGCCGAGTATCGTGGCTACT1488ThrTyrSerSerValThrValThrSerTrpProSerlieValAlaThr"0465470GGCGGCACCACTACGACGGCTACCCCCACTGGATCCGGCAGCGTGACC1536GlyGlyThrThrThrThrAlaThrProThrGlySerGlySerValThr475480485TCGACCAGCAAGACCACCGCGACTGCTAGCAAGACCAGCACCACGACC1584SerThrSerLysThrThrAlaThrAlaSerLysThrSerThrThrThr490495500CGCTCTGGTATGTCACTGTGA1605ArgSerGlyMetSerLeu505510(2)SEQIDNO:2的資料(i)序列特征(A)長度534個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:2MetSerPheArgSerLeuLeuAlaLeuSerGlylieuValCysThrGly-24-20_15-10LeuAlaAsnVallieSerLysArgAlaThrLeuAspSerTrpLeuSer-515AsnGluAlaThrValAlaArgThrAlalieLeuAsnAsnlieGlyAla101520AspGlyAlaTrpValSerGlyAlaAspSerGlylieValValAlaSer25303540ProSerThrAspAsnProAsp"TyrPheTyrThrTrpThrArgAspSer4S5055GlyLeuValLeuLysThrL>euValAspLeuPheArgAsnGlyAspThr606570SerLeuLeuSerThrlieGluAsnTyrlieSerAlaGinAlalieVal758085GinGlylieSerAsnProSerGlyAspLeuSerSerGlyAlaGlyLeu9095100GlyGluProLysPheAsnValAspGluThrAlaTyrThrGlySerTrp105110115120GlyArgProGinArgAspGlyProAlaLeuArgAlaThrAlaMetlie12S130135GlyPheGlyGinTrpLeuLeuAspAsnGlyTyrThrSerThrAlaThr140145150AsplieValTrpProLeuValArgAsnAspLeuSerTyrValAlaGin155160165TyrTrpAsnGinThrGlyTyrAspLeuTrpGluGluValAsnGlySer170175180SerPhePheThrlieAlaValGinHisArgAlaLeuValGluGlySer185190195200AlaPheAlaThrAla"ValGlySerSerCysSerTrpCysAspSerGin205210215AlaProGlulieLeuCysTyrLeuGinSerPheTrpThrGlySerPhe220225230lieLeuAlaAsnPheAspSerSerArgSerGlyLysAspAlaAsnThr235240245LeuLeuGlySerlieHisThrPheAspProGluAlaAlaCysAspAsp250255260SerThrPheGinProCysSerProArgAlaLeuAlaAsnHisLysGlu265270275280ValValAspSerPheArgSerlieTyrThrLeuAsnAspGlyLeuSer285290295AspSerGluAlaValAlaValGlyArgTyrProGluAspThrTyrTyr300305310AsnGlyAsnProTrpPheI*euCysThrLeuAlaAlaAlaGluGinLeu315320325TyrAspAlaLeuTyrGinTrpAsp330335AspValSerLeuAspPhePheLys34S350LysGinGlySerlieuGluValThr340AlaLeuTyrSerAspAlaAlaThr355360GlyThrTyrSerSerSerSerSerThrTyrSerSerlieValAspAla36S370375ValLysThrPheAlaAspGlyPheValSerlieValGluThrHisAla380385390AlaSerAsnGlySerMetSerGluGinTyrAspLysSerAspGlyGlu395400405GinLeuSerAlaArgAspLeuThrTrpSerTyrAlaAlaLeulieuThr410415"0AlaAsnAsnArgArgAsnSerValValProAlaSerGlyGluThr42S430435440SerAlaSerSerValProGlyThrCysAlaAlaThrSerAlalieGly445450455ThrTyrSerSerValThrValThrSerTrpProSerlieValAlaThr46046S470GlyGlyThrThrThrThrAlaThrProThrGlySerGlySerValThr475480485SerThrSerLysThrThrAlaThrAlaSerLysThrSerThrThrThr490495500ArgSerGlyMetSerLeu505510(2)SEQIDNO:3的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關4t詞misc-特4正(B)其它資料/desc="引物7258"(xi)序列描述SEQIDNO:3gaatgacttggttgacgcgtcaccagtcac20(2)SEQIDNO:4的資料(i)序列特征(A)長度68個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc="引物21401"(xi)序列描述SEQIDNO:4g的gatcatgataggactagccatattaatgaagggcatataccacgccttggacctgcgttatagcc(2)SEQIDNO:5的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關4建詞misc-特;f正(B)其它資料/desc="引物107581，，(xi)序列描述SEQIDNO:5gcaacgaagcgcccgtggctcgtac(2)SEQIDNO:6的資料(i)序列特征(A)長度109個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型其它核酸(k)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc="引物FAMGII"(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置30,33,42,44,47,4B,51,53,56,57,58,62,63,66,69,71,72,73,74,75(D)其它資料/Note-l.-A10,C902:A6,T943:A9S,C54:G95,CS5:G91,A3,T3,C37:G3,A95,C28:G92,A4,T49:A3,T9710..G95,T511:G3,AS712:G95,A2,C313:T5,C3514:G88,A8,C415:G7,A9316:G4,C9617:G4,A9618:G95,A2,C3(xi)序列描述SEQIDNO:6CGAAGCGACCGTGGCTCGTACTGCCATC12TA3TAACATCG4G5CG67CG4TBCT91010GTG1112CG4CG13G1415161718TGGCATTGTCGTTGCTAGTCCCAGCACGGATAAC109(2)SEQIDNO:7的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關4盡詞misc-特;f正(B)其它資料/desc="引物RAMG1"(xi)序列描述SEQIDNO:7GATGGCAGTACGAGCCACGGTCGCTTCG28(2)SEQIDNO:8的資料(i)序列特征(A)長度IIO個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型.'單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc="引物FAMGIV(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征位置22,23,24,25,26,28,31,32,34,35,37,40,41,43,44,46,47,49,55,56,59,60,61,62,67,68,70,"71,74,77,79,80,85,86,B7(D)其它資料/Note=1:G91,A3,T3,C32:A13,C8"73:A40,T604:G3,A3,C94右G4,A4,T927:G2,A96,C28:G93,A3.5,C3.59:G87,A8,C510:A84,C1S11:G93,T712:G92,A5,T313:A3,C9715:G2,A2,T4,CS216:G93,A717:G93,C718:A90,T1020sGS5,A521:G96,A423:G2,A1,T95,C224:A3,C9725:G95,A3,C22S:G2,A96,C227:A5,CS528:A95,T529:G2,A9830:G94,A4,C231:G94,A3,T1,C232A4,T9633:A20,C80(xi)序列描述SEQIDNO:8GTGTCGCTGGACTTCTTCAAG12345A6AC78C910T11CT1213T1415A1617C18CCTAC1320TA21222324CAGT1425C2627GT28TA16T2930CATT313233GATGCCGTGAAGACTTTCGCCGA110(2)SEQIDNO:9的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc="引物RAMGVI"(xi)序列描述SEQIDNO:9CTTGAAGAAGTCCAGCGACAC21(2)SEQIDNO:IO的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc-"引物FG2"(xi)序列描述SEQIDNO:10CATCCCCAGGATCCTTACTCAGCAATG27(2)SEQIDNO:11的資料(i)序列特征CA)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)其它資料/desc="引物RG2"(xi)序列描述SEQIDNO:11CTCAAACGACTCACCAGCCTCTAGAGT27<210>12<211>2602<212〉DNA<213〉黑曲霉<220><221〉信號肽<222>(270)…(323)<221>成熟肽<222>(342)...(2438)<221〉內含子<222〉(484)…(558)<221>內含子<222>(846)...(900)<221>內含子<222〉(998)…(1058)<221〉內含子<222〉(1697)...(1754)<400〉12ttcgtcgcctaatgtctcgtccgttcacaaactgaagagcttgaagtggcgagatgtctc60tgcaggaattcaagctagatgctaagcgatattgcatggcaatatgtgttgatgcatgtg120cttcttccttcagcttcccctcgtgcgagtgaggtttggctataaattgaagtggttggt180cggggttccgtgaggggctgaagtgcttcctcccttttaggcgcaactgagagcctgagc240ttcatccccagcatcattacacctcagcaatgtcgttccgatctctactcgccctgagcg300gcctcgtctgcacagggttggcaaatgtgatttccaagcgcgcgaccttggattcatggt360tgagcaacgaagcgaccgtggctcgtactgccatcctgaataacatcggggcggacggtg420cttgggtgtcgggcgcggactctggcattgtcgttgctagtcccagcacg9ataaccc9g480actgtatgtttcgagctcagatttagtatgagtgtgtcattgattgattgatgctgactg540gcgtgtcgtttgttgtagacttctacacctggactcgcgactctggtctcgtcctcaaga600ccctcgtcgatctcttccgaaatggagataccagtctcctctccaccattgagaactaca660tctccgcccaggcaattgtccagggtatcagtaacccctctggtgatctgtccagcggcg720ctggtctcggtgaacccaagttcaatgtcgatgagactgcctacactggttcttggggac780ggccgcagcgagatggtccggctctgagagcaactgctatgatcggcttcgggcagtggc840tgcttgtatgttctccacccccttgcgtctgatctgtgacatatgtagctgactggtcag900gacaatggctacaccagcaccgcaacggacattgtttggcccc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SEQIDNO:30<211〉長度44<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料51物HK1-N426X<400〉SEQIDNO:30atgctgctctgctgaccgccvnnaaccgtcgtaactccgtcgtg44<210〉SEQIDNO:31<211〉長度44<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK1-N427X<400〉SEQIDNO:31CTGCTCTGCTGACCGCCAACVMNCGTCGTAACTCCGTCGTGCCT44<210>SEQIDNO:32<211>長度46<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK1-Y402X<400>SEQIDNO:32ACGGCTCCATGTCCGAGCAA咖CGACAAGTCTGATGGCGAGCAGCT46<210>SEQIDNO:33<211〉長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列.<220>特征:<223〉其它資料引物HK2-L234X-有義<400〉SEQIDNO:33ctggaccggcagcttcattnnkgccaacttcgatagcagcc41<210〉SEQIDNO:34<211〉長度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK2-A235X-反義<■〉SEQIDNO:34gaacggctgctatcgaagttagacagaatgaagctgccggtc42<210>SEQIDNO:35<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-NF237X-有義<400>SEQIDNO:35cagcttcattctggccaacnatgatagcagccgttccggca41<210>SEQIDNO:36<211>長度42<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223〉其它資料引物HK2-D238T-反義<400>SEQIDNO:36ccttgccggaacggctgctagtgaagttggccagaatgaagc42<210>SEQIDNO:37<211>長度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK2-D238S-反義<400>SEQIDNO:37ccttgccggaacggctgctagagaagttggccagaatgaagc42〈210〉SEQIDNO:38<211〉長度42<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK2-S239X-有義<400〉SEQIDNO:38tcattctggccaacttcgatnncagccgttccggcaaggaeg42<210>SEQIDNO:39<211〉長度42<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-S240G-反義<400>SEQIDNO:39ttgegtcettgeeggaaegaccgctatcgaagttggccagaa42〈210〉SEQIDNO:40<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-S242X-反義<400>SEQIDNO:404]gggtgtttgcgtccttgccaknacggctgctatcgaagttg<210〉SEQIDNO:41<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-G243X-反義<400>SEQIDNO:414ggagggtgtttgcgtccttaknggaacggctgctatcgaag<210>SEQIDNO:42<211〉長度41<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK2-K244R-有義<400〉SEQIDNO:42cgatagcagccgttccggcagagacgcaaacaccctcctgg41〈210〉SEQIDNO:43<211>長度41<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-T310V-反義<400〉SEQIDNO:43acgggttgccgttgtagtaaacgtcctcagggtaccgaccc<210〉SEQIDNO:44<211>長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<2之0>特征<223〉其它資料引物HK2-T310S-反義<400〉SEQIDNO:44acgggttgccgttgtagtaagagtcctcagggtaccgaccc<210〉SEQIDNO:45<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223〉其它資料引物HK2-Y311N-有義<400>SEQIDNO:45tcggtaccctgaggacacgaattacaacggcaacccgtggt<210>SEQIDNO:46<211〉長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Y312Q-反義<400>SEQIDNO:46ggaaccacgggttgccgttttggtacgtgtcctcagggtac<210>SEQIDNO:47<211〉長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-Y312N-反義<400>SEQIDNO:47ggaaccacgggttgccgttattgtacgtgtcctcagggtac<210>SEQIDNO:48<211>長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N313T-有義<400>SEQIDNO:48ccctgaggacacgtactacactggcaacccgtggttcctg<210>SEQIDNO:49<211〉長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK2-N313S-有義<400〉SEQIDNO:49ccctgaggacacgtactactctggcaacccgtggttcctgt41<210〉SEQIDNO:50<211〉長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK2-N313G-有義<400〉SEQIDNO:50ccctgaggacacgtactacggtggcaacccgtggttcctgt41<210〉SEQIDNO:51<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK2-N315Q-反義<400>SEQIDNO:51aggtgcacaggaaccacggttggccgttgtagtacgtgtcc41<210〉SEQIDNO:52<211>長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征:<223〉其它資料引物HK2-N315E-反義<400〉SEQIDNO:52aggtgcacaggaaccacggttcgccgttgtagtacgtgtcc4]<210〉SEQIDNO:53<211〉長度41<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK2-N315R-反義<400〉SEQIDNO:53aggtgcacaggaaccacggtctgccgttgtagtacgtgtcc41<210〉SEQIDNO:54<211>長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK2-F318Y-反義<400>SEQIDNO:54c的cagccaaggtgcacagataccacgggttgccgttgtag"〈210〉SEQIDNO:55<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK2-Q409P-有義<400〉SEQIDNO:55cgacaagtctgatggcgagccactttccgctcgcgacctga〈210〉SEQIDNO:56<211>長度41<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223〉其它資料引物HK3-D336X-有義<400〉SEQIDNO:56cgatgctctataccagtggnnkaagcaggggtcgttggagg41<210〉SEQIDNO:57<211〉長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-K336X-有義<400>SEQIDNO:57tgctctataccagtgggacnnkcaggggtcgttggaggtca4:<210>SEQIDNO:58<211〉長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK3-Q338X-反義<400〉SEQIDNO:58ctgtgacctccaacgacccgniicttgtcccactggtataga41<210>SEQIDNO:59<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-G339X-有義<400>SEQIDNO:59ataccagtgggacaagcagncutcgttggaggtcacagatg41〈210〉SEQIDNO:60<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S340X-反義<400>SEQIDNO:60acacatctgtgacctccaaantcccctgcttgtcccactgg41<210>SEQIDNO:61<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S340C-反義<400>SEQIDNO:61acacatctgtgacctccaaanccccctgcttgtcccactgg"<210〉SEQIDNO:62<211>長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-L341X-有義<400>SEQIDNO:62gtgggacaagcaggggtcgnuugaggtcacagatgtgtcgc41<210>SEQIDNO:63<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-K352Q-有義<400>SEQIDNO:63tgtgtcgctggacttcttccaagcactgtacagcgatgctg41<210〉SEQIDNO:64<211〉長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料S1物HK3-K352R-有義<400>SEQIDNO:64tgtgtcgctggacttcttcagagcactgtacagcgatgctg41<210>SEQIDNO:65<211〉長度41<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK3-A352D-反義<400>SEQIDNO:65tagcagcatcgctgtacagatccttgaagaagtccagcgac<210>SE(^IDNO:66<211>長度41<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223〉其它資料引物HK3-A353S-反義<400〉SEQIDNO:66tagcagcatcgctgtacagagacttgaagaagtccagcgac<210>SEQIDNO:67<211〉長度41<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S356P-有義<400>SEQIDNO:67acttcttcaaggcactgtacccagatgctgctactggcacc<210>SEQIDNO:68<211〉長度43<212〉類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-S356N-有義<400〉SEQIDNO:68acttcttcaaggcactgtacaaugatgctgctactggcaccta43〈210〉SEQIDNO:69<211〉長度43<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220>特征<223〉其它資料引物HK3-S356X-有義-<400〉SEQIDNO:69acttcttcaaggcactgtacgaugatgctgctactggcaccta43<210>SEQIDNO:70<211〉長度43<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220〉凈爭征<223>其它資料引物HK3-D357S-反義<400>SEQIDNO:70gagtaggtgccagtagcagcagagctgtacagtgccttgaaga43<210〉SEQIDNO:71<211>長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-A359S-有義<400〉SEQIDNO:71ggcactgtacagcgatgcttctactggcacctactcttcgt41<210〉SEQIDNO:72<211〉長度41<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-T360V-反義<400>SEQIDNO:72tggacgaagagtaggtgccaacagcagcatcgctgtacagt41<210>SEQIDNO:73<211>長度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-G361X-有義<400>SEQIDNO:73tgtacagcgatgctgctactnctacctactcttcgtccagttc43<210>SEQIDNO:74<211>長度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-T362R-反義<400〉SEQIDNO:74gtcgaact的acgaagagtatctgccagtagcagcatcgctg<210>SEQIDNO:75<211>長度42<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S364X-有義<400>SEQIDNO:75tgctgctactggcacctacnnJctcgtccagttcgacttatag<210〉SEQIDNO:76<211>長度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S365X-有義<400>SEQIDNO:76tgctactggcacctactctnnktccagttcgacttatagtag<210>SEQIDNO:77<211>長度42<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-S366T-反義<400>SEqIDNO:77atgctactataagtcgaactagtcgaagagtaggtgccagta42<210>SEQIDNO:78<211>長度42<212〉類型DNA<213>生物體人工序列<220>特征<223>其它資料引物HK3-S368X-反義<400>SEQIDNO:78tctacaatgctactataagtagnactggacgaagagtaggtg42<210>SEQIDNO:79<211〉長度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-T369X-有義<400>SEQIDNO:79ctactcttcgtccagttcgnnktatagtagcattgtagatgcc43<210>SEQIDNO:80<211>長度43<212>類型DNA<213>生物體人工序列<220〉特征<223>其它資料引物HK3-S371X-反義<400〉SEQIDNO:80ttcacggcatctacaatgctatnataagtcgaactggacgaag43<210〉SEQIDNO:81<211〉長度43<212>類型DNA<213〉生物體人工序列<220〉特征<223〉其它資料引物HK3-S372X-有義<400〉SEQIDNO:81cgtccagttcgacttatagtnntattgtagatgccgtgaagac4權利要求1.親代葡糖淀粉酶的變體，其在SEQIDNO2所示氨基酸序列的下列位置或區域和/或在與SEQIDNO2所示氨基酸序列顯示至少60％同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位置或區域中包含一個或多個突變區域1-18，區域19-35，區域40-62，區域73-80，區域93-127，區域170-184，區域200-212，區域234-246，區域287-319，區域334-341，區域353-374，區域388-414，區域445-470，但不包含下列取代N20C，A27C，S30P，Y48W，Y50F，W52F，R54K/L，D55G/V，G57A，K108R，D112Y，Y116A/W，S119C/W/E/G/Y/P，W120H/L/F/Y，G121T/A，R122Y，P123G，Q124H，R125K，W170F，N171S，Q172N，T173G，G174C，Y175F，D176N/E，L177H/D，W178R/D，E179Q/D，E180D/Q，V181D/A/T，N182A/D/Q/Y/S，G183K，S184H，W212F，R241K，A246C，D293E/Q，A302V，R305K，Y306F，D309N/E，Y312W，W317F，E389D/Q，H391W，A392D，A393P，N395Q，G396S，E400Q/C，Q401E，G407D，E408P，L410F，S411A/G/C/H/D，S460P。2.權利要求l的變體，其中所述變體含有一個或多個下列突變A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,工18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G2SA,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S5GA/C,V59T/A,L60A,N33T,P94V,S，，DS7S,固P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y11SF,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246TY312Q,N313T/S/G,A353D/S,S35SP/N/D,D3S7S,A359S,T3S0V,G3S1S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S3S6T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/WK/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/L/P/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,L410I/R,S411V,A412C，D414A,G447S,S465P。3.具有改良的熱穩定性的親代葡糖淀粉酶變體，其在SEQIDNO:2所示氨基酸序列的下列位置或區域和/或在與SEQIDNO:2所示氨基酸序列顯示至少60%同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位置或區域中包含一個或多個突變區域:1-18，區域19-35，區域73-80，區域93-127,區域170-184,區域:200-212，區域234-246，區域287-319，區域334-341,區域353-374，區域388-414,區域:445-470,但不包含下列取代N20C，A27C，S30P,A246C。4.具有提高的比活性的親代葡糖淀粉酶變體，其在SEQIDNO:2所示氨基酸序列的下列位置或區域和/或在與SEQIDNO:2所示氨基酸序列顯示至少60%同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位置或區域中包含一個或多個突變區域1-18，區i或40-62，區域93-127，區域170-184，區域200-212，區域234-246，區域287-319,區域388-414，但不包含下列取代S411G。5.根據權利要求4的變體，其在SEQIDNO:2所示氨基酸序列的下列區域和/或在與SEQIDNO:2所示氨基酸序列顯示至少60%同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位置或區域中包含一個或多個突變區域287-300,區域305-319。6.根據權利要求1至5中的任一項的變體，其中所述親代同源性葡糖淀粉酶是黑曲霉G1葡糖淀粉酶。7.根據權利要求1至6中的任一項的變體，其中所述葡糖淀粉酶是截短的葡糖淀粉酶，尤其是在C末端截短的葡糖淀粉酶。8.DNA構建體，其含有編碼權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體的DNA序列。9.重組表達載體，其攜有根據權利要求8的DNA構建體。10.細胞，所述細胞用根據權利要求8的DNA構建體或根據權利要求9的載體轉化。11.根據權利要求10的細胞，其為微生物，如細菌或真菌。12.根據權利要求ll的細胞，其為蛋白酶缺陷的米曲霉或黑曲霉。13.將淀粉轉化為或部分水解成含葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體的存在下將淀粉水解物糖化的步驟。14.權利要求13的方法，其中葡糖淀粉酶的劑量范圍為0.05至0.5AGU/g干固體。15.權利要求13或14的方法，其包括將干固體重量的至少30%的淀粉水解物糖化。16.上述任一權利要求的方法，其中在脫支酶存在下進行糖化，所述脫支酶選自由支鏈淀粉酶和異淀粉酶組成的組，優選為得自6ac/〃MocWopM〃w(y"cws或iac/〃wsdera7"mycara的支MJ定斗分酉條或4尋自；定4分皮々I單月包菌的異淀粉酶。17.上述任一權利要求的方法，其中在pH3至5.5，60-80°C，優選為63-75。C的溫度下糖化24至72小時，優選在pH4至4.5糖化36至48小時。18.糖化液化淀粉溶液的方法，所述方法包括(i)糖化步驟，在該步驟中，發生了一個或多個酶促糖化過程，隨后的步驟是(ii)一個或多個高溫膜分離步驟，其中使用根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體進行酶促糖化。19.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在淀粉轉化過程中的用途。20.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在連續的淀粉轉化過程中的用途。21.根據權利要求20的用途，其中連續的淀粉轉化過程包括根據權利要求18的連續糖化方法。22.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在生產寡糖的方法中的用途。23.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在生產特制漿液的方法中的用途。24.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在生產燃料用乙醇的方法中的用途。25.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在生產飲料的方法中的用途。26.根據權利要求1至7中的任一項的葡糖淀粉酶變體在用于生產有機化合物，如檸檬酸，抗壞血酸，賴氨酸，谷氨酸的發酵方法中的用途。27.改良親代葡糖淀粉酶的熱穩定性和/或增加其比活性的方法，所述方法通過在SEQIDNO:2所示氨基酸序列的一個或多個下列位置或區域和/或在與SEQIDNO:2所示氨基酸序列顯示至少60°/。同源性的同源葡糖淀粉酶的相應位置或區域中進行突變區域1-18，區域19-35，區域40-62，區域73-80,區域93-127,區域170-184,區域200-212,區域234-246，區域287-319,區域334-341,區域353-374，區域388-414，區域445-470。28.根據權利要求27的方法。其具有一個或多個下列取代A1V,T2E/P/Q/R/H/M,L3P/N,N9A,A11P/E,I18V,L19N,N20T,G23A,A24S/T,D25S/T/R,G26A,A27S/T,W28R/Y,S30T/N,G31A,A32V,D33R/K/H,S34N,S40C,T43R,T51D/S,T53D,S56A/C,V59T/A,L60A,N93T,P94V,S95N,D97S,L98P/S,S100T/D,A102S/*,N110T,V111P,D112N,E113M/A,T114S,A115Q/G,Y116F,S119A,G127A,N182E,A201D,F202L,A203L,T204K,A205R/S,V206L/N,G207N,S208H/T/D,S209T,S211P,W212N/A/T,A246TY312Q,N313T/S/G,A353D/S,S356P/N/D,D357S,A359S,T360V,G361S/P/T/A,T362R,S364A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S365A/R/N/D/C/Q/E/G/H/I/Ii/K/M/F/P/T/W/Y/V,S366T,S368P/T/A,T369A/R/N/D/C/Q/E/G/H/工/L/K/M/F/P/T/W/Y/V,S371Y/H/N/D,S372F/Y/C/IVP/H/R/I/T/N/S/V/A/D/G,T390R,A393R,S394R/P,M398!L,S399C/Q/T,Y402F,D403S,S405T,D406N,E408C/R,Li410l/R,S411V,A412C,D414A,G447S,S465P。全文摘要本發明涉及一種親代真菌葡糖淀粉酶的變體，其顯示改進的熱穩定性和/或使用糖類底物的增加的比活性。文檔編號C12N15/56GK101275125SQ200810098549公開日2008年10月1日申請日期1999年7月9日優先權日1998年7月15日發明者亨里克·佩德森,托本·P·弗蘭德森,杰斯珀·文德,比賈恩·R·尼爾森,漢尼·V·亨德里克森,阿倫·斯文德森申請人:諾維信公司