專利名稱：：一種抗病、高產棉花的育種方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種利用抗病芽孢桿菌作為內生菌，獲得抗病、高產棉花的育種方法。獲得的抗病、高產棉花及后代的根、莖、葉和種子中內生有抗病芽孢桿菌，能直接應用于棉花生產，解決棉花抗病問題。技術背景在自然界中，植物與各種各樣的微生物共處于一個生態環境。植物不僅與病原菌存在緊密的相互作用，同時和它周圍的其他非致病菌也存在著一定的聯系。長期以來，為了防治植物病害，人們大量使用化學農藥，造成病原物的抗藥性不斷增強。隨著人們環保意識的不斷增強，植物病害生物防治，特別是生物農藥的研究和應用受到各國政府和民眾的高度重視。生物防治具有無污染、無公害、長效性等優點，逐漸成為植物病害綜合治理中的重要組成部分?？莶菅挎邨U菌是一種自然界廣泛存在、對人畜無毒無害、不污染環境、對植物病害有抑制作用的非致病細菌，同時還是植物體內常見的內生細菌?？莶菅挎邨U菌突出的特點是，能產生耐熱抗逆的芽孢，有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖。它還可以產生豐富的抗菌物質，是植物病害生物防治微生物的重要組成部分。枯草芽孢桿菌防病機制主要包括其分泌的抗菌物質具有抗生作用，和致病菌在空間和營養上的競爭，對寄主植物抗性的誘導作用和促生作用等。利用枯草芽孢桿菌防治植物病害是目前植物病害生物防治研究的熱點。美國已有四株枯草芽孢桿菌經環保局(EPA)批準進入商品化或有限商品化應用，如GB03，MBI600，QST713禾tlFZB24;日本的RB14和NB22;澳大利亞的A-13和我國自主開發的B-916，B-3，B-908等。我國也在利用枯草芽孢桿菌防治棉花黃萎病菌方面進行了探索。李社增等研究了防治棉花黃萎病的生防細菌NCD-2，經過鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌(萬flciZtos"to'fc)(李社增等，2005)。曹君等研究了枯草芽孢桿菌和哈茨木霉協同作用對棉花黃萎病菌防治(曹君等，2005)。Tehrani等從土壤中分離到5株抗棉花黃萎病菌的高效菌株2020、3、204、202、309，.經鑒定2020、3為假單胞桿菌，204、202、309為芽孢桿菌；制成菌劑應用于大田試驗，證明這5株菌株不僅對棉花黃萎病菌有拮抗作用，而且能不同程度地提高棉花的產量(Tehrani等，2001)。利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究主要是利用其活體菌來防治植物病害，作為活體菌，其本身也存在許多限制因子，例如生態適應性、環境的抗逆性等。在一生態系統中引入生防菌，它能否適應其被引入的生態環境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及與相應病原物競爭是能否成功防治病害的關鍵。這些都與生防菌的生物學特性緊密相關。理想的生防菌應具有營養競爭能力強，抗菌物質產量高，生長速度快及適應性強等特點，競爭和定殖是細菌在植物促生和防病作用過程中的推動力，也是成功的關鍵。因此，具有強活力的枯草芽孢桿菌能否在植株上定殖是其能否發揮生防活性的關鍵因素。迄今為止，己報道的枯草芽孢桿菌類生物農藥產品基本都是芽孢制劑，還沒有見到將枯草芽孢桿菌抗菌代謝產物直接加工成生物農藥產品的報道或利用枯草芽孢桿菌內生性使植株后代攜帶菌體，從而獲得具有抗病能力的種質資源。雖然科研人員針對棉花黃萎病生物防治做了大量的研究工作，但生物防治效果不夠穩定，仍沒有一種成功應用于大批量生產和推廣的拮抗微生物。目前已有防治其他作物黃萎病的生防制劑商品，但登記注冊的防治棉花黃萎病的生防菌還未見報道。本發明采用的抗病枯草芽孢桿菌能夠分泌抗多種植物致病真菌和細菌的抗菌物質。同時枯草芽孢桿菌的作為常見內生菌，在植物中具有較強的定殖能力的特性。利用具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌Blll，采用拌種、灌根和注射的方法使其定殖的棉花中，提高棉花的抗病能力，最終獲得能直接應用于生產的抗病、高產的棉花品種及后代，解決棉花抗病問題
發明內容本發明提供一種利用抗病芽孢桿菌作為內生菌，培育抗病、高產棉花的育種方法，其特征在于(1)處理方法A——拌種用芽孢懸液浸泡棉花種子。(2)處理方法B"^灌根棉株發芽后用芽孢懸液灌根。(3)處理方法C——注射用芽孢懸液注射棉株莖基或果實幼體。(4)處理方法D——拌種結合灌根用芽孢懸液浸泡棉花的種子，棉株發芽后用芽孢懸液灌根。(5)處理方法E——拌種，灌根結合注射用芽孢懸液浸泡棉花的種子，棉株發芽后用芽孢懸液灌根，芽孢懸液注射棉株莖基或果實幼體。本發明中所述的抗病芽孢桿菌中，其中的一種是指抗棉花枯萎病、黃萎病菌的枯草芽孢桿菌Blll(分類命名5fl"7/MWto7&，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏編號CGMMCCNo.l497;保藏日期2005年10月18日)。本發明還提供一種棉花根、莖、葉和種子中內生有枯草芽孢桿菌的鑒定方法，其特征在于棉花的根、莖、葉和種子中分離出的單菌落，需同時滿足以下兩個條件，具體步驟如下(1)菌落形態檢測菌株細胞桿狀，產生芽孢，中生，營養瓊脂培養基上菌落無光澤、粗糙、邊緣不整齊、凸起，菌落呈褶皺狀。革蘭氏染色、過氧化氫酶反應和V-P反應呈陽性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不產氣，利用半乳糖不產酸，能水解明膠、酪素。(2)16SrDNA序列測定從棉花的根、莖、葉和種子中，分離出的菌落形態符合(1)中菌落形態特征的單菌落，菌落培養液經引物27f:5'-gagagtttgatcatggctcag-3'和1541R:5'"Cgggatccaaggaggtgatccagcc-3'，PCR擴增獲得的1479bp核酸片段序列，與序列表中SEQIDNO:l有97%以上的同源性。本發明另外還提供一種棉花的根、莖、葉和種子中內生有枯草芽孢桿菌Blll的鑒定方法，其特征在于棉株的根、莖、葉和種子中分離出的單菌落，除滿足以上鑒定棉株中內生有枯草芽孢桿菌的兩個條件以外，同時滿足以下條件(1)利用枯草芽孢桿菌B111的抗菌蛋白基因6"核酸片段序列進行鑒定從棉花的根、莖、葉和種子中，分離出的單菌落培養液，利用引物Fl:5'陽acggtctcattaaataattcttctgaa-3，，Rl:5'隱aegatagtaaatctgctccgcttt-3',以菌體基因纟且DNA為模板進行PCR擴增，獲得729bp核酸片段序列完全符合序列表中SEQIDNO:2。采用本發明所述的利用抗病芽孢桿菌作為內生菌，經不同處理方式的組合技術，選育出的抗病、高產棉花及后代，經菌落形態、16SrDNA和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鑒定，其根、莖、葉和種子中內生有抗病芽孢桿菌，直接應用于生產后，黃萎病病情指數5-30，產量增幅15%-40%。本發明提供的抗病、高產棉花的育種技術和棉花根、莖、葉和種子中內生抗病芽孢桿菌的鑒定方法，還可以應用于其它單子葉植物和雙子葉植物，以獲得抗病、高產植物。附圖表說明圖l:從處理后棉花中分離的內生菌菌落與枯草芽孢桿菌Blll的形態比較，(A)為從處理后棉花中分離的內生菌，(B)為枯草芽孢桿菌Blll。圖2:從棉花中分離的內生菌菌落的16SrDNAPCR結果，泳道1-4。圖3:利用抗菌蛋白基因fc2鑒定棉花中分離的內生菌菌落的PCR結果，泳道l。具體實施方式給出以下實施例的目的是舉例詳細描述本發明，而不構成對本發明待批權利范圍的限制。在本發明技術特征和待批權利要求范圍內，本領域技術人員可以對本發明作出某些等同的改動和顯而易見的改進。實施例1枯草芽孢桿菌Blll芽孢懸液和棉花黃萎病菌孢子懸液的配制1.枯草芽孢桿菌B111芽孢懸液的配制將枯草芽孢桿菌B111接種到滅菌的LB培養基(酵母粉5g/1，胰蛋白胨10g/1，NaC110g/1，pH7.0)中，37°C，250rmp，培養7d后，將菌株Blll發酵液置于離心瓶中，4"C、12000rpm離心20分鐘，保留菌體，用無菌水洗三次，配制成lxl08cfWmL的芽孢懸液備用。2.落葉型棉花黃萎病菌V991的培養取適量斜面上的V991置于200uL的無菌水中，制成孢子懸液均勻涂在Czapek，s平板培養基上，在28。C培養5天。再將10mL無菌水加到平板上，混勻后將該高濃度孢子懸液加到100mL無菌水中，制成OD59產0.795的孢子懸液。存于4"C備用。實施例2抗病棉花的選育技術在棉花中的應用枯草芽孢桿菌B111芽孢懸液，對棉花進行拌種、灌根和注射三種方式分別處理，提高棉花抗病性。種植黃萎病敏感棉花品種L14，共4種情況(播種到40cmx31cm的塑料花盆中，每個花盆播種100粒，每盆定苗15株，重復六次)。a)用lX108cfWmLBlll芽孢懸液拌種至露白后播種；b)清水浸泡至露白后播種為對照；c)棉種發芽后用lX108cfu/mLBlll芽孢懸液灌根，每株20mL;d)棉花長至四葉期用lX108cfii/mLBill芽孢懸液注射棉花莖基，每株100uL，注射七天后用黃萎病菌灌根法(孢子濃度為lX108cfo/mL的V991孢子懸液)，檢測棉花植株病情指數。調查記錄黃萎病發生情況按5級分類標準(0級，無病植株；l級，25%葉片發病的植株；2級，25%-50%葉片發病的植株；3級，50%-75%葉片發病的植株；4級，75%以上葉片發病的植株；記載和計算病情指數，并計算供試細菌對棉花黃萎病的相對防病效果。病情指數-E(級數*株數)/(4*總株數)防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數X100。/0試驗結果顯示，不同方式分別處理后，棉株對落葉型黃萎病菌V991的抗性較對照都有一定程度的提高(表l)。其中拌種處理的防治效果最好，注射處理效果最差，可能是注射造成棉株莖部劃傷，形成傷口，利于黃萎病菌的入侵，造成防治效果的降低。表1枯草芽孢桿菌Blll防治落葉型棉花黃萎病菌V991的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>同列數據后標注的小寫字母相同表示在P=0.05無顯著差異，小寫字母不同表示在P=0.05差異顯著。實施例3棉花根、莖、葉和種子中內生有枯草芽孢桿菌B111的鑒定將處理后所獲得棉株的根，莖，葉、種子各lg，用0.P/。氯化汞消毒3-5min后，無菌水洗凈三次。在超凈臺中用無菌玻璃棒磨碎勻漿后用lmL無菌蒸餾水常溫下浸泡24h。將浸泡液接種到LB培養基中，37。C培養16h。取10(^1培養液涂于LB平板上，調查各棉花各部位的菌落生長及內生情況。分離出的單菌落，同時滿足以下3個條件的即鑒定為該棉花中內生有枯草芽孢桿菌B111，具體步驟如下(1)菌落形態檢測菌株細胞桿狀，產生芽孢，中生，營養瓊脂培養基上菌落無光澤、粗糙、邊緣不整齊、凸起，菌落呈褶皺狀。革蘭氏染色、過氧化氫酶反應和V-P反應呈陽性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不產氣，利用半乳糖不產酸，能水解明膠、酪素。(2)16SrDNA序列測定從棉花的根、莖、葉和種子中，分離出的菌落形態符合(1)中菌落形態特征的單菌落，菌落培養液經Bill菌株16SrDNA引物27f:5'-gagagtttgatcatggctcag-3鄰1541R:5'-cgggatccaaggaggtgatccagcc國3'，PCR擴增，獲得1479bp的核酸片段(圖2)，其序列完全符合序列表中SEQIDNO:l。(3)利用菌株Blll中抗菌蛋白基因fe2片段序列進行鑒定從棉花的根、莖、葉和種子中，分離出的菌落形態符合(1)中菌落形態特征的單菌落的培養液，利用引物F1:5'—acggtctcattaaataattcttctgaa—3，，Rl:5，-acgatagtaaatctgctccgcttt-3,，以菌體基因纟且DNA為模板進行PCR，獲得72%p的核苷酸(圖3)，其序列完全符合序列表中SEQIDN0:2。根據以上鑒定方法，挑取符合枯草芽孢桿菌Blll菌落形態的菌落(圖1)，采用抗菌蛋白基因fe2特異性引物和枯草芽孢桿菌Bill16SrDNA鑒定引物，分別進行菌落PCR。PCR結果顯示，擴增到了1.5kb和700bp左右的兩個片段(圖2，圖3)。測序結果顯示，這兩個片段分別與枯草芽孢桿菌Blll的16SrDNA和抗菌蛋白基因fe2特征片段具有完全100%的同源性。采用以上方法，鑒定不同方式處理后存活的棉花發現，拌種、灌根和注射這三種處理后的棉花根、莖、葉中，都能分離出大量類似枯草芽孢桿菌Blll形態的菌落(圖1)，且表現為優勢種群。其中采用注射方式處理棉株后，獲得的棉種中枯草芽孢桿菌Blll的攜帶比例最高(表2)。這可能是注射法能使枯草芽孢桿菌直接進入棉花維管束，有利于菌株在棉種中的定殖。每種處理方式隨機選取30粒棉種，播種于營養缽中，待長到兩片真葉時再次檢測棉株根、莖、葉中枯草芽孢桿菌Blll的內生情況。結果顯示，拌種、灌根和注射處理后收獲的棉種，播種發芽后，在棉株的根、莖、葉中仍有枯草芽孢桿菌Blll的內生，比例分別為80%，66.7%和86.7%。說明枯草芽孢桿菌Blll的內生性能夠在下一代棉株中保持，并能通過土壤傳播再次提高棉株內生菌株Blll的比例。表2枯草芽孢桿菌B111在棉花中的內生性檢測對照拌種灌根注射葉片-++十葉柄-+++莖-+++根-+++種子-53.3%+33.3%+66.7%+實施例4拌種、灌根和注射三種方式組合處理后，抗病、高產棉花的獲得枯草芽孢桿菌B111芽孢懸液，對棉花進行拌種、灌根和注射三種方式組合處理，提高棉花抗病性。種植生產應用型棉花品種GR29，4個病池(每個病池己混有棉花枯萎病菌Ag22、Ag26和Ag78;棉花黃萎病菌V991和V43-l，有效面積11.2m2)，處理方式如下(1)用lX108cfo/mLBill芽孢懸液拌種至露白后播種；棉種發芽后用lX108cfii/mLBill芽孢懸液灌根，每株20mL;棉花長至四葉期用1X108cfWmLB111芽孢懸液注射棉花莖基，每株lOOul。(2)用1Xl()Scfi!/mLBill芽孢懸液拌種至露白后播種；棉花發芽后用lX108cfli/mLBill芽孢懸液灌根，每株20mL。(3)用lX108cfWmLBlll芽孢懸液拌種至露白后播種。(4)清水浸泡至露白后播種作為對照。7田間試驗結果(表3)顯示，枯草芽孢桿菌Blll芽孢懸液不同方式組合處理的棉種和棉株,較對照表現出更高的出苗率、更強的生長勢和更好的整齊度。棉花的生育進程較對照加快，現蕾期和開花期比對照提前3-5天，說明菌株B111對棉花的生長具有促進作用。其中拌種和灌根結合的處理方式效果最好，開花期較對照提前5天，對棉花的促生作用明顯。表3棉花GR29生育進程記載表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注釋生長勢、整齊度用+表示生長勢強+++，生長勢一般++，生長勢弱+;整齊度好+++，整齊度一般++，整齊度較差+截止7月底棉花枯、黃萎病高發期結束后，統計田間棉株發病情況，結果顯示(表4)三種組合方式處理棉花后，棉株對枯、黃萎病的抗性明顯增強，其中拌種和灌根組合處理方式防病效果最好，病情指數達11.8，防治效果為66.1%。表4枯草芽孢桿菌Blll田間對棉花枯、黃萎病的防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同列數據后標注的小寫字母相同表示在P=0.05無顯著差異，小寫字母不同表示在P-0.05差異顯著。田間試驗結果(表5、6)顯示，枯草芽孢桿菌Blll芽孢懸液不同組合方式處理的棉株，較對照產量明顯提高。其中拌種結合灌根的處理方式獲得的子棉產量和單株結鈴個數最高，空果枝數最少，子棉產量增幅達36.3%。結合田間病池防治結果和棉花生育進程記錄，發現拌種結合灌根的處理方式不但促進棉花生長，防病效果好，且產量高，可作為應用枯草芽孢桿菌Blll田間生物防治棉花枯、黃萎病害的有效候選方法。表5不同處理對;瞎花品種GR29農藝'性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注釋A:拌種+灌根+注射；B:拌種+灌根；C:拌種；D:對照。同列數據后標注的小寫字母相同表示在P=0.05無顯著差異，小寫字母不同表示在P=0.05差異顯著。表6不同處理對棉花品;沖GR29產量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注釋A:拌種+灌根+注射；B:拌種+灌根；C:拌種；D:對照。同列數據后標注的小寫字母相同表示在P=0.05無顯著差異，小寫字母不同表示在P=0.05差異顯著。SEQUENCELISTING<110>中國農業科學院生物技術研究所郭三堆<120>—種抗病棉花的育種方法及其應用<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1479<212>DNA<213>BacillussubtilisBill<220><221>16SrDNA<222>(1)..(1479)<400>1tgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaa60cacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccgga120tggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatg180gacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagc240cgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggag300gcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtg360atgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatag420ggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcg480gtaatcacgtaaggtggccaaggcgtgtgtctcggaattatttgggcgttaaagggctcg540gcaggcggtttctttaagtctgatgttgaaagcccccggctcaaaccgggggagggttca600ttggaaactggggaacttgagtgcagaagg鄉agagtggaatttccacgtgtagcggtg660aaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactetctggtctgtaactga720cgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacccctggtagtccacgccg780taaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatt840aagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcc900cgcacaagcggtgggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc960ttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtg1020gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagttcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcattgccccttatgacctgggctacaca1200cgtgctacaatggacagaacaaagggcagtccgaaactcgcgaggttaagccaatcccac1260aaatctgttctcagttcggategcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgcta1320gtaatcgeggateagcatgecgcggtgaatacgttcccgggecttgtacacaccgcccgt1380cacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgc1440cgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaag1479<210>2<211>729<212>DNA<213>BacillussubtilisBill<220><221>6s2genefragment<222>(1)..(729)<400>1acggtctcattaaatatttcttctgaaaacggcaaatatgtaatgcgtgatctttcgaag60cctaccggaacacaaattattacgtacgatctgcaaaaccgacaatataacctgccgggc120acgctcgtatcaagcactacaaaccagttcacaacttcttctcagcgcgctgcggttgat180gcgcattacaatctcggcaaagtgtatgattatttctatcagacgtttaaacgcaacagc240tacgacaatagaggcggcaaaatcgtatcttccgtteattacggcagcagatacaataac300gcggcctggatcggcgaccaaatgatttacggtgacggtgacggctcattcttctcgcct360ctttccggttcaatggacgtaacggcccatgaaatgacacacggcgttacacaggaaaca420gccaacctgaactatgaaaatcagccgggcgctttaaacgaatccttctccgatgtattc480gggtacttcaccgatactgaggactgggatatcggtgaggatattacggtcagccagccg540gctctccgcagcttatccaatccgacaaaatacggacagcccgaccattacaaaaattat600caaaaccttccgaacactgatgccggcgactacggcggcgtgcatacaaacagcggaatt660ccgaacaaagccgcttacaacacgattacaaaaatcggcgtgaaaaaagcggagcagatt720tactatcgt729權利要求1、一種利用抗病芽孢桿菌作為內生菌，培育抗病、高產棉花的育種方法，其特征在于(1)處理方法A——拌種用芽孢懸液浸泡棉花種子。(2)處理方法B——灌根棉株發芽后用芽孢懸液灌根。(3)處理方法C——注射用芽孢懸液注射棉株莖基或果實幼體。(4)處理方法D——拌種結合灌根用芽孢懸液浸泡棉花的種子，棉株發芽后用芽孢懸液灌根。(5)處理方法E——拌種，灌根結合注射用芽孢懸液浸泡棉花的種子，棉株發芽后用芽孢懸液灌根，芽孢懸液注射棉株莖基或果實幼體。2、一種棉花根、莖、葉和種子中內生有枯草芽孢桿菌的鑒定方法，其特征在于棉花的根、莖、葉和種子中分離出的單菌落，需同時滿足以下兩個條件，具體步驟如下(1)菌落形態檢測菌株細胞桿狀，產生芽孢，中生，營養瓊脂培養基上菌落無光澤、粗糙、邊緣不整齊、凸起，菌落呈褶皺狀。革蘭氏染色、過氧化氫酶反應和V-P反應呈陽性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不產氣，利用半乳糖不產酸，能水解明膠、酪素。(2)16SrDNA序列測定從棉花的根、莖、葉和種子中，分離出的菌落形態符合權利要求2中(1)的菌落形態特征的單菌落，菌落培養液經引物27f:5'-gagagtttgatcatggctcag-3'和1541R:5'"Cgggatccaaggaggtgatccagcc-3'，PCR擴增獲得的1479bp核酸片段序列，與序列表中SEQIDNO:l有97%以上的同源性。3、權利要求1中所述的抗病芽孢桿菌，其中的一種是指枯草芽孢桿菌Blll，棉株中內生有該菌的鑒定方法，其特征在于棉株的根、莖、葉和種子中分離出的單菌落，除滿足權利要求2所述的兩個條件以外，同時滿足以下條件(1)利用枯草芽孢桿菌Blll的抗菌蛋白基因fc2核酸片段序列進行鑒定從棉花的根、莖、葉和種子中分離出的單菌落培養液，利用引物F1:5，一acggtctcattaaataattcttctgaa—3，，Rl:5，-acgatagtaaatctgctccgcttt-3，，以菌體基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得729bp核酸片段序列，完全符合序列表中SEQIDNO:2。4、權利要求l、2和3所述的方法適用于植物抗病、高產品種的選育。5、權利要求4中所述的植物是指單子葉植物和雙子葉植物。6、采用權利要求l中所述的不同處理方式的組合技術，選出的抗病、高產棉花品種及后代，黃萎病病情指數在5-30，產量增幅15%-40%。全文摘要本發明是利用抗病芽孢桿菌作為內生菌，采用拌種、灌根和注射不同處理方式的組合技術，獲得抗病、高產棉花及后代，經菌落形態、16SrDNA和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鑒定，其根、莖、葉和種子中內生有抗病芽孢桿菌，直接應用于棉花生產后，黃萎病病情指數5-30，產量增幅15％-40％。文檔編號C12R1/125GK101323842SQ200810097688公開日2008年12月17日申請日期2008年5月23日優先權日2008年5月23日發明者銳張,瑋白,郭三堆申請人:中國農業科學院生物技術研究所;郭三堆