專利名稱：一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法
技術領域：
本發明涉及一種叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法。
技術背景黃檗叢枝菌根真菌菌群可能由細凹無梗囊霉04. "ra6/c"/"to)、剌無梗囊 霉(丄w/"osa)、聚叢球囊霉(G. aggreg^wm)、懸鉤子狀球囊霉(G. n^/or附e)、 美麗盾巨孢囊霉(51. ca/os/ ora)、摩西球囊霉(G. mosseae)、幼套球囊霉 (G. Wwm.c^wm)、地表球囊霉(G. vera(/^附e)禾口透光球囊霉((？. d/ap/zam/m)等多種叢枝菌根真菌真菌組成，菌群結構復雜。現有的分析方法存在分析結果波 動大、準確性差的問題。 發明內容本發明的目的是為了解決目前黃檗叢枝菌根真菌菌群結構分析方法分析 結果波動大、準確性差的問題，而提供的一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分 析方法。黃檗叢枝菌根真菌菌群結構按以下步驟進行分析 一、黃檗叢枝菌根和黃 檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA提取；二、 Nested-PCR擴增真菌18S rDNA NS31/Glol區進行三次PCR擴增；三、用步驟二第三次PCR擴增產物進行 變性梯度凝膠電泳采用變性聚丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍30% 60%、 電泳電壓130V、電泳時間8h、電泳溫度為60。C;四、采用DNA測序技術， 即可分析出黃檗叢枝菌根真菌的菌群結構；其中步驟二中第一次PCR擴增的引物為GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR擴增體系為20pL由2pL 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、2pL濃度為1.0拜ol/L 的Geoll、 2jxL濃度為1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 總DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第一次PCR擴增反應條件94。C預變性 4min， 94。C變性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30個循環，最后72。C延伸7min;步驟二中第二次PCR擴增以稀釋100倍的第一次PCR擴增產物作為模板 DNA ， 第 二 次 PCR 擴增引物為 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和AMI: 5'畫GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3';第二 次PCR擴增體系為20pL由2pL含Mg2+10xPCR buffer、 1.6joL濃度為2.5mmol/L 的dNTP、 2jiL濃度為1.0nmol/L的Geoll、 2pL濃度為1.0^mol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2^L模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第二次PCR 擴增反應條件94。C預變性2min， 94。C變性45s、 65。C退火lmin、 72°0延伸 45s， 30個循環，最后72t:延伸7min;步驟二中第三次PCR擴增以稀釋100倍的第二次PCR擴增產物作為模板 DNA ， 第三次 PCR 擴增引物為 NS31-GC : 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC畫3'和Glol: 5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA畫3';第三次 PCR擴增體系為20pL由2|iL含Mg2+10xPCR buffer、 L6^L濃度為2.5mmol/L 的dNTP、 2pL濃度為1.0jimol/L的Geo11、 2pL濃度為1.0pmol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第三次PCR 擴增反應條件94。C預變性2min， 94。C變性45s、 55。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30個循環，最后72。C延伸7min;步驟三中的聚丙烯酰胺凝膠按質量百分比基本上由8%的丙烯酰胺制成。本發明方法針對叢枝菌根真菌遺傳保守區18SrDNANS31/Glol進行檢測 分析，經過三次PCR擴增黃檗叢枝菌根真菌DNA的拷貝數高，可以獲得大量 的目標產物叢枝菌根真菌18S rDNA NS31/Glol區片段(叢枝菌根真菌18S rDNANS31/Gk)1區域片段大小為0.23kb，加上本發明設計的40bp的GC夾序 列為0.27kb)便于步驟三進行變性梯度凝膠電泳(DGGE);因此本發明方法 具有準確性高，重復性好，穩定性高的優點。


圖1是具體實施方式
一步驟二Nested-PCR擴增產物的凝膠電泳圖，圖1 中"M"泳道標樣為Marker, "1"泳道標樣為黃檗叢枝菌根總DNA第一次PCR擴增產物，"2"泳道標樣為黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA第一次 PCR擴增產物，"3"泳道標樣為黃檗叢枝菌根總DNA第二次PCR擴增產物， "4"泳道標樣為黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA第二次PCR擴增產物， "5"泳道標樣為黃檗叢枝菌根總DNA第三次PCR擴增產物，"6"泳道標 樣為黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA第三次PCR擴增產物；圖2是具體實 施方式一步驟三變性梯度凝膠電泳圖，圖2中"1"泳道為黃檗叢枝菌根真菌 18S rDNA NS31/Glol區變性梯度凝膠電泳結果，圖2中"2"泳道為黃檗根 際土壤叢枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol區變性梯度凝膠電泳結果。
具體實施方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式黃檗叢枝菌根真菌菌群結構按以下步驟進行 分析 一、黃檗叢枝菌根和黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA提取；二、 Nested-PCR擴增真菌18S rDNA NS31/Glol區進行三次PCR擴增；三、用 步驟二第三次PCR擴增產物進行變性梯度凝膠電泳采用變性聚丙烯酰胺凝 膠，凝膠變性梯度范圍30% 60%、電泳電壓130V、電泳時間8h、電泳溫度 為6(TC;四、采用DNA測序技術，即可分析出黃檗叢枝菌根真菌的菌群結構；其中步驟二中第 一 次PCR擴增的引物為GeoA2 : 5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC畫3' 和 Geoll :5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3';第一次PCR擴增體系為20pL由2^L 含Mg2+10xPCR buffer、 1.6pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、2jjL濃度為1.0fimol/L 的Geoll、 2pL濃度為1.0pmol/L GeoA2、 1U的Taq DNA聚合酶、2pL菌群 總DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第一次PCR擴增反應條件94t:預變性 4min， 94。C變性lmin、 54。C退火lmin、 72。C延伸2min， 30個循環，最后72 ""C延伸7min;步驟二中第二次PCR擴增以稀釋100倍的第一次PCR擴增產物作為模板 DNA , 第 二 次 PCR擴增引物為 NS31-GC : 5'陽CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和AMI: 5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA國3';第二次PCR擴增體系為20^L由2pL含Mg2+10xPCRbuffer、 1.6^L濃度為2.5mmol/L 的dNTP、 2pL濃度為1.0pmol/L的Geo11、 2pL濃度為1.0|imol/L GeoA2、 1U 的T叫DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第二次PCR 擴增反應條件94。C預變性2min， 94。C變性45s、 65。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30個循環，最后72""C延伸7min;步驟二中第三次PCR擴增以稀釋100倍的第二次PCR擴增產物作為模板 DNA ， 第三次 PCR 擴增引物為 NS31-GC : 5'畫CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3'和Glol: 5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3';第三次 PCR擴增體系為20jiL由2pL含Mg2+10xPCRbuffer、 L6^iL濃度為2.5mmol/L 的dNTP、 2pL濃度為1.0pmol/L的Geoll、 2pL濃度為1.0pmol/L GeoA2、 1U 的Taq DNA聚合酶、2pL模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第三次PCR 擴增反應條件94"C預變性2min， 94。C變性45s、 55。C退火lmin、 72。C延伸 45s， 30個循環，最后72'C延伸7min;步驟三中的聚丙烯酰胺凝膠按質量百分比基本上由8%的丙烯酰胺制成。本實施方式步驟二第一次PCR擴增后凝膠電泳沒有明顯的條帶出現則不 必對第一次PCR擴增產物進行稀釋，第一次PCR擴增產物可直接作為第二次 PCR擴增的模板DNA。經反復實驗證明本實施方式方法具有準確性高，重復性好，穩定性高的優點。本實施方式聚丙烯酰胺凝膠主要由丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、催化劑和 水制成。本實施方式步驟二Nested-PCR擴增產物的凝膠電泳結果如圖1所示。凝 膠電泳結果說明本實施方式方法可以獲得大量的目標產物真菌18S rDNA NS31/Gk)1區片段。本實施方式變性梯度凝膠電泳結果如圖2所示。圖2中"1"泳道為黃檗 叢枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol區變性梯度凝膠電泳結果，G1 G5為黃檗 叢枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol區變性梯度凝膠電泳條帶；圖2中"2"泳 道為黃檗根際土壤叢枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol區變性梯度凝膠電泳結果；T1 T16為黃檗根際土壤叢枝菌根真菌18SrDNANS31/Glol區變性梯度凝 膠電泳條帶。說明本實施方式黃檗叢枝菌根中具有5種叢枝菌根真菌，黃檗根 際土壤中具有16種叢枝菌根真菌。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中按 以下步驟提取黃檗叢枝菌根總DNA: a、長度為1 1.5cm的黃檗叢枝菌根用雙 蒸餾水清洗3 5次后放入離心管中，再加入40pL的TE緩沖液，并用無菌槍 頭將菌根搗碎，然后加入IO^iL質量濃度為20%的化學整合樹脂Chelex-100溶 液，之后沸水浴5min、冰浴5min、 15000r/min離心5min，取上清液，即得到 黃檗叢枝菌根總DNA。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中按 修改后的Bead-Beating法提取黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA。其它步驟 及參數與實施方式一相同。〈110〉黑龍江大學〈120〉 一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法〈160〉 5〈210〉 1 〈211〉 22 〈212〉廳 <213〉人工序列〈220〉<223〉黃檗叢枝菌根真菌菌群PCR擴增用引物GeoA2。 <400〉 1ccagtagtca tatgcttgtc tc 22<210> 2 〈211> 23 <212〉 ■ 〈213〉人工序列<220〉〈223〉黃檗叢枝菌根真菌菌群PCR擴增用引物Geoll。 〈400〉 2accttgttac gacttttact tcc 23<210〉 3 〈211〉 60 〈212〉 ■ <213>人工序列<220><223>黃檗叢枝菌根真菌菌群PCR擴增用引物NS31-GC。 〈400〉 3cgcccggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggt tggagggcaa gtctggtgcc 60〈210〉 4 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉<223〉黃檗叢枝菌根真菌菌群PCR擴增用引物AM1。 〈400〉 4gtttcccgta aggcgccgaa 20〈210> 5 <211> 19 <212〉腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉黃檗叢枝菌根真菌菌群PCR擴增用引物Glol。 <400> 5gcctgcttta aacactcta 19
權利要求
1、一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法，其特征在于黃檗叢枝菌根真菌菌群結構按以下步驟進行分析一、黃檗叢枝菌根和黃檗根際土壤叢枝菌根真菌總DNA提取；二、Nested-PCR擴增真菌18SrDNA NS31/Glo1區進行三次PCR擴增；三、用步驟二第三次PCR擴增產物進行變性梯度凝膠電泳采用變性聚丙烯酰胺凝膠，凝膠變性梯度范圍30％～60％、電泳電壓130V、電泳時間8h、電泳溫度為60℃；四、采用DNA測序技術，即可分析出黃檗叢枝菌根真菌的菌群結構；其中步驟二中第一次PCR擴增的引物為GeoA25′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11；5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第一次PCR擴增體系為20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、2μL濃度為1.0μmol/L的Geo11、2μL濃度為1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL菌群總DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第一次PCR擴增反應條件94℃預變性4min，94℃變性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環，最后72℃延伸7min；步驟二中第二次PCR擴增以稀釋100倍的第一次PCR擴增產物作為模板DNA ，第二次PCR 擴增引物為NS31-GC5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和AM15′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′；第二次PCR擴增體系為20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、2μL濃度為1.0μmol/L的Geo11、2μL濃度為1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第二次PCR擴增反應條件94℃預變性2min，94℃變性45s、65℃退火1min、72℃延伸45s，30個循環，最后72℃延伸7min；步驟二中第三次PCR擴增以稀釋100倍的第二次PCR擴增產物作為模板DNA，第三次PCR擴增引物為NS31-GC5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和Glol5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′；第三次PCR擴增體系為20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL濃度為2.5mmol/L的dNTP、2μL濃度為1.0μmol/L的Geo11、2μL濃度為1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的無菌雙蒸餾水組成；第三次PCR擴增反應條件94℃預變性2min，94℃變性45s、55℃退火1min、72℃延伸45s，30個循環，最后72℃延伸7min；步驟三中的聚丙烯酰胺凝膠按質量百分比基本上由8％的丙烯酰胺制成。
2、 根據權利要求1所述的一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法， 其特征在于步驟一中按以下步驟提取黃檗叢枝菌根總DNA:a、長度為l~1.5cm 的黃檗叢枝菌根用雙蒸餾水清洗3~5次后放入離心管中，再加入40nL的TE 緩沖液，并用無菌槍頭將菌根搗碎，然后加入10^iL質量濃度為20c/。的化學整 合樹脂Chelex-lOO溶液，之后沸水浴5min、冰浴5min、 15000r/min離心5min， 取上清液，即得到黃檗叢枝菌根總DNA。
3、 根據權利要求1所述的一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法， 其特征在于步驟一中按修改后的Bead-Beating法提取黃檗根際土壤叢枝菌根 真菌總DNA。
全文摘要
一種黃檗叢枝菌根真菌菌群結構的分析方法，它涉及一種真菌菌群結構的分析方法。它解決了目前黃檗叢枝菌根真菌菌群結構分析方法分析結果波動大、準確性差的問題。分析步驟一、提取DNA；二、Nested-PCR；三、變性梯度凝膠電泳；四、采用DNA測序技術，即可分析出黃檗叢枝菌根真菌的菌群結構。本發明方法針叢枝菌根真菌遺傳保守區18S rDNA NS31/Glo1進行檢測分析，經過三次PCR擴增黃檗叢枝菌根真菌DNA的拷貝數高，可以獲得大量的目標產物叢枝菌真菌18S rDNA NS31/Glo1區片段，便于步驟三進行變性梯度凝膠電泳；因此本發明方法具有準確性高，重復性好，穩定性高的優點。
文檔編號C12Q1/68GK101333566SQ20081013684
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月30日 優先權日2008年7月30日
發明者接偉光, 雪 王, 葛菁萍, 蔡柏巖, 閻秀峰 申請人:黑龍江大學